李秋菊，王丹輝，沈青春，高玉龍

（1.松原職業(yè)技術(shù)學(xué)院，吉林 松原 138000；2.前郭縣動物疫病預(yù)防控制中心，吉林 松原 138000；3.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；4.吉林和元生物工程股份有限公司，吉林 松原 138000）

豬支原體肺炎 （Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS）是由豬肺炎支原體 （Mycoplasma hyopne umoniae，Mhp）引起的一種慢性、接觸性呼吸道傳染病，臨床上有獨(dú)特的咳嗽和喘氣癥狀，又稱豬喘氣病或豬氣喘病[1]，該病分布十分廣泛，世界各地均有發(fā)生，也被認(rèn)為是危害各國養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病之一[2]。該病發(fā)病率高，發(fā)病慢且長，以冬春寒冷季節(jié)多發(fā)。發(fā)病豬表現(xiàn)為流涕，咳嗽，氣喘。死亡率雖不高但豬肺炎支原體也能夠?qū)е掠商囟ú《拘圆≡ㄘi繁殖與呼吸綜合征和豬圓環(huán)2型病毒感染所引發(fā)的疾病[3]。

近年來，美國每年該病的疫苗產(chǎn)量一直占據(jù)榜首，主要為滅活疫苗，而我國多年來主要以研究活疫苗為主，近年也開始了滅活疫苗的研制工作。豬支原體肺炎滅活疫苗是最新研發(fā)用于預(yù)防豬支原體肺炎的滅活疫苗。該疫苗采用了田間分離的野毒菌株，免疫原性好。通過使用不同劑量的疫苗免疫健康仔豬，評價(jià)其攻毒保護(hù)力，確定其最小免疫劑量。本試驗(yàn)結(jié)果對該疫苗的臨床使用有著重要的參考意義，同時(shí)也為進(jìn)一步探明免疫保護(hù)率與替代動物抗體水平的相關(guān)研究提供技術(shù)數(shù)據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)疫苗

豬支原體肺炎滅活疫苗 （S株）， 批號為202103，滅活菌滴度為 2.18×108CCU50/mL，規(guī)格為 20 mL/瓶。

1.2 攻毒菌種

豬肺炎支原體濟(jì)南株組織毒，批號為202101，1 mL/支。

1.3 試驗(yàn)豬

7～14日齡健康仔豬，共45頭，仔豬均一性好，淘汰同窩中弱小仔豬，未免疫豬肺炎支原體疫苗；豬肺炎支原體抗體呈陰性，豬瘟、藍(lán)耳病和偽狂犬抗體均呈陰性。

1.4 試劑

豬肺炎支原體抗體ELISA檢測試劑盒，購自美國IDEXX公司，2～8℃保存。豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸道綜合征病毒通用型RT-PCR檢測試劑盒、豬偽狂犬病毒PCR檢測試劑盒，均購自北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司，-15℃保存。

1.5 其他

無抗飼料購自北京科奧協(xié)力飼料有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 試驗(yàn)豬的篩選

篩選豬肺炎支原體抗體檢測應(yīng)為陰性，豬瘟、豬藍(lán)耳病和偽狂犬抗原應(yīng)為陰性，7～14日健康仔豬共25頭，前期與母豬一同飼養(yǎng)。

2.2 免疫前的準(zhǔn)備及分組免疫

對每頭仔豬打耳標(biāo)、稱重，分別使用2 mL(1～5號豬)、1 mL（6～10 號豬）、0.5 mL（11～15 號豬）和 0.25 mL（16～20號豬）劑量，每組5頭仔豬，兩次免疫分別在兩側(cè)頸部肌肉注射，同時(shí)設(shè)5頭不免疫對照組（21～25號豬），另外2 mL劑量組多免疫兩頭，為后續(xù)組織切片所用。

2.3 攻毒試驗(yàn)

首免后28日，連同對照組5頭仔豬各氣管內(nèi)接種1:100倍稀釋的豬肺炎支原體濟(jì)南株組織毒10 mL（約含肺組織0.01 g）。連續(xù)觀察28日后剖檢，觀察記錄肺臟病變情況。

2.4 觀測項(xiàng)目

2.4.1 體溫測定。分別于免疫前和免疫后對所有仔豬進(jìn)行體溫測量，每天1次，持續(xù)7 d。

2.4.2 每日觀察注射部位情況，注射2 mL的試驗(yàn)仔豬分別于二免后第7 d和第14 d各宰殺一頭，取注射部位的肌肉組織經(jīng)10%福爾馬林固定，酒精脫水，石蠟包埋，切片，HE染色等，顯微鏡下觀察，并進(jìn)行組織病理學(xué)評價(jià)。

2.4.3 稱重。于免疫、攻毒當(dāng)日和試驗(yàn)結(jié)束日對所有仔豬進(jìn)行稱重。

2.4.4 肺臟病變評價(jià)及計(jì)算。按照規(guī)程附注5的評分標(biāo)準(zhǔn)對豬肺臟進(jìn)行逐個(gè)評價(jià)，左、右心葉出現(xiàn)100%病變各記1分，左、右尖葉出現(xiàn)100%病變各記1分，左、右膈葉出現(xiàn)100%病變各記0.5分，中間葉出現(xiàn)l00%病變記0.5分，病變總分為5.5分。根據(jù)肺臟出現(xiàn)病變的輕重程度加減分值。同一個(gè)肺葉的正反兩面病變面積不一致時(shí)，取平均面積。如圖1中感染豬支原體肺炎的豬肺臟評分，左心葉病變70%，計(jì)0.7分；右心葉病變50%，計(jì)0.5分：左尖葉病變80%，計(jì)0.8分；右尖葉病變60%，計(jì)0.6分；左膈葉病變20%，計(jì)0.1分，右膈葉病變20%，計(jì)0.1分；中間葉病變40%，計(jì)0.2分，則病變總分=左心葉+右心葉+左尖葉+右尖葉+左膈葉+右膈葉+中間葉=0.7+0.5+0.8+0.6+0.1+0.1+0.2=3.0。

圖1 豬支原體肺炎的肺臟病變圖

保護(hù)率計(jì)算公式如下：

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 體溫變化情況記錄結(jié)果

免疫前1天和當(dāng)天（免疫前），體溫測定結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同劑量豬支原體肺炎滅活疫苗（S株）首免后仔豬體溫測定結(jié)果

以上結(jié)果顯示，健康仔豬免疫后體溫正常，疫苗免疫劑量與體溫變化關(guān)系不明顯。

二免前1天和當(dāng)天，對各個(gè)滴度免疫組的試驗(yàn)豬進(jìn)行體溫測定，測定結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同劑量豬支原體肺炎滅活疫苗(S株)二免后體溫測定結(jié)果

以上結(jié)果顯示，健康仔豬在免疫后體溫正常，疫苗免疫劑量與體溫變化關(guān)系不明顯。

3.2 注射部位的不良反應(yīng)記錄結(jié)果

使用4種不同劑量的豬支原體肺炎滅活疫苗的注射部位是否有不良反應(yīng)或變化，結(jié)果見表1。對注射2 mL劑量組仔豬注射部位的肌肉組織進(jìn)行切片觀察，結(jié)果見圖4。

圖4 支原體肺炎滅活疫苗2 mL劑量免疫組仔豬注射部位病理組織切片結(jié)果

表1 不同劑量豬支原體肺炎滅活疫苗免疫仔豬后7日內(nèi)注射部位反應(yīng)情況觀察表

以上結(jié)果表明，2 mL試驗(yàn)組有1頭仔豬，首免和二次免疫后1天注射部位出現(xiàn)稍稍發(fā)紅，第2天癥狀完全消失，恢復(fù)正常，其他試驗(yàn)豬均表現(xiàn)正常。由此可見，4種免疫劑量的試驗(yàn)豬2次免疫后注射部位均表現(xiàn)正常，沒有出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，證明該疫苗對仔豬安全。

根據(jù)以上注射部位的肌肉組織病理切片圖顯示，仔豬在接種疫苗后，注射部位的肌肉組織均保持較好的細(xì)胞組織形態(tài)，沒有出現(xiàn)嚴(yán)重的炎性反應(yīng)。

3.3 攻毒前后體重變化情況

在試驗(yàn)期間的不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)，對仔豬進(jìn)行了稱重，以測定不同免疫劑量對仔豬經(jīng)濟(jì)指標(biāo)的影響，如表2所示。

表2 不同劑量豬支原體肺炎滅活疫苗（S株）免疫攻毒試驗(yàn)中仔豬體重結(jié)果

以上結(jié)果表明，免疫試驗(yàn)期間各組仔豬的體重增加差別不明顯，但免疫攻毒后差異較為顯著，免疫組增重明顯高于對照組，對照組個(gè)別豬還出現(xiàn)了體重稍有下降的情況。

3.4 免疫效力結(jié)果

根據(jù)剖檢后豬肺臟發(fā)生Mhp感染的病變情況，使用5.5分法進(jìn)行評分和計(jì)算，結(jié)果詳見表3。

表3 免疫攻毒試驗(yàn)中仔豬的肺臟病變計(jì)分情況及各組的保護(hù)效力情況

以上結(jié)果顯示，免疫組的仔豬肺部病變情況較對照組有明顯改善，而且隨著免疫劑量的增加，免疫攻毒保護(hù)效力也明顯增加，按照60%的保護(hù)率為合格標(biāo)準(zhǔn)，豬支原體肺炎滅活疫苗（S株）對7～14日齡仔豬的最小免疫劑量定為0.5 mL/頭，推薦使用劑量為1.0 mL/頭。

4 結(jié)論

本研究通過對豬肺炎支原體滅活疫苗 (S株)以2.0 mL、1.0 mL、0.5 mL、和 0.25 mL 四種劑量兩次免疫健康仔豬，整個(gè)試驗(yàn)期間四個(gè)免疫劑量組的仔豬體溫均未出現(xiàn)明顯的變化，注射部位也沒有出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，表明該疫苗對仔豬安全。攻毒保護(hù)率結(jié)果分別為77.9%、70.5%、65.3%、49.5%，按照60%以上即達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，該疫苗對7～14日齡仔豬的最小免疫計(jì)量可定為0.5 mL/頭，以最小免疫劑量的雙倍劑量作為推薦使用劑量，即1.0 mL/頭。該試驗(yàn)為后續(xù)豬肺炎支原體滅活疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。