張文宇

(鄭州市第九人民醫(yī)院 心胸外科，河南 鄭州 450000)

腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、浸潤是惡性腫瘤患者的主要死因，其中腫瘤微血管生成在其中扮演較為重要的角色[1]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的播散、轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤血管新生[2-3]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloprotein，MMP)-2可降解間質(zhì)內(nèi)基質(zhì)成分，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲周圍組織，還可促進(jìn)機(jī)體形成腫瘤微血管，加快血行轉(zhuǎn)移[4-5]。本研究主要探討食管鱗癌患者癌組織中MMP-2、VEGF的表達(dá)水平及其與預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2015年1月至2016年2月在鄭州市第九人民醫(yī)院接受治療的146例食管鱗癌患者的癌組織(試驗(yàn)組)及同期在鄭州市第九人民醫(yī)院體檢正常的60例健康者的食管組織(對(duì)照組)作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)鱗癌組織經(jīng)病理學(xué)證實(shí)確診為食管鱗癌；(2)自愿參與本研究并簽署知情同意書；(3)臨床資料完善。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)經(jīng)化療及生物治療；(3)不配合隨訪。試驗(yàn)組年齡45～73歲，平均(60.12±3.45)歲；男86例，女60例；分化程度中低分化68例，高分化78例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移57例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移89例；浸潤程度pT1～pT2期76例，pT3期46例，pT4期24例；TNM分期Ⅰ期21例，Ⅱ期45例，Ⅲ期61例，Ⅳ期19例。對(duì)照組年齡42～75歲，平均(59.42±3.51)歲；男33例，女27例。兩組患者年齡、性別等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)鄭州市第九人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)通過。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑上海煊翎生物技術(shù)有限公司的兔抗人MMP-2抗體，上海浩然生物科技有限公司的兔抗人VEGF抗體，上海滬震實(shí)業(yè)有限公司的DAB顯色試劑盒及免疫組化SP染色試劑盒。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法以免疫組化法進(jìn)行染色，將標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋，切成4 μm切片，經(jīng)脫蠟、水化、高壓修復(fù)后將一抗(1∶100稀釋)加入，再孵育過夜(4 ℃)，在室溫下加入二抗孵育20 min，再將辣根過氧化物酶加入，DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片以后，可在顯微鏡下觀察。以PBS緩沖液代替一抗為陰性對(duì)照，陽性片為陽性對(duì)照。

1.4 判定結(jié)果以雙盲法判定結(jié)果，由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生進(jìn)行切片觀察后判定，以半定量評(píng)分法作為判定標(biāo)準(zhǔn)。按照陽性細(xì)胞占比計(jì)分：陰性為0分，1%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，超過75%為4分。染色強(qiáng)度計(jì)分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。以陽性細(xì)胞數(shù)評(píng)分及染色強(qiáng)度評(píng)分乘積為判斷標(biāo)準(zhǔn)，4分及以上為陽性，否則為陰性。

1.5 觀察指標(biāo)(1)一般資料。收集患者年齡、性別、腫瘤大小、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、分化程度、TNM分期及浸潤程度等資料并進(jìn)行比較。(2)MMP-2、VEGF表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系。

1.6 隨訪以電話方式進(jìn)行為期5 a的隨訪，截至2021年2月。記錄研究對(duì)象生存情況，并分析MMP-2、VEGF表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以百分比(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)；MMP-2與VEGF相關(guān)性分析采用χ2檢驗(yàn)，用COX多因素回歸分析分析影響食管鱗癌患者生存期的因素，并以生存曲線表示MMP-2、VEGF表達(dá)與生存期的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMP-2、VEGF在食管鱗癌組織中的表達(dá)MMP-2、VEGF在細(xì)胞質(zhì)中呈陽性表達(dá)，為棕褐色顆粒。食管鱗癌患者組織中MMP-2陽性率高于正常組織(P<0.05)，VEGF陽性率高于正常組織(P<0.05)。見表1及圖1。

表1 MMP-2、VEGF在食管鱗癌組織中的表達(dá)[n(%)]

2.2 MMP-2、VEGF陽性表達(dá)與食管鱗癌臨床病理因素的關(guān)系分析146例食管鱗癌組織MMP-2、VEGF陽性表達(dá)與臨床病理學(xué)的關(guān)系，結(jié)果顯示，MMP-2、VEGF陽性表達(dá)與食管鱗癌患者TNM分期、分化程度、浸潤程度及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與性別、年齡、腫瘤大小無關(guān)(P>0.05)。見表2。

表2 MMP-2、VEGF陽性表達(dá)與食管鱗癌臨床病理因素的關(guān)系[n(%)]

2.3 MMP-2、VEGF在食管鱗癌組織中表達(dá)的相關(guān)性本研究146例食管鱗癌患者組織中MMP-2、VEGF表達(dá)情況見表3。進(jìn)一步行相關(guān)性檢驗(yàn)顯示MMP-2、VEGF在食管鱗癌組織中的表達(dá)具有相關(guān)性(χ2=7.086，P=0.008)。

表3 MMP-2、VEGF在食管鱗癌組織中表達(dá)的相關(guān)性[n(%)]

2.4 MMP-2、VEGF表達(dá)與生存期的關(guān)系對(duì)146例食管鱗癌患者進(jìn)行隨訪，結(jié)果顯示，MMP-2陽性組生存率為19.23%(15/78)，中位生存期為22個(gè)月；陰性組生存率為61.54%(48/78)，中位生存期為32個(gè)月，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。VEGF陽性組生存率為33.04%(38/115)，中位生存期為21個(gè)月；陰性表達(dá)組生存率為80.65%(25/31)，中位生存期為34個(gè)月，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

A為不同MMP-2水平的食管鱗癌患者的生存曲線；B為不同VEGF水平的食管鱗癌患者的生存曲線；MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶-2；VEGF為血管內(nèi)皮生長因子。

2.5 影響食管鱗癌患者生存期的多因素分析以MMP-2、VEGF陽性表達(dá)為自變量進(jìn)行COX多因素回歸分析。結(jié)果顯示，MMP-2、VEGF陽性表達(dá)為影響食管鱗癌患者生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表4。

表4 COX多因素回歸分析影響食管鱗癌生存期的危險(xiǎn)因素

3 討論

食管鱗癌的發(fā)生是多步驟、多基因共同參與的緩慢過程，起主導(dǎo)作用的為上皮細(xì)胞惡變。間質(zhì)細(xì)胞可分泌多種類型的細(xì)胞因子，其中MMPs發(fā)揮重要作用[6]。研究顯示，MMPs在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[7-8]。其中MMP-2為MMPs中的明膠酶，以Ⅳ型膠原蛋白、明膠、膠原蛋白(基底膜上變性的)為底物，不僅可將基底膜糖蛋白降解，還在腫瘤形成新生血管過程中發(fā)揮重要作用[9-10]。有研究顯示，MMP-2主要表達(dá)于食管癌細(xì)胞薄膜及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在轉(zhuǎn)移灶及癌組織中表達(dá)水平升高[9,11]。此外，研究發(fā)現(xiàn)MMP-2高表達(dá)可破壞基底膜使腫瘤細(xì)胞較易浸潤淋巴管，與乳腺癌組織侵襲能力及分級(jí)亦具有相關(guān)性[12]。本研究對(duì)食管鱗癌患者癌組織及健康者食管組織進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，MMP-2在食管鱗癌組織中表達(dá)水平高于正常組織，這提示MMP-2參與食管鱗癌的發(fā)生，與劉朝紅等[13]的研究結(jié)果一致。另外，MMP-2陽性表達(dá)與食管鱗癌患者的TNM分期、分化程度、浸潤程度及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有關(guān)，這可能與MMP-2促進(jìn)腫瘤形成有關(guān)。進(jìn)一步分析影響食管鱗癌生存期的因素，結(jié)果顯示，MMP-2為影響食管鱗癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這與李筱[14]的研究結(jié)果一致。

VEGF包括7個(gè)內(nèi)含子、8個(gè)外顯子，位于染色體6p21.3.，包括VEGF-A、B、C、D。其中VEGF-A可與血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，磷酸化底物絡(luò)氨酸殘基，并將信號(hào)傳導(dǎo)激發(fā)，誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移，進(jìn)而促進(jìn)血管生成，利于惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移及進(jìn)一步發(fā)展[1]。VEGF-C可促進(jìn)機(jī)體生成淋巴管，在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、浸潤過程中發(fā)揮重要作用。研究顯示，VEGF在胃癌、結(jié)腸癌組織中呈高表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[15-16]。本研究結(jié)果顯示，癌組織中VEGF陽性率高于正常組織，與劉昊等[17-18]研究結(jié)果一致，提示VEGF與食管鱗癌的發(fā)生密切相關(guān)。本研究進(jìn)一步分析VEGF與病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，VEGF陽性表達(dá)與食管鱗癌患者TNM分期、分化程度、浸潤程度及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有關(guān)，表明VEGF可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的進(jìn)一步發(fā)展，這可能與VEGF能夠促進(jìn)淋巴管及血管生成有關(guān)。進(jìn)行COX多因素分析，結(jié)果顯示VEGF陽性表達(dá)為影響食管鱗癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這一結(jié)果與VEGF在胃癌、結(jié)腸癌中的結(jié)果類似。另外，本研究還對(duì)MMP-2與VEGF的相關(guān)性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明二者關(guān)系密切，但是尚不清楚其具體作用機(jī)制。

綜上所述，食管鱗癌組織中MMP-2、VEGF均呈陽性表達(dá)，且二者具有相關(guān)性，其表達(dá)水平與TNM分期、分化程度、浸潤程度及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有關(guān)，為影響食管鱗癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可預(yù)測(cè)食管鱗癌患者的預(yù)后。但本研究尚不清楚二者相關(guān)性的具體作用機(jī)制，需進(jìn)一步深入研究。