尚紅巖，郭藝山，鄧毛程*，李 靜，張遠(yuǎn)平，吳亞麗，鄭子鑫，殷德運(yùn)，梁彭生，繆秉潮，林群珊，楊鳳婷，孔銀瑩

(1廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物技術(shù)學(xué)院，廣東廣州510300；2廣東省科學(xué)院生物與醫(yī)學(xué)工程研究所，廣東廣州510316)

0 前言

由于糖蜜富含可發(fā)酵性糖和營(yíng)養(yǎng)素，是培養(yǎng)酵母和發(fā)酵酒精的優(yōu)良原料，但糖蜜儲(chǔ)運(yùn)過程很難無菌操作，不可避免有雜菌滋生。糖蜜酒精生產(chǎn)通常需要添加硫酸抑制雜菌，使用硫酸抑菌不僅容易造成設(shè)備腐蝕和積垢，廢液中的硫酸根離子還會(huì)污染環(huán)境，增加酒精廢液處理難度[1-2]。20世紀(jì)90年代，國(guó)內(nèi)開始糖蜜酒精無酸發(fā)酵技術(shù)研究，傳統(tǒng)無酸發(fā)酵技術(shù)主要是通過高溫滅菌和添加抗生素代替硫酸抑制雜菌，由于高溫滅菌能耗大，且容易造成糖蜜焦糖化；而抗生素等殺菌劑滅菌會(huì)產(chǎn)生耐藥性[3-6]。進(jìn)入21世紀(jì)，利用復(fù)合酶制劑替代硫酸抑菌的無酸發(fā)酵新工藝，成為研究熱點(diǎn)，由于酶制劑是環(huán)境友好型的生物制劑，該技術(shù)成為糖蜜酒精生產(chǎn)技術(shù)發(fā)展的趨勢(shì)[7-9]。本文以復(fù)合蛋白酶加入糖蜜中抑菌，對(duì)比傳統(tǒng)硫酸酸化糖蜜抑菌，進(jìn)行酵母培養(yǎng)和連續(xù)發(fā)酵酒精研究，以發(fā)酵醪液含酒分(酒精含量)和殘還原糖判斷發(fā)酵產(chǎn)酒率，以細(xì)菌代謝產(chǎn)生的揮發(fā)酸衡量雜菌感染程度。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

復(fù)合蛋白酶(蛋白酶類、淀粉酶和果膠酶等)，廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物技術(shù)學(xué)院配制；酵母菌種：高活性糖蜜酒精干酵母(廣東省科學(xué)院生物與醫(yī)學(xué)工程研究所)；甘蔗糖蜜(廣西鳳糖生化股份有限公司)；青霉素(廣州藍(lán)華江獸藥有限公司)；尿素、濃硫酸、過磷酸鈣、硫酸銨、鹽酸、氫氧化鈉、中性醋酸鉛溶液、磷酸鹽草酸鹽混合溶液(脫鉛劑)、裴林氏甲乙溶液、1%次甲基藍(lán)示溶液、0.1%酚酞指示液、10%稀硫酸(廣州化學(xué)試劑廠)。

1.2 儀器設(shè)備

酒度計(jì)(0～30)，上海精密儀器廠；電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；自制5級(jí)連續(xù)玻璃柱反應(yīng)器(1 L)，益賢機(jī)械設(shè)備有限公司；蠕動(dòng)泵(L100-1E)，蘭格恒流泵有限公司。三角瓶500 mL、容量瓶250 mL、量筒5000 mL、蒸餾燒瓶250 mL、冷凝蛇管、電爐2500 W、溫度計(jì)、錘度計(jì)、恒溫培養(yǎng)箱、水浴鍋、顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板。

2 試驗(yàn)方法

2.1 糖蜜培養(yǎng)液和發(fā)酵液制備

添加復(fù)合蛋白酶糖蜜培養(yǎng)液(以下簡(jiǎn)稱“復(fù)合蛋白酶糖蜜”)：糖蜜用自來水稀釋至18oBx濃度，添加0.3%的硫酸銨，添加復(fù)合蛋白酶30 g/t糖蜜。

硫酸酸化糖蜜培養(yǎng)液(以下簡(jiǎn)稱“糖蜜酸化液”)：糖蜜用自來水稀釋至18oBx濃度，添加0.3%的硫酸銨，用濃硫酸調(diào)節(jié)至pH 3.8。

發(fā)酵糖液：原糖蜜加自來水稀釋濃度45oBx。

2.2 發(fā)酵方法

2.2.1 復(fù)合蛋白酶糖蜜酵母培養(yǎng)及連續(xù)發(fā)酵

采用雙濃度雙流加連續(xù)發(fā)酵工藝，1#號(hào)反應(yīng)器加入糖蜜復(fù)合蛋白酶培養(yǎng)液300 mL，接種活性干酵母0.5%，進(jìn)行酵母活化起種，當(dāng)培養(yǎng)液酵母數(shù)達(dá)到1.5億/mL時(shí)，開始通過蠕動(dòng)泵連續(xù)流加糖蜜復(fù)合蛋白酶培養(yǎng)液，流加速率1.2～1.4 mL/min，約12～14 h加滿1#號(hào)反應(yīng)器，反應(yīng)器培養(yǎng)液錘度控制在9～10oBx，發(fā)酵溫度控制為30～31℃；1#號(hào)反應(yīng)器液位滿至過料管時(shí)，經(jīng)過料管流入2#號(hào)反應(yīng)器內(nèi)，即可開始通過蠕動(dòng)泵連續(xù)流加發(fā)酵液進(jìn)入2#號(hào)反應(yīng)器，流加速率2.4～2.8 mL/min，約6～8 h左右加滿2#號(hào)反應(yīng)器，反應(yīng)器發(fā)酵液錘度控制在17～19°Bx，發(fā)酵溫度控制為31～33℃。當(dāng)2#號(hào)反應(yīng)器加滿后，發(fā)酵液經(jīng)過料管進(jìn)入3#號(hào)反應(yīng)器。3#號(hào)反應(yīng)器加滿后依次連續(xù)流入下一級(jí)反應(yīng)器，直至加滿5#號(hào)反應(yīng)器。連續(xù)發(fā)酵5天，每天從1#號(hào)和5#號(hào)反應(yīng)器分別取樣2次，分析發(fā)酵液的酒分、揮發(fā)酸和5#號(hào)反應(yīng)器發(fā)酵液殘還原糖。

2.2.2 糖蜜酸化液培養(yǎng)酵母及連續(xù)發(fā)酵

采用雙濃度雙流加連續(xù)發(fā)酵工藝，1#號(hào)反應(yīng)器加入糖蜜酸化培養(yǎng)液300 mL，接種活性干酵母0.5%，進(jìn)行酵母活化起種，當(dāng)培養(yǎng)液酵母數(shù)達(dá)到1.5億/mL時(shí)，開始通過蠕動(dòng)泵連續(xù)流加糖蜜酸化培養(yǎng)液，流加速率1.2～1.4 mL/min，約12～14 h加滿1#號(hào)反應(yīng)器，發(fā)酵溫度控制為30～31℃；1#號(hào)反應(yīng)器液位滿至過料管時(shí)，經(jīng)過料管流入2#號(hào)反應(yīng)器內(nèi)，即可開始通過蠕動(dòng)泵連續(xù)流加發(fā)酵培養(yǎng)液進(jìn)入2#號(hào)反應(yīng)器，其他操作步驟同2.2.1。連續(xù)發(fā)酵5天，每天從1#號(hào)和5#號(hào)反應(yīng)器分別取樣2次，分析發(fā)酵液的酒分、揮發(fā)酸和5#號(hào)反應(yīng)器發(fā)酵液殘還原糖。

2.3 分析方法

⑴發(fā)酵酒精濃度：采用蒸餾-酒度計(jì)法。量筒量取100 mL發(fā)酵液，放入蒸餾燒瓶?jī)?nèi)，用100 mL蒸餾水沖洗量筒，也放入蒸餾燒瓶?jī)?nèi)，蒸餾并收集餾出液100 mL，用酒度計(jì)測(cè)定餾出液酒精濃度[10]。

⑵酵母菌數(shù)量：用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定酵母培養(yǎng)液和發(fā)酵液中的酵母菌數(shù)量[10]。酵母液用蒸餾水稀釋10倍，搖勻后滴一滴到血球計(jì)數(shù)板，放置在顯微鏡下計(jì)數(shù)。

⑶發(fā)酵液殘?zhí)欠郑河锰m因-艾農(nóng)(Lane-Eynon)恒容法[10]測(cè)定發(fā)酵液殘?zhí)欠?殘還原物)。發(fā)酵液經(jīng)過濾除雜后做成檢液，滴定裴林氏甲乙液，記錄滴定的毫升數(shù)并計(jì)算。

⑷揮發(fā)酸：用堿液滴定法測(cè)定發(fā)酵蒸餾酒液的揮發(fā)酸[10]。取酒精餾出液50 mL，加入0.1%酚酞指示劑2滴，用0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液呈微紅色在30 s內(nèi)不消失為止，記錄消耗NaOH溶液的毫升數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 添加復(fù)合蛋白酶糖蜜發(fā)酵液結(jié)果

添加復(fù)合蛋白酶糖蜜連續(xù)發(fā)酵1#號(hào)和5#號(hào)反應(yīng)器，每天取樣測(cè)定發(fā)酵液酒分、揮發(fā)酸和成熟醪液殘還原糖，分析結(jié)果見表1和表2。由于發(fā)酵液連續(xù)流加到5#號(hào)反應(yīng)器需要30 h以上，第2天才能取到5#號(hào)反應(yīng)器發(fā)酵液分析樣品，5#號(hào)反應(yīng)器從第2～6天取樣測(cè)定發(fā)酵液酒分、揮發(fā)酸和殘還原糖。

表2 添加復(fù)合蛋白酶糖蜜發(fā)酵5#號(hào)反應(yīng)器發(fā)酵數(shù)據(jù)

3.2 酸化糖蜜發(fā)酵結(jié)果

酸化糖蜜連續(xù)發(fā)酵酒精1#號(hào)和5#號(hào)反應(yīng)器，發(fā)酵液酒分、揮發(fā)酸和殘還原糖等結(jié)果見表3和表4。

表3 酸化糖蜜發(fā)酵1#號(hào)反應(yīng)器發(fā)酵數(shù)據(jù)

表4 酸化糖蜜發(fā)酵5#號(hào)反應(yīng)器發(fā)酵數(shù)據(jù)

3.3 分析與討論

3.3.1 1#號(hào)反應(yīng)器結(jié)果分析

⑴酒分

1#號(hào)反應(yīng)器采用添加復(fù)合蛋白酶糖蜜和硫酸酸化糖蜜培養(yǎng)酵母，發(fā)酵含酒分對(duì)比見表1、表3和圖1，從圖表中可以看出，添加復(fù)合蛋白酶的糖蜜發(fā)酵含酒分從第2天開始在6.0%以上，到第5天升高至6.50%以上，明顯高于酸化糖蜜最高發(fā)酵酒分6.2%左右。原因是復(fù)合蛋白酶抑菌的同時(shí)，還可將糖蜜中的蛋白質(zhì)和多糖水解為酵母可以利用的物質(zhì)，提高了發(fā)酵含酒分。

圖1 1#號(hào)反應(yīng)器發(fā)酵含酒分對(duì)比

⑵揮發(fā)酸

揮發(fā)酸是產(chǎn)酸細(xì)菌代謝產(chǎn)物，感染細(xì)菌越多揮發(fā)酸越高。從表1和表3數(shù)據(jù)可得出2種抑菌糖蜜培養(yǎng)酵母揮發(fā)酸變化趨勢(shì)，如圖2所示。從圖中可以看出，添加復(fù)合蛋白酶的糖蜜發(fā)酵液揮發(fā)酸最高至0.113 g/L，明顯低于酸化糖蜜發(fā)酵液揮發(fā)酸含量，說明復(fù)合蛋白酶抑菌效果好于硫酸酸化。

圖2 1#號(hào)反應(yīng)器發(fā)酵揮發(fā)酸對(duì)比

3.3.2 5#號(hào)反應(yīng)器結(jié)果分析

采用添加復(fù)合蛋白酶糖蜜和硫酸酸化糖蜜培養(yǎng)酵母，流加發(fā)酵糖液連續(xù)發(fā)酵，到5#號(hào)反應(yīng)器發(fā)酵基本完全。從表2可以看出添加復(fù)合蛋白酶糖蜜成熟醪含酒分可達(dá)到12%左右，殘還原糖1.7%以下， 揮發(fā)酸0.159 g/L以下，明顯優(yōu)于硫酸酸化糖蜜的發(fā)酵酒分、殘還原糖和揮發(fā)酸含量。具體分析如下：

⑴酒分

從表2和表4復(fù)合蛋白酶和酸化2種抑菌糖蜜發(fā)酵數(shù)據(jù)，得出5#號(hào)反應(yīng)器發(fā)酵含酒分對(duì)比圖，如圖3所示。從圖中可以看出，添加復(fù)合蛋白酶的糖蜜經(jīng)過5天連續(xù)發(fā)酵，發(fā)酵成熟醪含酒分可以穩(wěn)定在12%左右，明顯高于酸化糖蜜發(fā)酵含酒分11.2%左右。一方面因?yàn)閺?fù)合蛋白酶抑制雜菌，使酵母能將糖蜜中可發(fā)酵性糖發(fā)酵完全；另一方面復(fù)合蛋白酶還可將糖蜜中的蛋白質(zhì)和多糖水解為酵母營(yíng)養(yǎng)物和可發(fā)酵性糖，提高了發(fā)酵含酒分。

圖3 5#號(hào)反應(yīng)器發(fā)酵含酒分對(duì)比

⑵殘還原糖

從表2、表4和圖4可以看出，添加復(fù)合蛋白酶的糖蜜經(jīng)過5天連續(xù)發(fā)酵，發(fā)酵成熟醪殘還原糖可以控制在1.7%以內(nèi)，而酸化糖蜜發(fā)酵殘還原糖只能控制在2.1%以內(nèi)。原因是復(fù)合蛋白酶可將糖蜜中的多糖水解為可發(fā)酵性糖，酵母將可發(fā)酵性糖發(fā)酵完全；而硫酸酸化無法分解糖蜜中的多糖，殘還原糖相對(duì)偏高。

圖4 5#號(hào)反應(yīng)器發(fā)酵成熟醪殘還原糖對(duì)比

⑶揮發(fā)酸

從表2、表4和圖5可以看出，添加復(fù)合蛋白酶的糖蜜經(jīng)過5天連續(xù)發(fā)酵，發(fā)酵成熟醪液揮發(fā)酸控制在0.159 g/L以下，明顯低于酸化糖蜜發(fā)酵揮發(fā)酸含量，復(fù)合蛋白酶抑制雜菌效果優(yōu)于硫酸酸化。

圖5 5#號(hào)反應(yīng)器發(fā)酵成熟醪殘揮發(fā)酸對(duì)比

4 結(jié)論

以添加復(fù)合蛋白酶的糖蜜進(jìn)行連續(xù)酵母培養(yǎng)和發(fā)酵酒精研究，經(jīng)過5天連續(xù)發(fā)酵，1#號(hào)反應(yīng)器酵母培養(yǎng)液含酒分為6.50%以上，5#號(hào)反應(yīng)器發(fā)酵成熟醪含酒分可達(dá)到12%左右，殘還原糖1.7%以下，揮發(fā)酸0.159 g/L以下，都明顯優(yōu)于傳統(tǒng)硫酸酸化糖蜜的發(fā)酵酒分、殘還原糖和揮發(fā)酸含量。復(fù)合蛋白酶一方面能夠抑制雜菌，使酵母充分繁殖并獲得對(duì)雜菌的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，使揮發(fā)酸降低，并將糖蜜中糖分發(fā)酵完全；另一方面復(fù)合蛋白酶還可將糖蜜中的蛋白質(zhì)和多糖水解為氨基酸等酵母營(yíng)養(yǎng)物和可發(fā)酵性糖，提高酵母發(fā)酵活性，可明顯提高發(fā)酵含酒分，并減少發(fā)酵成熟醪殘還原糖的含量[11-12]。以復(fù)合蛋白酶代替硫酸的糖蜜無酸發(fā)酵酒精技術(shù)可以獲得更高的發(fā)酵產(chǎn)酒率。