李得鑫,李佳暖,李富言

（1.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 261000；2.山東富言禽病研究院 261100）

鴨坦布蘇病主要危害對象是蛋鴨，主要特點(diǎn)是蛋鴨產(chǎn)蛋下降[1]。目前快速診斷該病的方法有PCR、套式RT-PCR、熒光定量RT-PCR、RT-LAMP等方法。這些方法的優(yōu)點(diǎn)很明顯，檢測快速，敏感性更高，但是熒光定量PCR所需的儀器很昂貴，LAMP對環(huán)境要求很嚴(yán)格，容易形成氣溶膠。由于這些缺點(diǎn)，導(dǎo)致這些方法在臨床應(yīng)用時(shí)很受局限[2]。為了改善這種情況，本研究針對鴨坦布蘇E基因，建立了一種快速、靈敏、特異的納米PCR 檢測技術(shù)。

1 材料

1.1 病原

實(shí)驗(yàn)室分離的鴨坦布蘇病毒（DTMUV）、鴨病毒性肝炎（DHV）、鴨瘟（DPV）、鴨病毒性腸炎（DEV）毒株。

1.2 試劑

由全式金（北京生物科技有限公司）生產(chǎn)的Mark2K，Nano試劑盒。

2 方法

2.1 引物設(shè)計(jì)

以GeneBank：KC136210.1 E基因?yàn)槟０?，?yīng)用primer5軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增DTMUV的E基因的348bp目的片段的引物。引物由瑞普公司合成。

表1 引物信息

2.2 RNA的提取

250μL病毒與750uL Transzol混合，強(qiáng)烈振蕩5min，靜置5min；加250μL氯仿，劇烈振蕩1min，靜置5min，4℃，12000r/min, 15min離心；吸取上層液體600μL于EP管中，加等量異丙醇，混勻后，室溫靜置15min, 4℃, 12000r/min, 15min離心; 棄上清加900μL DEPC水酒精，4℃，12000r/min, 8min;棄上清，離心12000r/min, 3min; 利用移液槍槍吸取剩余上清液，超真空干燥；最后加上9.5μL溶解液。

反應(yīng)條件優(yōu)化 DTMUV最佳的納米PCR反應(yīng)體系為：2×Nano Buffer12.5μL，F(xiàn)1為0.5μL，R1為0.5μL，cDNA為1μL，ddH2O為10μL，Tap酶為0.5μL；最佳PCR反應(yīng)條件為94℃ 3min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 21s, 30個(gè)循環(huán)；72℃5min。

敏感性的檢測 模板濃度經(jīng)檢測為3.7ng/μL，為得到濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品，將模板用溶解液按10倍倍比稀釋溶解，分別利用納米PCR和普通PCR這兩種方法對稀釋后的模板進(jìn)行擴(kuò)增，比較二者的敏感性。

特異性的檢測 利用設(shè)計(jì)的引物對DTMUV、DHV、DPV、DEV進(jìn)行特異性檢測。

3 結(jié)果

3.1 從電泳圖1可以看出，DTMUV的348bp的目的片段被成功檢出。

圖1 DTMUV檢測結(jié)果

3.2 將電泳圖2進(jìn)行比較，Nano PCR的敏感度可達(dá)104，可檢測到最低濃度為3.7×10-4ng/μL，PCR的敏感度可達(dá)到103，可檢測到最低濃度為3.7×10-3ng/μL，由此可知，Nano PCR的敏感性是PCR的10倍。

圖2 Nano PCR 敏感性檢測結(jié)果

3.3 從電泳圖3可以看出，4個(gè)病毒株中，只有DTMUV檢出目的條帶，其他病毒均未檢出條帶，無交叉反應(yīng)。

圖3 DTMUV特異性檢測結(jié)果

4 討論

鴨坦布蘇最先是在2010年4月份我國南方部分地區(qū)發(fā)現(xiàn)，不僅感染種鴨，還感染各種蛋鴨，是一種新興的傳染病[3]。主要的臨床特點(diǎn)是體溫居高不下，蛋鴨的產(chǎn)蛋量急劇下降[4]。剖檢后可見病死鴨肝臟有白色點(diǎn)狀出血，伴隨腫大，卵泡膜充血、出血，卵泡變性等病理變化[5]。群內(nèi)發(fā)病率幾乎100%，病死率不是太高，約為0%～28%不等[6]。該病引起的產(chǎn)蛋急劇下降這種危害給蛋鴨養(yǎng)殖戶造成的損失嚴(yán)重，給養(yǎng)殖業(yè)也造成很大的影響。因此，建立一種快速、靈敏的檢測技術(shù)，為更好的防控該病刻不容緩[7]。

在臨床應(yīng)用中，各種不同的檢測方法有不同的優(yōu)缺點(diǎn)，較為常用的是普通PCR，但其敏感性不顯著，效果不明顯；LAMP缺點(diǎn)是對環(huán)境要求很苛刻，容易形成氣溶膠，熒光定量PCR雖然較為精準(zhǔn)，但需要精密昂貴的儀器并且操作程序復(fù)雜[8]。本研究首次針對DTMUV 的E基因建立了一種納米檢測 PCR 技術(shù)，這種方法可以快速、敏感、特異的對DTUMV 進(jìn)行檢測。納米PCR是一種新型的 PCR 技術(shù)，集各種優(yōu)點(diǎn)于一身，相比較普通PCR更加敏感，比熒光定量PCR更加方便快捷[9]。納米PCR的快速、靈敏、特異主要取決于納米PCR緩沖液中的粒徑為1nm-100nm的納米金屬顆粒，這種顆?？蓱腋∮谝后w中，構(gòu)成納米流體。納米流體的導(dǎo)熱性能更好，可以明顯提高反應(yīng)體系的溫度變化速度，所以能更快達(dá)到目標(biāo)溫度，減少反應(yīng)體系在非目標(biāo)溫度的停留時(shí)間。同時(shí)，特異性反應(yīng)時(shí)間增加，因而最終達(dá)到消除非特異性擴(kuò)增，提高擴(kuò)增效率和敏感性的目的[10-13]。本研究首次針對DTMUV 的E基因建立了一種納米檢測 PCR 技術(shù)，這種方法可以快速、敏感、特異的對DTUMV 進(jìn)行檢測。

5 結(jié)論

本研究表明納米PCR的最小檢出量為3.7×10-4，PCR的最小檢出量為3.7×10-3， DTMUV的敏感性試驗(yàn)證明納米PCR方法的敏感性是普通PCR的10倍。該DTMUV納米PCR這種檢測方法敏感性更高，特異性更強(qiáng)，是一種高效的檢測手段，可以應(yīng)用于流行病學(xué)調(diào)查，同時(shí)也為 DTMUV的及時(shí)檢測、預(yù)防和治療奠定基礎(chǔ)。