秦 寧 李俊茹 李文龍 杜 匯 李喜煥 張彩英

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)/華北作物改良與調(diào)控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，071001，河北保定）

大豆是重要的糧食與油料作物，含約40%的蛋白質(zhì)和20%的脂肪，是人們膳食結(jié)構(gòu)中不可替代的植物蛋白和食用油來源[1-4]。同時(shí)，大豆中還含有多種生物活性物質(zhì)，如維生素E、異黃酮和皂苷等[5-6]。有報(bào)道稱，生育酚（維生素E）是一種脂溶性物質(zhì)，具有抑制不飽和脂肪酸氧化、防止人體動脈硬化、降低膽固醇、增強(qiáng)血液循環(huán)和防治心血管疾病等多種功效，對維持人體多種正常生理活動具有重要作用，并且生育酚還可用作食品添加劑和藥品營養(yǎng)劑，在食品加工和醫(yī)藥行業(yè)具有重要用途[7-8]。然而，由于人體自身并不能合成生育酚，需從外界攝取，使得生育酚以10%的年需求量遞增[9-11]。有學(xué)者提出，大豆含有較其他植物更為豐富的生育酚，但目前尚未被深入挖掘利用[12-13]。因此，分析和評價(jià)不同來源大豆的品種資源籽粒生育酚及其組分含量，對滿足當(dāng)前及今后生育酚的市場需求以及提升大豆產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)價(jià)值有重要意義。

目前，已有少數(shù)學(xué)者針對大豆品種資源籽粒生育酚及其組分含量開展相關(guān)研究。趙霞等[14]采用高效液相色譜法（HPLC）測定8個(gè)大豆品種生育酚組分含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HPLC方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確、可靠，并篩選出高α-生育酚含量的大豆品種SZ910；李海燕等[12]采用HPLC方法分析黑龍江大豆品種合豐25與Bayfield雜交構(gòu)建的300個(gè)RIL家系生育酚含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各供試家系以哈爾濱地區(qū)大豆的籽粒生育酚含量最高；王麗等[15]以吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供的180份栽培大豆和野生大豆為材料，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在脂肪含量相同的條件下，栽培大豆生育酚含量高于野生大豆；李桂華等[16]分析來自東北地區(qū)和黃淮流域的100多份大豆資源生育酚含量，結(jié)果認(rèn)為，東北地區(qū)大豆資源生育酚含量高于黃淮流域；劉煥成等[17]測定我國東北地區(qū)大豆品種資源與北美大豆籽粒生育酚及其組分含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，東北大豆資源生育酚含量明顯高于北美大豆；代紅麗等[18]分析我國東北和黃淮地區(qū)大豆資源與美國轉(zhuǎn)基因大豆生育酚含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，東北大豆α-生育酚和β-生育酚含量顯著高于黃淮地區(qū)大豆和美國轉(zhuǎn)基因大豆，同時(shí)提出東北大豆是高質(zhì)量生育酚的重要來源。

由以上研究結(jié)果可見，東北地區(qū)大豆品種資源類型豐富，且籽粒生育酚含量相對較高，盡管目前已有學(xué)者針對該地區(qū)少數(shù)大豆資源籽粒生育酚含量開展研究，但相較于大豆其他品質(zhì)性狀的研究而言，報(bào)道甚少，且篩選出的優(yōu)異種質(zhì)遠(yuǎn)不能滿足育種與生產(chǎn)需求。因此，亟需進(jìn)一步針對該地區(qū)大豆品種資源開展更廣泛的研究，以深入挖掘其潛在的高生育酚含量的優(yōu)異種質(zhì)。鑒于此，本研究以東北生態(tài)區(qū)的299份大豆品種資源為材料，分析籽粒生育酚及其組分含量，明確供試品種資源籽粒生育酚及其組分含量遺傳差異，研究其相關(guān)關(guān)系，并篩選高生育酚含量的優(yōu)異種質(zhì)，為今后通過常規(guī)育種及分子育種方法實(shí)現(xiàn)大豆生育酚及其組分含量遺傳改良奠定材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為299份大豆品種資源，主要來自東北生態(tài)區(qū)，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種植方法 供試大豆品種于2019年6月在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)作物育種中心種植，行長1.5m，行距0.5m，完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，2次重復(fù)。

1.2.2 生育酚提取方法 選取均勻一致、健康無損傷的大豆籽粒20～30粒，用磨樣機(jī)粉碎，過60目篩，稱取0.05g，加入1.5mL 80%色譜乙醇溶液（乙醇∶水=4∶1），振蕩15s混勻，置于超聲波中15min；靜置15min，振蕩20s混勻，再置于超聲波中萃取15min，然后在13000轉(zhuǎn)/min下離心15min；吸取上清液，經(jīng)0.25μm濾膜過濾后，在設(shè)定的色譜條件下采用高效液相色譜法測定生育酚含量[19]。

1.2.3 生育酚組分標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法 試驗(yàn)所用δ-、γ-、α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品均購自Sigma公司，純度≥96%；稱取一定量上述標(biāo)準(zhǔn)品，并分別配制成濃度為 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0μg/mL 的δ-、γ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)溶液以及 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4μg/mL的α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)溶液；隨后在設(shè)定的色譜條件下分別進(jìn)樣，獲得峰面積；利用樣品濃度X（μg/mL）與峰面積Y進(jìn)行回歸分析，獲得擬合后的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.2.4 生育酚組分高效液相色譜條件設(shè)定 采用安捷倫1260型高效液相色譜儀測定大豆籽粒生育酚組分含量，色譜條件為：熒光檢測器檢測波長330nm，流動相為色譜乙腈∶色譜甲醇（9∶1），流速1mL/min，柱溫40℃，進(jìn)樣量20μL，檢測時(shí)間14min。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用SPSS 21.0進(jìn)行描述統(tǒng)計(jì)、方差分析、相關(guān)性分析與聚類分析，其中聚類分析采用系統(tǒng)聚類歐式距離類平均法[20-21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆籽粒生育酚組分含量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的確定

通過配制不同濃度大豆籽粒生育酚組分含量標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)高效液相色譜方法獲得峰面積，通過回歸分析，獲得3個(gè)組分含量標(biāo)準(zhǔn)方程，δ-生育酚、γ-生育酚和α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)方程分別為Y=8.6954X+2.9000（R2=0.9991）、Y=10.0330X+4.7000（R2=0.9992）和Y=3.4143X+0.7438（R2=0.9990），由3個(gè)回歸方程決定系數(shù)R2可知，試驗(yàn)所用方法獲得的回歸方程擬合效果好，可用于大豆籽粒生育酚及其組分含量測定。

2.2 大豆籽粒生育酚及其組分含量遺傳變異分析

通過分析供試大豆品種資源籽粒生育酚及其組分含量（表 1）發(fā)現(xiàn)，δ-、γ-、α-生育酚及總生育酚含量在不同大豆品種間的差異達(dá)到極顯著，說明供試品種資源籽粒生育酚含量存在差異；進(jìn)一步分析各組分及其總量發(fā)現(xiàn)，δ-、γ-、α-生育酚及總生育酚平均含量分別為44.15、143.05、66.81及254.01μg/g，其變異系數(shù)在15.37%～38.04%之間，α-生育酚含量變異系數(shù)最高，說明供試大豆品種資源籽粒生育酚及其組分含量存在豐富遺傳變異，能夠從中篩選出高含量特異種質(zhì)。δ-、γ-、α-生育酚與總生育酚比值分別為17.47%、56.57%和25.96%，其變異系數(shù)為11.78%～32.21%，α-生育酚含量比值變異系數(shù)最高。另外，通過分析供試品種資源各組分含量次數(shù)分布（圖1）及其偏度和峰度系數(shù)（表1）發(fā)現(xiàn)，偏度和峰度系數(shù)值均接近0，符合正態(tài)分布，屬于多基因控制數(shù)量性狀。

圖1 供試大豆籽粒生育酚及其組分含量分布情況Fig.1 The distribution of tocopherol and its component contents in soybean varieties

表1 供試大豆籽粒生育酚及其組分含量遺傳變異Table 1 Genetic variation of tocopherol and its component contents in soybean varieties

2.3 大豆籽粒生育酚及其組分含量間的相關(guān)性分析

通過分析供試大豆品種資源籽粒生育酚及其組分含量間的相關(guān)性，結(jié)果（表2）發(fā)現(xiàn)，總生育酚與3種組分含量間的相關(guān)性均達(dá)到極顯著，并以總生育酚含量和γ-生育酚間的相關(guān)系數(shù)最高（r=0.753），其次為總生育酚含量和α-生育酚相關(guān)系數(shù)（r=0.608）；δ-生育酚與γ-生育酚含量間的相關(guān)系數(shù)也達(dá)到極顯著（r=0.452），而α-生育酚與γ-生育酚之間的相關(guān)性未達(dá)顯著水平。各成分比值間以及比值與總含量間的相關(guān)系數(shù)均達(dá)到顯著或極顯著水平。結(jié)果可為實(shí)現(xiàn)大豆籽粒生育酚及其組分含量同步遺傳改良提供一定參考。

表2 供試大豆籽粒生育酚及其組分含量相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of tocopherol and its component contents in soybean varieties

2.4 供試大豆品種資源生育酚及其組分含量聚類分析

對供試大豆品種資源籽粒生育酚及其組分含量進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果（表3）發(fā)現(xiàn)，在歐氏距離15時(shí)，可將供試材料分為3類，即生育酚高含量、低含量和中間含量類型，其中Ⅰ類為高含量大豆資源，包括黑河44、合豐50、合農(nóng)75、綏農(nóng)28和合豐55等，其生育酚總含量平均為319.37μg/g；Ⅱ類為低含量大豆資源，包括合農(nóng)69、青豆、紫花2、寶青綠大豆和東農(nóng)47等，其生育酚總含量平均為178.30μg/g；Ⅲ類為中間含量類型，包括吉育204、綏農(nóng)26、長春滿倉金和綏08-5331等，其生育酚總含量平均為249.98μg/g。

表3 供試大豆品種資源籽粒生育酚及其組分含量聚類分析Table 3 Cluster analysis of tocopherol and its component contents in soybean varieties μg/g

2.5 大豆籽粒高生育酚及其組分含量特異種質(zhì)篩選

基于各供試大豆品種資源籽粒生育酚及其組分含量，篩選出高生育酚及其組分含量特異種質(zhì)13份（表4），其中總生育酚含量較高的品種有5個(gè)，即黑河 44（382.86μg/g）、合豐 50（351.36μg/g）、合農(nóng) 75（350.05μg/g）、綏農(nóng) 28（347.34μg/g）和合豐55（343.02μg/g）；δ-生育酚含量較高的品種有3個(gè)，即哈 12-4547（86.92μg/g）、東遼克霜（83.46μg/g）和遼10Q015（75.64μg/g）；γ-生育酚含量較高的品種有2個(gè)，即蒙豆9號（207.09μg/g）和蒙豆36（198.52μg/g）；α-生育酚含量較高的品種有3個(gè)，即綏農(nóng) 1 號（163.49μg/g）、哈 13-2089（153.10μg/g）和東農(nóng)42（140.83μg/g）。這些優(yōu)異種質(zhì)的篩選一方面為大豆籽粒生育酚常規(guī)育種提供了親本資源，另一方面也為通過分子育種手段實(shí)現(xiàn)該性狀遺傳改良奠定了重要材料基礎(chǔ)。

表4 篩選的大豆籽粒高生育酚及其組分含量特異種質(zhì)Table 4 The soybean germplasms with high tocopherol and its component contents in seed μg/g

3 討論

生育酚是一種透明淡黃色黏稠油狀物，在光照、堿及金屬離子條件下易降解[22]。有報(bào)道稱，生育酚有多種營養(yǎng)和醫(yī)藥價(jià)值，是人類食品重要營養(yǎng)成份之一，每天吸收7～9mg的α-生育酚，能夠保證人體中樞神經(jīng)和血管系統(tǒng)正常功能，每天吸收100～1000mg的α-生育酚，則可起到延緩人體衰老、防紫外線等功效[23]。同時(shí)有學(xué)者指出，相比于其他農(nóng)作物而言，油料作物籽粒中的生育酚含量相對較高，尤其以油菜和大豆含量較為豐富，因而成為食品和醫(yī)藥行業(yè)維生素E的重要來源[24-26]。由此可見，鑒定評價(jià)不同大豆品種資源籽粒生育酚及其組分含量，發(fā)掘利用大豆生育酚優(yōu)異種質(zhì)具有重要意義。

關(guān)于大豆品種資源籽粒生育酚含量的鑒定，目前有少數(shù)學(xué)者已開展研究，并獲得少數(shù)高含量特異種質(zhì)。羅健等[19]以東北三省及內(nèi)蒙古大豆產(chǎn)區(qū)的180份種質(zhì)資源為材料，采用高效液相色譜法檢測其籽粒生育酚及其組分含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，供試材料中合豐50與L-21的生育酚含量最高（分別為313.03和295.55μg/g）；同時(shí)，其他學(xué)者也已證實(shí)東北大豆蘊(yùn)藏著豐富的生育酚資源[16-18]。鑒于此，本研究以東北地區(qū)的大豆品種資源為材料，經(jīng)測定其籽粒生育酚及其組分含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，供試品種生育酚及其組分含量存在較大遺傳變異，并從中篩選出高含量特異種質(zhì)13份，其中合豐50生育酚總含量達(dá)到351.36μg/g，與羅健等[19]測定該品種結(jié)果比較一致，另有12份高生育酚含量優(yōu)異種質(zhì)未見報(bào)道。上述優(yōu)異種質(zhì)的篩選為繼續(xù)采用常規(guī)育種與分子育種手段改良大豆生育酚含量提供重要資源。

4 結(jié)論

通過測定299份大豆品種資源籽粒生育酚及其組分含量發(fā)現(xiàn)，供試品種生育酚及其組分含量存在豐富遺傳變異，δ-、γ-、α-生育酚及總生育酚平均含量分別為44.15、143.05、66.81及254.01μg/g，變異系數(shù)為15.37%～38.04%，以α-生育酚變異系數(shù)最高；3種成分占總含量比值分別為17.47%、56.57%和25.96%，變異系數(shù)為11.78%～32.21%，以α-生育酚比值變異系數(shù)最高；總生育酚含量與3種組分間顯著相關(guān)，δ-生育酚與γ-及α-生育酚亦顯著相關(guān)。根據(jù)各品種生育酚及其組分含量，篩選出13份高生育酚含量特異種質(zhì)，為實(shí)現(xiàn)大豆生育酚及其組分含量遺傳改良奠定了材料基礎(chǔ)。