張美晨，陶 飛，白慧麗，李常挺，曾 蕓

（廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 530004 ）

蛇敗血癥的主要致病菌包括肺炎克雷伯菌、腸道沙門氏菌、枸櫞酸桿菌和鮑曼不動桿菌，正常情況下，糞腸球菌在蛇的消化道內(nèi)其菌群維持在一定的平衡狀態(tài)，通常是不會引起發(fā)病的[1]，但是當(dāng)蛇由于病毒或細(xì)菌感染引起免疫功能下降時(shí)，糞腸球菌就會成為條件性致病菌，也會感染蛇，引起蛇發(fā)病[2]。細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，通常是由于產(chǎn)生滅活藥物的酶類、改變藥物作用的靶位或降低細(xì)胞膜的通透性等[3]。在長期使用抗菌藥物的狀態(tài)下，致病菌主要是由于基因突變或細(xì)菌間耐藥基因的轉(zhuǎn)移產(chǎn)生耐藥性[4]，而后者是目前致病菌產(chǎn)生耐藥性的最重要因素[5]。目前，蛇源性致病細(xì)菌的研究較少，其耐藥情況尚不明確。從廣西各地的蛇敗血癥病例中分離獲得的細(xì)菌呈現(xiàn)不同程度的耐藥，本文通過體外抑菌試驗(yàn)結(jié)合耐藥基因檢測，了解并掌握引起蛇發(fā)生敗血癥的細(xì)菌及其耐藥性情況，觀察蛇類中是否已出現(xiàn)“多重耐藥性細(xì)菌”[6]，為細(xì)菌感染的合理防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌來源

2016年7月到2017年7月，廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室從廣西各地蛇場送檢的蛇敗血癥病例中分離純化出7種23株細(xì)菌，分別編號為A、B、C、D、E、F、G，如表1。

表1 細(xì)菌種類

1.2 體外抑菌試驗(yàn)

將細(xì)菌分別接種于適宜的培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，用細(xì)菌間接計(jì)數(shù)的麥?zhǔn)媳葷岱ㄅ渲凭鷳乙簼舛葹?×109cfu/mL，采用紙片法進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)[7]，每株細(xì)菌每個(gè)藥物做三個(gè)平行，按照臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(CLSI)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定，抑菌圈直徑(Φ)＜10 mm為不敏感，即耐藥(R)，10 mm≤Φ＜15 mm為低敏或不敏感，即中敏(I)，Φ≥15 mm為敏感(S)。

1.3 耐藥基因檢測

根據(jù)體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果，總結(jié)出分離得到的細(xì)菌對常用抗菌藥物所耐受的種類，并根據(jù)各類藥物及各種細(xì)菌的常檢耐藥基因，篩選出最終所用的耐藥基因，并設(shè)計(jì)相關(guān)引物，具體引物名稱、序列及退火程序見表2，引物由廣州金唯智生物科技有限公司合成。將同種細(xì)菌分為一組，每組根據(jù)對應(yīng)的耐藥基因的PCR反應(yīng)條件分別進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(50 μL):2×TaqMaster Mix(Dye)，25μL；ddH2O，17μL；上、下游引物(10μmol/L)各2μL；DNA模板，4μL。PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行凝膠電泳(120v 100mA，25min)并觀察擴(kuò)增結(jié)果。

表2 耐藥基因檢測所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

7種23株細(xì)菌的體外抑菌結(jié)果如表3所示。按藥物分類分別對這7種細(xì)菌進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果為不同細(xì)菌對β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類和大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥性差異極顯著P＜0.01（α=0.05），而對四環(huán)素類和喹諾酮類藥物的耐藥性沒有顯著差異。

表3 7種23株細(xì)菌的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果(單位：mm)

表中同種細(xì)菌不同株的相同藥物的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果取平均值。

2.2 耐藥基因檢測結(jié)果

通過電泳凝膠成像儀得到各產(chǎn)物的電泳圖像（圖1），由圖可知A組中5株來源不同的肺炎克雷伯菌中A1、A3、A5這三株菌檢測到耐氨基糖苷類藥物的耐藥基因aac(3)-Ⅱ，這與2.1中肺炎克雷伯菌對氨基糖苷類抗生素中的慶大霉素和鏈霉素表現(xiàn)為耐藥相符合。C組中8株來源不同的糞腸球菌，只有C2、C5兩株菌檢測到erm(B)耐大環(huán)內(nèi)酯類藥物的目的基因，這與上述糞腸球菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素中的紅霉素和泰樂菌素表現(xiàn)為耐藥相符合。D組中2株來源不同的腸道沙門氏菌中D1株檢測到SUL1耐磺胺類藥物的目的基因，這與上述藥敏試驗(yàn)結(jié)果不符合，但仍能表示該株菌含有耐藥基因。其余細(xì)菌均未檢測到相應(yīng)的耐藥基因。

圖1 耐藥基因PCR反應(yīng)結(jié)果

3 討論

廣西各地送檢的蛇敗血癥病例共19例，且送檢前的用藥情況不同，其中部分用過多西環(huán)素和土霉素，部分用過阿莫西林和恩諾沙星，其余的還用過氟苯尼考進(jìn)行治療，但療效均不佳。經(jīng)過剖檢及細(xì)菌分離，從病例中共分離獲得7種23株細(xì)菌，即8株糞腸球菌、5株肺炎克雷伯菌、3株鮑曼不動桿菌、3株普羅威登斯菌、2株腸道沙門氏菌、1株枸櫞酸桿菌、1株摩氏摩根菌。從體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果來看，肺炎克雷伯菌對氨基糖苷類抗生素耐藥，糞腸球菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥，普羅威登斯菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，腸道沙門氏菌對恩諾沙星耐藥，枸櫞酸桿菌對頭孢拉啶耐藥，摩氏摩根菌對青霉素和頭孢拉啶耐藥，不同細(xì)菌對不同抗菌藥的耐藥趨向表現(xiàn)無規(guī)律，但有普遍發(fā)展的趨勢[8]。

從耐藥基因檢測結(jié)果來看，檢測到的耐藥基因有一定的代表性。糞腸球菌易對大環(huán)內(nèi)酯類藥物產(chǎn)生耐藥性[9]，其中對紅霉素的耐藥性最為嚴(yán)重，一般采用檢測與紅霉素相關(guān)的甲基化酶基因erm(A)、erm(B)、erm(C)來斷定耐藥機(jī)制，通常erm(B)基因的陽性檢出率最高。本次試驗(yàn)所用到的8株糞腸球菌，其耐藥基因erm(B)的陽性檢出率為25%(2/8)，這與黃震等人關(guān)于糞腸球菌對泰利霉素藥物敏感性與耐藥基因erm的分布[10]的研究不符，可能是由于樣本數(shù)量過少。細(xì)菌對氨基糖苷類藥物產(chǎn)生耐藥性，通常是由于其產(chǎn)生了氨基糖苷類鈍化酶，而這類酶又分為磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)、核苷轉(zhuǎn)移酶(ANT)和乙酰轉(zhuǎn)移酶(AAC)[11]。其中在耐氨基糖苷類藥物的細(xì)菌中，最易檢出AAC，而在耐氨基糖苷類藥物的肺炎克雷伯菌中，最易檢出的耐藥基因?yàn)閍ac(3)-Ⅱ[12]。本次試驗(yàn)所用到的5株肺炎克雷伯菌，其耐藥基因aac(3)-Ⅱ的陽性檢出率為60%(3/5)，具有一定的代表性?；前奉愃幬锏哪退幓驒z測通常包括SUL1、SUL2和SUL3[13]，而本次試驗(yàn)所用到的2株腸道沙門氏菌則進(jìn)行了SUL1耐藥基因的檢測，其陽性檢出率為50%(1/2)，說明該耐藥基因已在蛇源性細(xì)菌中存在，但與上述體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果不符合，可能是由于菌株數(shù)量過少，所以不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[14]。其余耐藥基因的檢出率為0，可能是蛇源性細(xì)菌還未攜帶或產(chǎn)生該基因，或者是本次試驗(yàn)中分離到的菌株數(shù)量過少所致。但本試驗(yàn)仍能體現(xiàn)出抗菌藥物的濫用，導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥基因的普遍性。