包玉龍，董 超，劉嘉琦，周好樂(lè)

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010）

有機(jī)磷農(nóng)藥可防止植物產(chǎn)生病蟲害，確保農(nóng)作物高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用。但農(nóng)藥也可通過(guò)食物、環(huán)境暴露及職業(yè)接觸等途徑進(jìn)入人體，導(dǎo)致急性或慢性中毒[1-3]。雖然國(guó)內(nèi)外有關(guān)有機(jī)磷農(nóng)藥中毒機(jī)制的研究很多，但是對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥中毒發(fā)生在基因水平的改變的研究甚少。已有的有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)雄性動(dòng)物生殖影響的研究主要集中在生殖毒性作用方面，這些毒性作用主要表現(xiàn)為精液質(zhì)量下降、增加精子畸形率、降低精子活率和數(shù)量等[4-21]。

該試驗(yàn)利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-seq）分析有機(jī)磷農(nóng)藥作用下雄性小鼠睪丸組織差異表達(dá)基因，為探索有機(jī)磷農(nóng)藥引起雄性小鼠生殖毒性的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 有機(jī)磷農(nóng)藥的篩選。選擇最常用的并已表現(xiàn)出毒性作用的有機(jī)磷農(nóng)藥DDV。

1.1.2 動(dòng)物分組。選擇40只昆明種雄性小鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組和低劑量染毒組、中劑量染毒組、高劑量染毒組。低、中、高劑量染毒組染毒劑量依次為5.0 mg/kg/d、10.0 mg/kg/d和20.0 mg/kg/d。染毒60 d后，以脫頸臼法處死小鼠，采集睪丸組織。

1.1.3 試驗(yàn)方法。使用天根Total RNA提取試劑盒提取各組小鼠睪丸組織Total RNA，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢查；NanoPhotometerspectrophotometer檢測(cè)RNA純度(OD260/280 及 OD260/230 比值)；Qubit2.0 Fluorometer：RNA濃度精確定量；利用真核生物大部分mRNA都帶有polyA尾的結(jié)構(gòu)特征，通過(guò)Oligo(dT)磁珠富集帶有polyA尾的mRNA進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，開展Illumina HiSeq轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 Total RNA的提取與鑒定

對(duì)提取的總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果如圖1。結(jié)果顯示，每組提取出了18S和28SRNA。NanoPhotometer spectrophotometer檢測(cè)RNA純度(OD260/280及 OD260/230比值)。Qubit2.0 Fluorometer：RNA濃度精確定量結(jié)果如表1所示，均達(dá)到建立文庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 各組DDV染毒小鼠睪丸Total RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

表1 各組樣品的濃度及純度

2.2 高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

illunina高通量測(cè)序儀下機(jī)的數(shù)據(jù)通過(guò)測(cè)序錯(cuò)誤率檢查、GC含量分布檢查及原始數(shù)據(jù)過(guò)濾，獲得后續(xù)分析使用clean reads的數(shù)據(jù)匯總?cè)缦拢?/p>

對(duì)照組和三個(gè)染毒組的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的解讀分析結(jié)果顯示，低劑量染毒組有46個(gè)差異表達(dá)基因，其中表達(dá)上調(diào)的有29個(gè)基因，表達(dá)下調(diào)的有17個(gè)基因（見(jiàn)圖2）；中劑量染毒組有117個(gè)差異表達(dá)基因，其中表達(dá)上調(diào)的有36個(gè)基因，表達(dá)下調(diào)的有81個(gè)基因（見(jiàn)圖 3）；高劑量染毒組有 117個(gè)差異表達(dá)基因，其中表達(dá)上調(diào)的有36個(gè)基因，表達(dá)下調(diào)的有81個(gè)基因；3種劑量染毒組共有的差異表達(dá)基因有7個(gè)，并且這7個(gè)基因的表達(dá)量都下調(diào) （見(jiàn)圖4）。共有的7個(gè)基因分別為：Gm14332、Gm6768、Ibs p、4930568A12R ik、Spin2g、RP23-328F4.6和Gm18849（見(jiàn)圖 5）。

圖2 低劑量染毒組與對(duì)照組間的差異表達(dá)基因維恩圖

圖3 中劑量染毒組與對(duì)照組間的差異表達(dá)基因維恩圖

圖4 高劑量染毒組與對(duì)照組間的差異表達(dá)基因維恩圖

圖5 三個(gè)染毒組與對(duì)照組相比較共有的差異表達(dá)基因

3 討論與小結(jié)

目前，關(guān)于有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)雄性動(dòng)物生殖影響的研究主要集中在生殖毒性作用方面。例如，葉勁松等人[7]用馬拉硫磷染毒雄性小鼠，證明一定劑量的馬拉硫磷可增高小鼠精子的畸形率。黃斌等人[15]證明，甲基對(duì)硫磷能夠阻滯大鼠生精細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡。于燕等[16]用敵敵畏、樂(lè)果和馬拉硫磷混配后染毒雄性小鼠，結(jié)果顯示，睪丸及附睪發(fā)生明顯的病理學(xué)變化，各染毒組小鼠的精子活動(dòng)率顯著降低，精子數(shù)量顯著減少，精子畸形率顯著增高。何軍山[17]、周好樂(lè)[18,19]等的研究均證明敵敵畏和敵百蟲可增加小鼠精子的畸形率，具有明顯的生殖毒性效應(yīng)，但就有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)雄性動(dòng)物產(chǎn)生生殖毒性效應(yīng)的分子機(jī)制仍不十分清楚。該試驗(yàn)利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù) （RNA-seq）分析了有機(jī)磷農(nóng)藥作用下雄性小鼠睪丸組織差異表達(dá)基因，以期為探索有機(jī)磷農(nóng)藥引起雄性小鼠生殖毒性的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。

轉(zhuǎn)錄組是指在特定條件下細(xì)胞或組織中所有的mRNA的集合。轉(zhuǎn)錄組學(xué)能夠從整體水平上揭示特定生物學(xué)過(guò)程及疾病發(fā)生中的基因表達(dá)變化，從而了解其分子機(jī)制。RNA-Seq測(cè)序技術(shù)是指解讀細(xì)胞或組織內(nèi)mRNA、miRNA序列，對(duì)RNA的表達(dá)量進(jìn)行定量、發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本的一種技術(shù)。RNA-seq測(cè)序技術(shù)已經(jīng)成為基因表達(dá)分析最為敏感的工具之一。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，低劑量染毒組有46個(gè)差異表達(dá)基因，其中表達(dá)上調(diào)的有29個(gè)基因，表達(dá)下調(diào)的有17個(gè)基因；中劑量染毒組有117個(gè)差異表達(dá)基因，其中表達(dá)上調(diào)的有36個(gè)基因，表達(dá)下調(diào)的有81個(gè)基因；高劑量染毒組有117個(gè)差異表達(dá)基因，其中表達(dá)上調(diào)的有36個(gè)基因，表達(dá)下調(diào)的有81個(gè)基因；3種劑量染毒組共有的差異表達(dá)基因有7個(gè)，并且這7個(gè)基因的表達(dá)量都下調(diào)。共有的7個(gè)基因分別為：Gm14332、Gm6768、Ibsp、4930568A12Rik、Spin2g、RP23-328F4.6和 Gm18849。