王麗芳 張德健 張婷婷

（內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/牧草與特色作物生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，010070，內(nèi)蒙古呼和浩特）

土壤微生物的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)都發(fā)生在土壤環(huán)境中，其群落的豐富度、均勻度以及優(yōu)勢(shì)度與土壤的理化性質(zhì)息息相關(guān)。自然因素與人為因素通過(guò)影響土壤的理化性質(zhì)進(jìn)而影響微生物群落多樣性[1-3]，相比于自然因素，合理的耕作方式、施肥和噴灑農(nóng)藥等田間管理措施改善土壤環(huán)境更易于操作。因?yàn)楦鞣绞綄?duì)土壤的容重、孔隙度、含水量、溫度、養(yǎng)分含量和pH值等變化有著復(fù)雜的影響[4-7]，直接或間接地影響到土壤微生物的生活環(huán)境，是近些年國(guó)內(nèi)外學(xué)者重點(diǎn)研究的方向。

研究表明，土壤環(huán)境、土壤微生物及農(nóng)作物會(huì)形成一個(gè)相互制約、相互促進(jìn)的系統(tǒng)，合適的耕作方式可以對(duì)這個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)更高的作物產(chǎn)量以及土地利用的可持續(xù)發(fā)展[8]。土壤微生物的存在可以通過(guò)自身的代謝活動(dòng)反作用于土壤環(huán)境，除直接影響農(nóng)作物對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的吸收外，還會(huì)影響土壤酶的活性，提高土壤有機(jī)質(zhì)含量，釋放一些對(duì)農(nóng)作物生長(zhǎng)起促進(jìn)作用的植物激素[9-11]，且研究發(fā)現(xiàn)土壤微生物群落的改變會(huì)影響土壤環(huán)境中植物激素的種類(lèi)和濃度，從而調(diào)節(jié)農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育[12]。同時(shí)，人為干預(yù)土壤中微生物的群落種類(lèi)與數(shù)量對(duì)于農(nóng)作物的增產(chǎn)也有十分積極的作用[13]。研究表明，大部分土壤微生物對(duì)耕作措施很敏感，并表現(xiàn)出不同的反應(yīng)[14-15]。李景等[16]研究發(fā)現(xiàn)，采用免耕和深松結(jié)合小麥秸稈覆蓋以及小麥-花生輪作等措施均可改善土壤團(tuán)聚體狀況，提高土壤微生物多樣性指數(shù)。Carpenter-Boggs等[17]研究表明，在免耕系統(tǒng)中，土壤微生物的活性和數(shù)量都顯著高于翻耕土壤。鐘文輝等[18]研究表明，減少土壤耕作結(jié)合秸稈覆蓋可提高表層土壤細(xì)菌總量，增加土壤微生物的多樣性。Meriles等[19]發(fā)現(xiàn)在花生-玉米-大豆的輪作體系中，玉米殘茬中木霉菌群顯著增加。Drijber等[20]也發(fā)現(xiàn)在長(zhǎng)期小麥輪作種植制度下，土壤細(xì)菌群落會(huì)發(fā)生變化。但是，在燕麥生產(chǎn)系統(tǒng)下，不同耕作措施對(duì)土壤微生物群落多樣性的影響研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究以燕麥田土壤微生物為研究對(duì)象，采用16S rRNA測(cè)序技術(shù)及ITS測(cè)序技術(shù)探究耕作方式對(duì)其群落多樣性的影響，旨在為燕麥農(nóng)田保育和農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)優(yōu)化提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)區(qū)地處內(nèi)蒙古呼和浩特市武川縣（40°47′～41°43′N(xiāo)、110°30′～115°53′E），位于內(nèi)蒙古高原南端，海拔約1600m，屬溫帶大陸性季風(fēng)氣候，全年降雨分布不均勻，多集中在夏季，其余時(shí)間比較干旱。全年無(wú)霜期95～110d，6級(jí)以上大風(fēng)天有39d以上。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，共設(shè)置機(jī)械免耕播種和傳統(tǒng)翻耕（CK）2種耕作方式，3次重復(fù)，共6個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積為150m2（15m×10m），行距20cm，隨機(jī)排列。種肥施磷酸二銨120kg/hm2和尿素30kg/hm2，田間采用常規(guī)管理。于燕麥拔節(jié)期和灌漿期采集土壤樣品，4個(gè)處理分別為翻耕拔節(jié)期（FGB），免耕拔節(jié)期（MGB），翻耕灌漿期（YGF）和免耕灌漿期（YGM）。在各小區(qū)用“S”形取樣法確定5～7個(gè)取樣點(diǎn)，用土鉆鉆取0～20cm的土層，每次取樣500g，將土樣混合均勻，揀出草根和石塊等雜物，放入-80℃冰箱冷藏備用。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目和方法

將各處理土樣注好標(biāo)簽，制成模板工作液。用MiSeq宏基因組測(cè)序法測(cè)定細(xì)菌群落多樣性，對(duì)細(xì)菌的16S V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，稀釋定量至4～5pM后上機(jī)進(jìn)行測(cè)序。用454宏基因組測(cè)序法檢測(cè)真菌群落多樣性，對(duì)真菌的ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用Roche 454 GS FLX+測(cè)序儀完成測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

測(cè)序平臺(tái)為Illumina MiSeq平臺(tái)[21]。通過(guò)RDP-classifier方法，以RDP數(shù)據(jù)庫(kù)的序列為基礎(chǔ)，對(duì)OTU代表序列進(jìn)行注釋?zhuān)诖嘶A(chǔ)上使用mothur軟件生成各OTU之間的維恩圖。然后利用樣本之間的物種演化信息和豐度信息進(jìn)行單線性分析，得到樣本之間差異的距離矩陣。應(yīng)用R（vegan）軟件繪制PCA圖和heatmap圖，再利用軟件MetaPhlAn繪制生物群落結(jié)構(gòu)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)質(zhì)序列統(tǒng)計(jì)

優(yōu)質(zhì)序列是指有效測(cè)序序列中含有特異性擴(kuò)增引物、不含模糊堿基和長(zhǎng)度大于可供分析標(biāo)準(zhǔn)的序列。各處理土壤樣品真菌序列統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1，共得到優(yōu)質(zhì)序列66 832條，其中燕麥MGB處理的優(yōu)質(zhì)序列比例最高，占比86.87%，其余3個(gè)處理優(yōu)質(zhì)序列比例普遍偏低，且處理間相差不大。

表1 土壤真菌序列數(shù)Table 1 Soil fungal sequences number

不同耕作方式所得土壤樣品細(xì)菌序列統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2，共得到優(yōu)質(zhì)序列258 304條，YGM的優(yōu)質(zhì)序列比例略高于YGF。

表2 燕麥灌漿期土壤樣品細(xì)菌序列數(shù)Table 2 Number of bacterial sequences in soil samples during oat grouting period

2.2 操作分類(lèi)單元（OTU）聚類(lèi)分析

OTU（operational taxonomic units）是通過(guò)一定的距離測(cè)量方法，計(jì)算出2個(gè)不同序列之間的距離或相似度，然后設(shè)置特定的分類(lèi)閾值，得到相同閾值下的距離矩陣，并進(jìn)行聚類(lèi)運(yùn)算以形成不同的分類(lèi)單元。這種對(duì)序列進(jìn)行聚類(lèi)的方法不需要對(duì)每一條序列都進(jìn)行物種注釋?zhuān)岣吡藴y(cè)序分析的準(zhǔn)確性[22]。

圖1（左）為燕麥田土壤真菌OTU聚類(lèi)所得到的韋恩圖，可以看出，不同處理共得到真菌種類(lèi)6096種，其中3810種為4個(gè)處理共同具有，占總數(shù)的62.50%。YGF處理特有的真菌種類(lèi)最多，為33種；而FGB處理特有的真菌種類(lèi)最少，只有4種。4個(gè)處理的真菌種類(lèi)豐富度由高到低分別為YGM處理（5547種）、MGB處理（5484種）、YGF處理（5413種）、FGB處理（4962種）。

圖1（右）為燕麥田土壤細(xì)菌OTU聚類(lèi)所得到的韋恩圖，共檢測(cè)到細(xì)菌1578種，其中94種為4個(gè)處理共有，約占總數(shù)的6.00%。MGB處理?yè)碛凶疃嗟奶赜行约?xì)菌，為454種，其他3個(gè)處理中檢測(cè)到的細(xì)菌種類(lèi)相差不大。同樣，MGB處理所得細(xì)菌種類(lèi)也最多，并遠(yuǎn)高于其他3個(gè)處理，為705種。其他3個(gè)處理細(xì)菌豐富度由高到低為FGB處理（527種）、YGM處理（519種）和YGB處理（451種）。

圖1 不同耕作方式下燕麥田土壤真菌（左）和細(xì)菌（右）OTU聚類(lèi)圖Fig.1 OTU clustering diagram of soil fungi(left)and bacterium(right)in oat field under different tillage methods

2.3 物種豐度分析

豐度分布曲線（rank abundance curve）是分析物種多樣性的一種方式，其構(gòu)造方法是對(duì)單個(gè)樣本中每個(gè)OTU中包含的序列數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，根據(jù)豐度（包含的序列數(shù)）從大到小對(duì)OTU進(jìn)行排序，以O(shè)TU等級(jí)為橫坐標(biāo)，以每個(gè)OTU中所含的序列數(shù)為縱坐標(biāo)繪制成圖。豐度分布曲線可以用來(lái)反映微生物的物種豐度和物種均勻度[23]。曲線在橫坐標(biāo)上的范圍反映物種的豐度，范圍越大，物種的豐度越高；曲線的平滑程度反映物種的均勻度，曲線越平緩，物種分布越均勻。圖2為不同耕作方式下燕麥田土壤真菌和細(xì)菌豐度分布曲線，很顯然，MGB處理真菌種類(lèi)的組成最為豐富，物種組成的均勻程度也最高，其他3個(gè)處理差異不太明顯；4個(gè)處理的細(xì)菌種類(lèi)豐富度與均勻度無(wú)較大差異。

圖2 不同耕作方式下燕麥田土壤真菌和細(xì)菌豐度分布曲線Fig.2 Distribution curve of soil fungi and bacteria abundance in oat fields under different tillage methods

2.4 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性指數(shù)反映群落內(nèi)物種數(shù)量及其相對(duì)豐度，是群落內(nèi)各物種利用同一生境互相競(jìng)爭(zhēng)或共生的結(jié)果。Alpha多樣性指數(shù)分為3類(lèi)，物種豐富度指數(shù)、物種均勻度指數(shù)和物種多樣性指數(shù)。物種多樣性指數(shù)是物種豐富度指數(shù)和物種均勻度指數(shù)的綜合。表3中除simpson指數(shù)之外，均與物種豐富度和多樣性都呈正相關(guān)，simpson指數(shù)與物種多樣性呈負(fù)相關(guān)[24-25]。不同耕作方式和不同生育期燕麥土壤微生物多樣性指數(shù)計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表3，F(xiàn)GB處理的真菌群落豐富度最高（ace=1343.8190，chao=1022.2000），而細(xì)菌群落豐富度沒(méi)有明顯差異。MGB處理的真菌群落多樣性（shannon=4.6401，simpson=0.0254）和細(xì)菌群落多樣性（shannon=6.9325，simpson=0.0030）最高。YGM處理真菌群落多樣性（shannon=3.4812，simpson=0.1053）最低，同時(shí)各處理之間細(xì)菌群落多樣性指數(shù)差別不大。

表3 不同耕作方式下燕麥不同生育期土壤微生物多樣性指數(shù)Table 3 Soil microbial diversity indexes of oat under different tillage methods and different growth stages

2.5 群落結(jié)構(gòu)分析

利用Qiime對(duì)OTU表生成門(mén)水平上的物種豐度表和多樣性物種分布圖（圖3和表4）。在土壤真菌群落分布圖中，占優(yōu)勢(shì)的門(mén)主要有子囊菌門(mén)（Ascomycota）、擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）。在門(mén)水平上土壤真菌的演替規(guī)律比較明顯，其中子囊菌門(mén)在各個(gè)處理各生育時(shí)期均占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)（64.30%），其中以FGB處理的物種豐度和物種組成最為豐富。相較而言，土壤細(xì)菌在各處理以及各時(shí)期的物種豐度和物種組成較為均勻。在門(mén)水平上比較占優(yōu)勢(shì)的是放線菌門(mén)（37.30%）、變形菌門(mén)（23.50%）和酸桿菌門(mén)（12.30%）。

表4 不同耕作方式對(duì)燕麥土壤真菌和細(xì)菌豐度的影響Table 4 Effects of different tillage methods on the fungi and bacteria abundance of oat soil %

圖3 不同耕作方式對(duì)燕麥土壤真菌和細(xì)菌分布的影響Fig.3 Effects of different tillage methods on the distribution of oat soil fungi and bacterium

2.6 主成分分析

通過(guò)主成分分析（principal components analysis，PCA）可以觀察微生物群落間的差異，2點(diǎn)之間的距離越小，表明2個(gè)樣品的微生物群落差別越小[26-27]。圖4是使用R軟件繪制的PCA散點(diǎn)圖，表現(xiàn)出土壤微生物在屬水平上的分類(lèi)和物種豐富度。由圖4可以觀察到，F(xiàn)GB與MGB處理的真菌群落結(jié)構(gòu)比較接近，而其他處理之間的真菌群落結(jié)構(gòu)差異性明顯。細(xì)菌的主成分分析圖則表明，MGB與YGF處理的細(xì)菌群落多樣性相似度較高，而其他處理之間的差異度較高。

圖4 真菌和細(xì)菌主成分分析Fig.4 PCA of fungi and bacterium

2.7 物種差異分析

將不同的樣品在一定分類(lèi)水平上，按照物種豐度高低進(jìn)行聚類(lèi)，聚類(lèi)結(jié)果用色塊表示。色塊間的顏色差異可以用來(lái)反映多個(gè)樣品在群落構(gòu)成上的相似性和差異性[28]。圖5中的每個(gè)色塊代表一個(gè)樣品的一個(gè)屬的豐度，通過(guò)不同處理的聚類(lèi)分析熱圖可以看出，不同的樣品在不同處理方式下均表現(xiàn)出一定程度的相似性，但不同處理對(duì)真菌種類(lèi)的差異性影響表現(xiàn)不同，其中MGB處理的土壤樣品中真菌的種類(lèi)相對(duì)于其他時(shí)期的土壤樣品表現(xiàn)出高度的差異性。而不同土壤樣品中細(xì)菌種類(lèi)只有在YGF處理表現(xiàn)出了明顯的相似性，其他時(shí)期無(wú)明顯相似性或具有一定差異性。相比之下，YGM和MGB處理土壤樣品中細(xì)菌的差異性更加明顯。

圖5 不同處理真菌和細(xì)菌聚類(lèi)分析圖Fig.5 Cluster analysis of fungi and bacterium under different treatments

2.8 進(jìn)化關(guān)系分析

圖6為生物群落結(jié)構(gòu)圖，可以反映樣品中的微生物種類(lèi)和豐度分布情況，可以觀察到豐度較高的微生物種類(lèi)。由內(nèi)而外的節(jié)點(diǎn)顯示出群落結(jié)構(gòu)的從屬關(guān)系，依次代表界、門(mén)、綱、目、科、屬、種。節(jié)點(diǎn)的大小反映了對(duì)應(yīng)分類(lèi)水平上的物種豐度，豐度≥1%的物種水平在圖中用不同的顏色標(biāo)識(shí)出來(lái)。線條的長(zhǎng)短距離表示進(jìn)化距離，可以反映物種之間的差異程度[29-30]。燕麥田真菌共檢測(cè)到4個(gè)目（肉座菌目、柔膜菌目、刺盾炱目和爪甲團(tuán)囊菌目）和4個(gè)科（叢赤殼科、粉褶菌科、黑線菌科和沙漠殼菌科），其中叢赤殼科從屬于肉座菌目，這一支也在整個(gè)群落中占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，即圖6中的紅色節(jié)點(diǎn)。另外，黑線菌科從屬于刺盾炱目，柔膜菌目、黑線菌科和刺盾炱目在進(jìn)化上距離較近。燕麥田土壤細(xì)菌共檢測(cè)到10個(gè)屬豐度較大，其中有些屬無(wú)法培養(yǎng)或確認(rèn)，可以分辨的有5個(gè)屬，分別為索溴桿菌屬、芽生球菌屬、節(jié)桿菌屬、諾卡氏菌屬和微枝形桿菌屬。

圖6 不同處理燕麥田土壤真菌（左）和細(xì)菌（右）群落結(jié)構(gòu)圖Fig.6 Community structure of fungi(left)and bacterium(right)in oat fields under different treatments

3 討論

3.1 不同耕作方式下土壤微生物群落多樣性比較

通過(guò)本試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)與燕麥田土壤微生物多樣性密切相關(guān)的因素為耕作方式的轉(zhuǎn)變。在同一生育時(shí)期，免耕處理下的樣品經(jīng)過(guò)OUT聚類(lèi)檢測(cè)到更多的微生物種類(lèi)，物種豐度曲線范圍廣且平滑，simpson和shannon指數(shù)也最高。且通過(guò)heatmap熱圖可以看出免耕有利于土壤微生物差異化的形成。以上都表明，免耕處理更有利于形成豐富度和均勻度高的土壤微生物群落。肖琴等[31]和盧闖等[32]的研究表明，免耕方式可以保護(hù)土壤中的團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，從而保存土壤水分與溫度，增加土壤有機(jī)質(zhì)含量，為微生物生長(zhǎng)提供充足養(yǎng)分，有利于微生物量的增加，這與本試驗(yàn)的研究結(jié)果一致，免耕作為一項(xiàng)保護(hù)性耕作技術(shù)，可能成為指導(dǎo)燕麥田田間管理措施的切入點(diǎn)，通過(guò)調(diào)節(jié)微生物群落的多樣性來(lái)提升土壤肥力和改善燕麥田土壤環(huán)境，有望成為將來(lái)的研究趨勢(shì)。

3.2 燕麥不同生育期土壤微生物群落多樣性比較

燕麥不同生育期對(duì)土壤微生物的種類(lèi)及數(shù)量也有影響，但本試驗(yàn)中并不能總結(jié)出統(tǒng)一的規(guī)律。在前人的研究中，作物不同生長(zhǎng)期對(duì)土壤微生物的影響有不同結(jié)論。研究表明[33-34]，在玉米生長(zhǎng)期中微生物的群落多樣性會(huì)先增加后減少。這可能是由于各處理土壤微生物群落結(jié)構(gòu)存在明顯的季節(jié)性變化及生境上的變化。與玉米土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成關(guān)聯(lián)最大的因素是溫度，其次是耕作方式和土壤含水量，土壤養(yǎng)分及pH值影響最小。潘孝晨等[35]則認(rèn)為，土壤微生物量隨作物生長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，原因可能是作物的根系脫落物可為土壤微生物提供養(yǎng)分。樊曉剛[34]的研究則認(rèn)為不同耕作方式下微生物量及其多樣性存在差異，免耕和少耕等保護(hù)性耕作為土壤微生物的生長(zhǎng)繁殖創(chuàng)造了良好的生境條件，一定程度上增加了土壤表層微生物量及大量的根系分泌物，增加了微生物種群數(shù)量，有利于維持微生物多樣性，這與本研究結(jié)論一致。不同結(jié)論可能與作物及其生長(zhǎng)過(guò)程中根際營(yíng)養(yǎng)環(huán)境發(fā)生變化以及作物與微生物進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)有關(guān)。

3.3 燕麥田土壤優(yōu)勢(shì)真菌種類(lèi)分析

不同作物種類(lèi)、不同的耕作方式以及其他各方面可能造成土壤環(huán)境變化的因素決定了土壤微生物的種類(lèi)與數(shù)量。趙麗琨[36]研究了不同耕作方式對(duì)玉米地真菌種類(lèi)及數(shù)量的影響，得出，玉米土壤真菌的優(yōu)勢(shì)屬有鐮孢菌屬、腐霉屬、根霉屬、鏈格孢屬、木霉屬、肉座菌屬、綠僵菌屬、青霉屬和曲霉屬等，這些都分屬于子囊菌門(mén)、接合菌門(mén)和肉座菌目。徐佳等[37]發(fā)現(xiàn)不同作物田中優(yōu)勢(shì)真菌屬有青霉（子囊菌門(mén)）、曲霉（子囊菌門(mén)）、鐮刀菌（子囊菌門(mén)）和木霉（肉座菌目）。本研究發(fā)現(xiàn)燕麥田土壤真菌的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)，優(yōu)勢(shì)菌目為肉座菌目、柔膜菌目、刺盾炱目和爪甲團(tuán)囊菌目，與前人研究基本一致。

3.4 燕麥田土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類(lèi)分析

在土壤細(xì)菌方面，汪婭婷等[38]的研究表明云南地區(qū)玉米根際微生物群落的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)和放線菌門(mén)。Jin等[39]在陜西楊凌和河北張家口地區(qū)的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，谷子根際微生物的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為放線菌門(mén)和變形菌門(mén)。Kwak等[40]通過(guò)對(duì)番茄土壤微生物的研究得出，變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。本試驗(yàn)所得結(jié)論為燕麥在不同生長(zhǎng)發(fā)育期細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門(mén)主要為放線菌門(mén)、酸桿菌門(mén)和變形菌門(mén)，與前人研究結(jié)果基本一致。

4 結(jié)論

在傳統(tǒng)翻耕和機(jī)械免耕2種處理下，對(duì)燕麥拔節(jié)期和灌漿期的土壤微生物群落多樣性進(jìn)行了分析。結(jié)論如下：從OUT聚類(lèi)分析、物種豐度曲線、Alpha多樣性分析以及heatmap圖中均可以看出與傳統(tǒng)翻耕相比，免耕處理下土壤微生物多樣性更高，群落之間差異性更大。免耕可以減少土體擾動(dòng)，有助于土壤大團(tuán)聚體的形成，保存土壤養(yǎng)分，因此，免耕能為微生物的生命活動(dòng)創(chuàng)造更好的微環(huán)境，進(jìn)而增加土壤微生物多樣性。燕麥田土壤真菌群落的優(yōu)勢(shì)門(mén)有子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)；土壤細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)門(mén)有放線菌門(mén)、變形菌門(mén)和酸桿菌門(mén)。