李 婷， 王丹丹， 趙林松， 高 崎， 聶依文， 吳佩穎,3*， 張 彤

(1.上海中醫(yī)藥大學教學實驗中心，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學中藥學院，上海 201203；3.蕓豆數(shù)字科技有限公司，四川 成都 610031；4.上海上藥杏靈科技藥業(yè)股份有限公司，上海 201703)

地骨皮為常用中藥，功能涼血除蒸、清肺降火，用于陰虛潮熱、骨蒸盜汗、內(nèi)熱消渴、肺熱咳嗽、咯血等癥[1]。2015年版《中國藥典》收載的地骨皮為枸杞LyciumchinenseMill.和寧夏枸杞Lycium.barbarumL.的干燥根皮[1]。春初或秋后采挖根部，洗凈，剝?nèi)「ぃ瑫窀蒣1]。中藥地骨皮來源于茄科枸杞屬植物，本屬植物約80種，主要分布在南美洲，少數(shù)種類分布于歐、亞大陸溫帶，《中國植物志》里記載我國產(chǎn)7種3變種[2-3]，全國大部分地區(qū)均有分布，其中主產(chǎn)于華北和西北地區(qū)，并且只有枸杞為廣布種。 華北地區(qū)是商品地骨皮的主產(chǎn)地，其中以山西省產(chǎn)量最大，主要是野生枸根皮作地骨皮用，主產(chǎn)于該省的平遙、陽曲、晉城等地[4]。根據(jù)實際調(diào)查和研究，現(xiàn)作藥用的地骨皮主要來源于枸杞的根皮，同屬的寧夏枸杞和北方枸杞Lyciumchinensevar. Potaninii 根皮僅在個別地區(qū)作地骨皮用[5]。

國內(nèi)外在植物分類生藥鑒定、化學成分、藥理作用等方面對中藥地骨皮已作了一定的工作。地骨皮中含有生物堿類、酰胺類、有機酸類、黃酮類等多種成分[6]，其中酚類成分為地骨皮中主要成分，包括地骨皮甲素、地骨皮乙素、咖啡酰丁二胺等[7]。地骨皮甲素和地骨皮乙素屬于精胺類生物堿，體外實驗表明，地骨皮甲素和乙素可以阻斷細胞的炎癥活化，避免免疫反應紊亂等[8]，另外，還可以拮抗細菌內(nèi)毒素[9]，同時，地骨皮甲素和地骨皮乙素還是降壓的主要成分[10]。 地骨皮也是某些中成藥的主要組成藥味，如地骨降糖膠囊、十味降糖顆粒、養(yǎng)血退熱丸等。除藥用外，地骨皮還可用于輔助降血糖保健食品中。以地骨皮為主要原料制成的地骨皮露常用于體虛骨蒸、虛熱口渴等證的治療，具有涼營血、解肌熱的功能[2]。2015年版《中國藥典》中，地骨皮檢驗項除性狀、顯微、薄層、水分、總灰分、酸不溶性灰分外，并沒有含量測定項。陳倩倩等[11]對47批地骨皮飲片進行質(zhì)量分析，發(fā)現(xiàn)各廠家地骨皮質(zhì)量差異較大，潔凈度差和摻偽問題是不合格的主要原因。為了提高地骨皮藥材質(zhì)量，保障臨床用藥的安全有效，本實驗在前人工作的基礎上，對地骨皮類藥材進行含量測定、特征指紋圖譜、灰分等方面的系統(tǒng)研究，以期為地骨皮藥材的質(zhì)量評價與控制提供參考。

1 材料

1.1 藥材 21批地骨皮購自成都誠實通貿(mào)易有限公司，均為野生資源，由上海中醫(yī)藥大學張彤教授鑒定為正品，具體信息見表1。

表1 樣品信息

1.2 儀器與試劑 Agilent1260系列高效液相色譜儀(四元泵、DAD檢測器)，配置Chemstation色譜工作站(美國Agilent公司)；BS124S型電子天平(萬分之一， 北京賽多利斯科學儀器有限公司)；XS105DU型電子天平(十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司)；JP-100 型數(shù)控超聲波清洗器(深圳市潔盟清洗設備有限公司)； Thermo Sorvall ST16R 高速冷凍離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)；HH-S2 四孔智控水浴鍋(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；SXL-1008程控箱式電爐(上海精宏實驗設備有限公司)。

地骨皮乙素對照品(批號120099-201903，純度≥98%，安徽西青果生物科技有限公司)。乙腈(色譜純，美國 Honeywell公司)；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 地骨皮乙素含量測定

2.1 色譜條件 Dikmatech PlatisilODS色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流動相0.15%磷酸(A)-甲醇(B)，梯度洗脫，程序見表2；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長280 nm；進樣量5 μL。理論塔板數(shù)按地骨皮乙素峰計，應不低于10 000。

表2 梯度洗脫程序

2.2 對照品溶液制備 取地骨皮乙素適量，精密稱定，20%甲醇和0.15%磷酸的混合溶液制成質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備 將地骨皮粉碎，過4號篩，精密稱取粉末約0.2 g，置于50 mL離心管中，加入流動相溶液7 mL，超聲(350 W)處理30 min，離心(4 000×g)10 min，取上清液轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，重復提取2次，殘渣用流動相溶液洗滌，合并提取液，用流動相溶液洗滌定容，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得[12]。

2.4 專屬性實驗 按“2.3”項下方法制備供試品、對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，結(jié)果見圖1。

1.地骨皮乙素圖1 地骨皮HPLC色譜圖

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察 取地骨皮乙素母液，以20%甲醇和0.15%磷酸的混合溶液稀釋，制備成質(zhì)量濃度分別為40、80、160、240、480 μg/mL的對照品溶液，精密吸取5 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣，以地骨皮乙素質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，得方程為Y=4.185 4X-1.267 3(r=0.999 97)，在40.0～480 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.5.2 精密度試驗 精密吸取上述低、中、高3個質(zhì)量濃度對照品溶液各5 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣6次，測得地骨皮乙素峰面積 RSD 為0.27%、0.26%、0.40%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復性試驗 取同一批供試品(批號YC20190101)約0.2 g，精密稱定，平行6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，測得地骨皮乙素含量RSD為0.78%，表明該方法重復性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 取同一批供試品(批號YC20190101)約0.2 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12 h在“2.1”項色譜條件下進樣，測得地骨皮乙素峰面積RSD為1.69%，表明供試品溶液在室溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗 取9份含量已知的樣品(批號YC20190101)約0.1 g，精密稱定，分別按80%、100%、120%水平加入對照品溶液，各平行3份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣。測得地骨皮乙素加樣回收率95%～105%，平均加樣回收率為100.8%，RSD為2.36%。

2.6 地骨皮含量測定 按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，結(jié)果見表3。由此表明，21批地骨皮中地骨皮乙素含量范圍為0.13%～5.24%，建議在2020年版《中國藥典》中增加地骨皮含量測定項，即按干燥品計算，本品含該成分不低于1.0%。

表3 地骨皮乙素含量測定結(jié)果

3 地骨皮指紋圖譜建立

3.1 供試品溶液制備 取各批藥材粉末(過4號篩)約0.2 g，精密稱定，置50 mL離心管中，精密加入流動相溶液25 mL，超聲(350 W)處理30 min，離心10 min(約4 000×g)，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即得[11]。

3.2 色譜條件 同“2.1”項。

3.3 方法學考察

3.3.1 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液(批號YC20190101)5 μL，在“3.2”項色譜條件下進樣6次，以共有峰的3號峰(地骨皮乙素)作為內(nèi)標[13]，測得共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD分別為0.05%～0.45%、1.22%～2.30%，表明儀器精密度良好。

3.3.2 重復性試驗 精密稱取同一批樣品(批號YC20190101)6份，按“3.1”項下方法制備供試品溶液，在“3.2”項色譜條件下進樣，以共有峰的3號峰(地骨皮乙素)作為內(nèi)標[13]，測得共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD分別為0.06%～0.32%、1.21%～2.81%，表明該方法重復性良好。

3.3.3 穩(wěn)定性試驗 取同一批供試品溶液(批號YC20190101)，于0、2、4、8、12、24 h在“3.2”項色譜條件下進樣，以共有峰的3號峰(地骨皮乙素)作為內(nèi)標[13]，測得共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD分別為0.05%～1.36%、0.40%～ 2.70%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.4 圖譜生成 取21批供試品溶液，按“3.1”項下方法制備供試品溶液，在“3.2”項色譜條件下進樣，色譜圖見圖2。

3.地骨皮乙素 4.地骨皮甲素圖2 21批樣品對照圖譜及HPLC指紋圖譜

3.5 相似度分析 將各批藥材的HPLC色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2.0版)[13]，生成對照圖譜(圖2)，標定了5個特征峰。利用中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件進行計算，結(jié)果各批樣品相似度均大于0.97。張永等[14]在研究肉桂指紋圖譜時發(fā)現(xiàn)，桂皮醛過高的峰面積使得不同年限肉桂藥材的相似度沒有明顯差別，故本研究剔除最大峰地骨皮乙素重新計算，結(jié)果見表4。由此可知，除編號S18、S19相似度小于0.80外，其余各批相似度均大于0.8。

表4 剔除地骨皮乙素后21批樣品相似度分析

3.6 聚類分析 聚類分析是以一定分析手段將關系相近的研究對象進行合理的分類的綜合性手段之一[15]。將上述21批樣品5個特有峰的峰面積導入SPSS 21.0軟件，采用組間平均數(shù)連接法和夾角余弦對21批樣品的5個特征峰進行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖3，可知結(jié)果與相似度分析一致。

圖3 21批地骨皮系統(tǒng)聚類分析圖

4 地骨皮灰分檢測

總灰分指藥材經(jīng)加熱熾灼灰分遺留下的無機物，稱定質(zhì)量，判斷是否符合限度規(guī)定，它是生理灰分與外來灰分之和[16]。組織中含草酸鈣較多的藥材，需要測定酸不溶性灰分，可以更準確地反映出外來雜質(zhì)的量[16]。

灰分測定參照2015年版《中國藥典》四部通則測定法進行，取21批藥材粉末(過2號篩)，每批約4.0 g，精密稱定，置于恒定質(zhì)量的空坩堝中，放入馬弗爐中程序升溫，灰化完全后取出，冷卻后記錄數(shù)據(jù)，復烘0.5 h，直至數(shù)據(jù)達到恒重的要求，結(jié)果見表5。

表5 21批樣品灰分測定結(jié)果

2015年版《中國藥典》一部地骨皮項下規(guī)定，灰分不得大于11%，酸不溶性灰分不得大于3%[1]。表5顯示，20批樣品灰分均大于11%，僅1批(YC20191104)合格，但是該批有效成分含量低(0.33%)，可能是過度水洗導致?！断愀壑兴幉臉藴省返诹鶅缘毓瞧ろ椣耓12]規(guī)定，總灰分不得多于19%，酸不溶性灰分不得多于4.5%；第17版《日本藥典》地骨皮項下[17]規(guī)定，總灰分不得多于20.0%，酸不溶性灰分不得多于3.0%。地骨皮灰分與有效成分含量的關系，見圖4，由S13～S21數(shù)據(jù)可知，當?shù)毓瞧ぶ锌偦曳趾退岵蝗苄曰曳纸档蜁r，地骨皮乙素含量顯著降低，故建議2020年版《中國藥典》對地骨皮灰分限量進行調(diào)整，總灰分不超過19.0%，酸不溶性灰分不多于4.5%。

圖4 地骨皮灰分與地骨皮乙素含量的關系

5 討論與結(jié)論

本實驗選用了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸、甲醇-0.1%三氟乙酸、甲醇-0.1%磷酸作為流動相進行考察，最終確定“2.1”項下條件，色譜圖上各色譜峰分離良好，保留時間適中，峰型對稱。

由于2015版《中國藥典》上對地骨皮灰分做了控制，但是并沒有對其指標性成分進行說明。因為地骨皮外皮具有較厚的糠磷皮，其中有細密的組織小孔及不規(guī)則裂紋，很容易吸附灰塵，所以灰分不容易達標，但浸泡或多次洗滌又會顯著降低其有效成分含量。本實驗建立了地骨皮樣品中地骨皮乙素含量測定方法，建議2020年版《中國藥典》中增加地骨皮含量測定項，按干燥品計算，本品含地骨皮乙素(C28H42N4O6)不低于1.0%，并對其灰分限量進行調(diào)整，總灰分不超過19.0%，酸不溶性灰分不多于4.5%。

本實驗建立了地骨皮藥材的對照指紋圖譜，確定了5個共有峰作為基本特征峰。在相似度分析時，應剔除對指紋圖譜貢獻率較大的地骨皮乙素峰，以利于指紋圖譜的綜合評價，根據(jù)聚類分析結(jié)果，將21批樣品劃分為2大類，具體分類形成原因有待進一步研究。