彭 飛， 張文州， 陳琳琳， 林陽君， 莊月娥， 許 嶸

(泉州醫(yī)學高等專科學校 藥學院，福建 泉州 362011)

放線菌一直以來都是新天然產(chǎn)物的重要來源[1]。隨著抗生素藥物的廣泛使用，持續(xù)出現(xiàn)的感染性疾病以及抗生素耐藥性已成為威脅人類健康的醫(yī)學與社會問題[2]，超級耐藥菌的出現(xiàn)使得新型抗生素藥物的開發(fā)顯得尤為迫切，而從傳統(tǒng)鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)新骨架活性化合物的幾率越來越低，因此研究開發(fā)鏈霉菌以外的放線菌資源就顯得尤為重要[3]。稀有放線菌作為重要的微生物藥源具有巨大的開發(fā)潛力[4]，尤其是生活在極端環(huán)境中的稀有放線菌，特殊的生長環(huán)境決定了其具有產(chǎn)生特殊結(jié)構(gòu)代謝產(chǎn)物的能力[5]。野野村氏菌(Nonomuraeasp.)作為一類稀有放線菌，最早由Zhang等[6]于1998年命名, 屬于鏈孢囊菌科，包含34個種和2個亞種[7]。已有的研究表明，野野村氏菌是天然活性代謝產(chǎn)物的重要來源[7]。Derewacz等[8]從Nonomuraeaspecus的發(fā)酵浸膏中獲得4個新的由硫橋連接的萘醌二聚體衍生物Hypogeamicins A～D，細胞毒活性分析表明Hypogeamicins A具有較強的抗結(jié)腸癌細胞的活性。2019年，Khaled等[9]從陸生放線菌NonomuraeaendophyticaGW58/450的發(fā)酵液中分離得到3個具有萘酰胺噻唑環(huán)結(jié)構(gòu)的新化合物(Karamomycins A～C)，研究還表明，該類化合物具有較好的細胞毒活性。同年，Khomsan等[10]從沼澤土來源的NonomuraearhodomycinicaNR4-ASC07T的發(fā)酵提取物中獲得2個新化合物——Nonomuric acid 和3-hydroxy deoxydaunorubicinol aglycone，研究表明，前者還表現(xiàn)出較顯著的抗瘧活性，其半數(shù)致死濃度(IC50值)達到8.00 μg/mL。本研究在挖掘海洋稀有放線菌資源的過程中，通過基因篩選從臺灣海峽沉積物來源的100株海洋放線菌中獲得1株稀有放線菌FIM02-765[11]，報道了稀有放線菌FIM02-765的分類鑒定及其代謝產(chǎn)物Simaomicin α的抗腫瘤細胞分析，為后續(xù)的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和腫瘤細胞來源 稀有放線菌(Rare actinomycetes)FIM02-765來自臺灣海峽沉積物樣品，由泉州醫(yī)學高等?？茖W校微生物藥物課題組分離、保藏并提供。人食管癌細胞株(KYSE30、KYSE180和EC109)、人肝癌細胞株(SMMC7721)、人膀胱癌細胞株(5637)、人白血病細胞株(HeLa-60)和人胃癌細胞株(SGC7901)作為測試細胞，均購自中國科學院細胞庫(中國上海)。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①形態(tài)特征觀察采用ISP-2瓊脂培養(yǎng)基；②斜面培養(yǎng)基為高氏天冬素瓊脂培養(yǎng)基；③種子培養(yǎng)基：可溶性淀粉10 g，蛋白胨6 g，酵母提取物2 g，燕麥粉2 g，CaCO32 g，pH 7.5，1 000 mL自來水配制；④發(fā)酵培養(yǎng)基采用MS培養(yǎng)基：甘露醇20 g，黃豆餅粉20 g，K2HPO40.5 g，CaCO31 g，pH 7.5，1 000 mL自來水配制；⑤燕麥瓊脂培養(yǎng)基：燕麥片40 g，瓊脂15 g，pH 7.5，水1 000 mL，其他培養(yǎng)基見表1。

1.1.3 主要試劑 分析色譜柱(美國Welch，Ultimate XB-C18，5 mm×250 mm，5 μm)；葡聚糖凝膠Sephadex LH-20(美國Amersham)；大孔吸附樹脂Diaion HP-20 (日本三菱)；胎牛血清(北京元亨圣馬生物技術研究所)；順鉑(青島捷世康生物科技有限公司)；甲醇(色譜純，Merck)；其他試劑均為分析純。

1.1.4 主要儀器與設備 高效液相色譜儀(20A-DAD，日本島津公司)；PCR擴增儀(S1000，Bio-RAD公司)；電泳儀(6003EN，上海申能博彩生物科技有限公司)；TECAN Infinite M200 Pro酶標儀(瑞士TECAN集團公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(NuAir 8000，美國Nuaire公司)；倒置顯微鏡(Motic，北京汗盟紫星儀器儀表有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELA N-1100，日本東京理化)；Olympus顯微鏡(BX-41，日本Olympus公司)；掃描電鏡(JSM-6380LV，日本JEOL公司)。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)特征與培養(yǎng)特征 形態(tài)特征采用ISP-2瓊脂培養(yǎng)基，28 ℃插片培養(yǎng)，21 d后取片用Olympus顯微鏡和掃描電鏡觀察基內(nèi)菌絲、氣生菌絲、孢子和孢子絲的形態(tài)特征。掃描電鏡樣品制備采用Ismet等[12]的方法。培養(yǎng)特征采用Waksman等[13-14]、Shirling等[15]、Asano等[16]推薦的14種培養(yǎng)基，28 ℃分別培養(yǎng)7、14和21 d，觀察并記錄結(jié)果。顏色記錄采用ISCC-NBS顏色標準[17]。

1.2.2 生理生化特征 菌株的生長溫度、最適pH值以及NaCl耐受范圍實驗采用燕麥瓊脂培養(yǎng)基。碳源利用實驗采用不添加淀粉的ISP-9作為基礎培養(yǎng)基，分別加入1.85%各種碳源，28 ℃培養(yǎng)，觀察周期為1個月。明膠液化、牛奶凝固與胨化等生理生化指標的測定參考文獻[18]。

1.2.3 全細胞糖分組成分析 采用Toru等[19]和王平[20]的TLC方法進行全細胞水解液的糖分分析實驗。菌種于Bennett液體培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)4 d，離心收集菌體，并用蒸餾水洗滌2～3次，95%乙醇浸泡24 h。干燥后置入安瓿瓶中，加入0.1 mL 0.5 mol/L HCl,烘箱加熱至120 ℃，約15 min，用于糖分析的水解液以黃棕色為宜。用毛細管將0.8～2 μL水解液點樣薄層板，同時點樣1%鼠李糖、核糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的混合液0.2 μL作為標準對照。V甲醇∶V吡啶∶V冰乙酸∶V水=10∶1∶0.25∶5作為展開劑用于全細胞水解液DAP異構(gòu)體分析，V乙酸乙酯∶V吡啶∶V冰乙酸∶V水=8∶5∶1∶1.5作為展開劑用于全細胞水解液糖組分分析，之后置于層析缸中展層約3 h，依據(jù)層析圖譜確定菌種所含DAP及糖的種類。糖型分析采用苯胺鄰苯二甲酸試劑顯色法，105 ℃加熱5 min后直接觀察。

1.2.4 16S rRNA 序列測定與分析 采用劉志恒[21]的方法提取總DNA。采用通用引物(27f和1492r)[22]進行16S rRNA序列擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后由金唯智生物科技公司完成測序。序列經(jīng)BLAST比對，用軟件MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 菌株的發(fā)酵培養(yǎng)及代謝產(chǎn)物的分離純化 菌株FIM02-765的發(fā)酵培養(yǎng)采用彭飛等[11]的方法進行。Simaomicin α的提取過程[11]如下：菌株發(fā)酵液5 000 r/min離心15 min，上清液行Diaion HP-20大孔吸附樹脂，70%～90%甲醇水梯度洗脫，HPLC-DAD檢測，合并相同紫外吸收峰的餾分，減壓濃縮得棕色粗提物(700 mg)，餾分經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析，甲醇洗脫，合并相同組分后于4 ℃下析出淡黃色晶體(100 mg)，晶體溶于甲醇后再行Sephadex LH-20進行純化，得到單體化合物Simaomicin α(5.4 mg)。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)特征與培養(yǎng)特征

菌株FIM02-765在ISP-2培養(yǎng)基上插片培養(yǎng)，基內(nèi)菌絲深黃色，氣生菌絲淡黃色。菌株在ISP-2和ISP-4培養(yǎng)基上都可以產(chǎn)生豐富的氣生菌絲。孢子鏈呈鉤狀，含7～13個孢子，呈球形或圓柱形，孢子表面光滑，無孢子囊(圖1)。采用ISP-2、察氏瓊脂等14種培養(yǎng)基對菌株FIM02-765進行初步形態(tài)和培養(yǎng)特征觀察，培養(yǎng)特征見表1。結(jié)果表明，在14種培養(yǎng)基中，菌株FIM02-765均表現(xiàn)出生長跡象，其中在水瓊脂、燕麥瓊脂、察氏瓊脂和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中生長較弱。菌絲觀察結(jié)果表明，該菌的基內(nèi)菌絲多呈黃粉色或黃棕色，而氣生菌絲則多呈淡黃粉色。在所有的培養(yǎng)基中，菌株FIM02-765均未檢測到可溶性色素。上述結(jié)果表明菌株FIM02-765具有典型的野野村氏菌培養(yǎng)特征。

圖1 菌株FIM02-765的鉤狀孢子鏈形態(tài)Fig.1 Morphological characteristic of hooked spore chains of strain FIM02-765

2.2 生理生化指標

生理生化指標測定結(jié)果表明，菌株FIM02-765為需氧、革蘭陽性菌，其生長最適pH范圍為5.5～9.5，生長耐受溫度范圍為15～40 ℃。鹽耐受分析表明，該菌在含4% NaCl的燕麥培養(yǎng)基中沒有生長跡象。色素檢測表明該菌不產(chǎn)生黑色素。該菌對明膠的液化和牛奶的胨化不明顯；淀粉水解和硝酸鹽還原呈弱陽性。碳源利用情況見表2。

2.3 細胞壁化學組分分析

全細胞水解液糖分分析表明，菌株FIM02-765的細胞壁肽聚糖含有內(nèi)消旋的二氨基庚二酸 (DAP)，屬于胞壁III型。同時，在全細胞水解液中還檢測到馬杜拉糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖，糖型為B型。細胞壁類型和糖型均表現(xiàn)為典型的野野村氏菌特征[24-25]。

表1 菌株FIM02-765的培養(yǎng)特征

表2 菌株FIM02-765的碳源利用情況

2.4 16S rRNA 序列分析

菌株FIM02-765的16S rRNA基因序列全長1 449 bp(Accession number：KC568203)。基于該序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)的分析結(jié)果表明，該菌株與典型菌株Nonomuraeabangladeshensis5-10-10T

和Nonomuraeacoxensis5-38-42T處于一個相同的進化分支，且與N.bangladeshensis5-10-10T模式菌的相似度達到99.44%，菌株FIM02-765與其他相關的典型菌株也表現(xiàn)出較高相似度，與N.maheshkhaliensis16-5-14T的相似度為98.45%，與N.kuesteriGW 14-1925T的相似度為98.05%，與N.coxensis5-38-42T的相似度為95.92%。上述結(jié)果表明菌株FIM02-765屬于野野村氏菌 (Nonomuraeasp.)。

2.5 Simaomicin α的抗腫瘤活性分析

在前期的研究[11]中，本課題組從菌株FIM02-765中分離得到1個稠環(huán)氧雜蒽酮類化合物Simaomicin α(圖3)，并對該化合物的抗菌活性進行了報道。為了更深入地研究該化合物的生物學活性，本研究針對該化合物的抗腫瘤活性進行了分析(表3)。結(jié)果表明，Simaomicin α表現(xiàn)出較強的抑制腫瘤細胞增殖的能力，對人食管癌細胞株(KYSE180和EC109)、人肝癌細胞株(SMMC7721)、人膀胱癌細胞株(5637)、人白血病細胞株(HeLa-60)和人胃癌細胞株(SGC7901)的抑制活性都強于陽性對照藥物順鉑。

圖2 菌株FIM02-765與相關菌種構(gòu)建的基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Neighbour-joining tree based on nearly complete 16S rRNA gene sequences showing relationshipsbetween Nonomuraea sp. strain FIM 02-765 and all recognized species of the genus Nonomuraea

表3 Simaomicin α抑制腫瘤細胞增殖的活性

圖3 化合物Simaomicin α的化學結(jié)構(gòu)式Fig.3 Chemical structure of Simaomicin α

3 討 論

野野村氏菌(Nonomuraeasp.)屬于放線菌目(Actinobacterales)鏈孢囊菌亞目(Streptosporangineae)鏈孢囊菌科(Streptosporangiaceae)，該屬包括34個種和2個亞種[26]。絕大部分報道的野野村氏菌主要分離自水體、陸地環(huán)境的土壤和海底沉積物樣品[27]。最近的研究表明，海底沉積物樣品中存在一定數(shù)目的野野村氏菌[27-29]。本研究報道了1株臺灣海峽海底沉積物樣品來源的稀有放線菌FIM02-765，其形態(tài)和培養(yǎng)特征、生理生化特征和16S rRNA分析表明，該菌為野野村氏菌。同時，生理生化指標和全細胞水解分析進一步表明，菌株FIM02-765具有野野村氏菌典型的細胞壁III型和B型糖的特征[24-25]。許多研究表明，野野村氏菌是新天然產(chǎn)物的潛在來源，如Nonomuraeasp. 1808210CR 產(chǎn)生的β-咔啉衍生物nonocarbolines A～E[30]，研究表明化合物nonocarboline B對凍土毛霉(Mucorhiemalis)具有中等強度的抑制活性，而nonocarboline D則對人肺癌細胞A-549具有較強的抑制細胞增殖的活性，其IC50達到1.7 μmol/mL；N.endophyticaGW58/450產(chǎn)生特異的萘乙酰胺噻唑類化合物Karamomycins A～C[31]，研究還表明，Karamomycins A和C具有細胞毒活性。在前期的研究中，該菌產(chǎn)生的Simaomicin α具有較強的抗革蘭陽性菌活性[11]。為了更深入地研究該化合物的生物學活性，本研究還探討了Simaomicin α的抗腫瘤活性。結(jié)果表明，該化合物具有較強的抑制腫瘤細胞增殖的能力，其對人食管癌細胞株(KYSE180和EC109)、人肝癌細胞株(SMMC7721)、人膀胱癌細胞株(5637)、人白血病細胞株(HeLa-60)和人胃癌細胞株(SGC7901)的抑制活性都強于陽性對照藥物順鉑。本研究進一步明確了該菌的分類地位，拓展了該菌代謝產(chǎn)物Simaomicin α的生物學活性，從而為菌株的遺傳改良和開展Simaomicin α的生物合成研究提供參考。