項(xiàng)超孫素麗朱振東宗緒曉楊濤劉榮楊梅鮮東鋒楊秀燕

（1四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，610066，四川成都；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，100081，北京）

豌豆（Pisum sativum L.；2n=2x=14）是世界第四大食用豆類作物，在全世界廣泛栽培，中國是世界三大豌豆主產(chǎn)國之一[1]。豌豆生育過程中受多種病蟲害影響，由氣傳性白粉菌（Erysiphe pisi D.C.）侵染導(dǎo)致的白粉病是豌豆最重要的病害之一。豌豆白粉病主要發(fā)生在溫帶及亞熱帶地區(qū)，在白天溫暖、夜間冷涼的氣候條件下最易發(fā)病，豌豆感病后產(chǎn)量一般降低25%～50%[2-3]，感病嚴(yán)重時(shí)產(chǎn)量損失可達(dá)85%以上[4]。在中國，大部分豌豆種植區(qū)均有白粉病發(fā)生，其中云南、四川、甘肅、貴州和福建等省份危害嚴(yán)重，部分地區(qū)豌豆感病品種病情指數(shù)可達(dá)100%[5]。因此，如何有效地控制白粉病發(fā)生和危害是我國豌豆生產(chǎn)面臨的嚴(yán)峻考驗(yàn)。

豌豆是最早被馴化的作物之一，但在品種白粉病抗性的遺傳改良上相對其他作物較為落后。迄今為止，僅在豌豆種質(zhì)中鑒定出2個(gè)隱性抗白粉病基因er1[6]和er2[7]，且鑒定出唯一1個(gè)顯性抗白粉病基因Er3來源于豌豆野生種Pisum fulvum[3]。3個(gè)抗病基因介導(dǎo)的抗性反應(yīng)有所不同，其中er1可以抵抗白粉菌侵入表皮細(xì)胞，表現(xiàn)為免疫或高抗，葉片上肉眼幾乎看不到壞死斑；er2和Er3能阻止已入侵病原菌在組織中的進(jìn)一步擴(kuò)展（產(chǎn)生過敏性反應(yīng)），er2抗性表現(xiàn)受溫度和葉齡等條件的影響，而Er3則不受溫度影響[8-9]。

近年來，Ond?ej等[10]和Attanayake等[11]已分別證明鮑勒白粉病菌（E.baeumleri）和車軸草白粉病菌（E.trifolii）均可以克服er1介導(dǎo)的抗性，同時(shí)Fondevilla等[12]還確定了車軸草白粉病菌可以克服Er3介導(dǎo)的抗性，且有研究表明在部分國家和地區(qū)er1和er2介導(dǎo)的抗性已經(jīng)喪失[13-14]，因此急需尋找到新的抗病材料及抗病基因，以預(yù)防新的致病病原菌流行時(shí)僅含有上述抗病基因的品種發(fā)生大規(guī)模白粉病病害而引起巨大的產(chǎn)量損失。

我國豌豆生產(chǎn)中抗白粉病的優(yōu)異豌豆品種較少，鑒定抗性資源、篩選及培育抗性品種是解決白粉病危害的有效途徑[15-16]。本研究旨在對四川豌豆地方種質(zhì)資源進(jìn)行白粉病抗性及分子鑒定，以期篩選出抗白粉病資源，鑒定出抗白粉病分子標(biāo)記基因型，為四川豌豆抗白粉病研究及育種提供抗源材料。

1 材料與方法

1.1 供試材料

400份豌豆種質(zhì)資源均為四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院豆類種質(zhì)資源庫保存，其中24份為國外引進(jìn)資源，376份為國內(nèi)資源（附表）。國內(nèi)資源中，四川省78個(gè)縣（市、區(qū)）303份，重慶51份、青海6份、北京4份、陜西3份、新疆3份、安徽3份、甘肅1份、廣東1份、浙江1份。對照為感病品種成豌8號(hào)。

1.2 溫室白粉病侵染型鑒定

400份豌豆種質(zhì)資源各取5粒分別播種于含營養(yǎng)土的250mL紙杯中，在18℃～26℃的溫室內(nèi)培養(yǎng)，當(dāng)幼苗第3、4莖節(jié)復(fù)葉展開時(shí)，將分生孢子抖落在幼苗植株上接種白粉菌（采自甘肅省定西地區(qū)的豌豆白粉病菌分離物，經(jīng)在豌豆品種壩豌6號(hào)上擴(kuò)繁后用于接種），后置于18℃～22℃溫室培養(yǎng)。感病對照品種接種完全發(fā)病后（約10d），調(diào)查各供試資源病害侵染型（infection type，IT，0～4型），抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)以 0型為免疫（I），1～2型為抗?。≧），3～4 型為感?。⊿）[5]。

1.3 豌豆基因組DNA提取與分子標(biāo)記分析

每份資源取3株豌豆的幼嫩葉片等量混合，用植物基因組DNA提取試劑盒（DN32，濟(jì)寧谷熙生物科技有限公司）提取供試材料基因組DNA。用7個(gè)與已知抗病（或感?。┗蜻B鎖的SCAR標(biāo)記對400份豌豆資源進(jìn)行分子鑒定，標(biāo)記的詳細(xì)信息見表 1。PCR 反應(yīng)體系為 20μL：含 0.8μL（20ng/μL）基因組DNA、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、10μL2×T5 super Mix（北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司）和8.2μL ddH2O。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?8℃預(yù)變性3min；98℃變性10s，退火10s，72℃延伸10s，循環(huán)40次；72℃延伸5min。采用300V恒壓、2% TBE瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。

表1 用于豌豆資源標(biāo)記基因型鑒定的分子標(biāo)記Table 1 Molecular markers for genotyping pea germplasms

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；采用NTSYS-PC 2.1軟件的SAHN程序和歐式遺傳距離按非加權(quán)配對算術(shù)平均法（UPGMA）計(jì)算各豌豆品種間的歐式遺傳距離，并以此進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 豌豆種質(zhì)資源白粉病抗性統(tǒng)計(jì)及其地理分布

接種豌豆白粉菌10d后，當(dāng)對照感病品種完全發(fā)病且葉片產(chǎn)生大量分生孢子，病害侵染型為4型時(shí)（圖1），統(tǒng)計(jì)400份參試資源對白粉病菌分離物的抗性反應(yīng)。有8份（2.00%）資源表現(xiàn)免疫，分別是犍為大綠、金堂黃麻-2、SV 51741、大邑白豌豆、青Q88、青Q79、青Q72-1和青Q72-2；3份（0.75%）表現(xiàn)為抗病，分別是會(huì)理大菜豌、高縣大麻-2和Ji 1194；5份（1.25%）表現(xiàn)為抗感分離，分別是會(huì)理大白、會(huì)理大白殼、昭化麻-1、綿陽花和眉山菜；其余384份（96.00%）均為感病。在24份國外資源中，有6份表現(xiàn)為免疫或抗病，分別占國外資源總數(shù)和抗性資源的25%和37.5%，這些資源來自于加拿大、英國和瑞典。303份四川資源中有10份表現(xiàn)免疫或抗病，占四川資源總數(shù)的3.3%，主要分布（表2）在四川省中部不同緯度地區(qū)，其中3份免疫的資源分別來自犍為縣、金堂縣和大邑縣，2份抗病的資源來自高縣和會(huì)理縣，5份表現(xiàn)為抗感分離的資源來自會(huì)理縣、廣元市昭化區(qū)、綿陽市和眉山市。

圖1 抗病、免疫和感病植株對比Fig.1 Comparison of resistant,immune and susceptible plants

表2 四川抗性資源分布Table 2 Sichuan resistant resources distribution

2.2 豌豆資源基因型鑒定

用與豌豆抗白粉病er1（Er1）、er2和Er3基因連鎖的7個(gè)SCAR標(biāo)記ScOPD-10650、ScOPE-161600、ScOPO-181200、ScOPX-04880、ScX17_1400、SCW4637和SCAB1874對400份種質(zhì)資源進(jìn)行基因型鑒定。圖2為7個(gè)標(biāo)記在部分豌豆品種（系）中的擴(kuò)增結(jié)果。在400份種質(zhì)資源中，與抗病基因er1連鎖的標(biāo)記ScOPD-10650和ScOPE-161600分別在365份（91.25%）和334份（83.50%）資源中擴(kuò)增出條帶，與感病基因Er1連鎖的標(biāo)記ScOPO-181200、ScOPX-04880分別在350份（87.50%）和367份（91.75%）資源中擴(kuò)增出條帶，與抗病基因er2連鎖的標(biāo)記ScX17_1400在359份（89.75%）資源中擴(kuò)增出條帶，與抗病基因Er3連鎖的標(biāo)記SCW4637和 SCAB1874分別在 88份（22.00%）和 394份（98.50%）資源中擴(kuò)增出條帶（表3）。

表3 7個(gè)分子標(biāo)記擴(kuò)增條帶資源份數(shù)Table 3 Number of accessions with amplified fragment of seven molecular markers

圖2 7個(gè)與白粉病抗性基因連鎖的SCAR標(biāo)記擴(kuò)增條帶Fig.2 Fragments amplified by seven SCAR markers linked to the powdery mildew resistant genes

感病對照品種成豌8號(hào)中，ScOPE-161600沒能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，其他6個(gè)分子標(biāo)記均能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶。在16份表現(xiàn)出抗性的資源中，ScOPD-10650和SCAB1874在所有表現(xiàn)出抗性的資源中均有擴(kuò)增，ScOPX-04880僅在犍為大綠中未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，ScOPE-161600僅在青Q79和青Q72-2中未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，ScOPO-181200、ScX17_1400和SCW4637分別在11份、13份和9份免疫或抗病資源中有擴(kuò)增條帶。

400份種質(zhì)資源由7個(gè)分子標(biāo)記區(qū)分為39個(gè)標(biāo)記基因型，16份表現(xiàn)出抗性的種質(zhì)資源分為7個(gè)標(biāo)記基因型（圖3）。標(biāo)記基因型G4包含資源數(shù)量最多，占比46%，其中包括抗性資源眉山菜、綿陽花、高縣大麻-2、會(huì)理大菜豌和會(huì)理大白。昭化麻-1和金堂黃麻-2屬于相同標(biāo)記基因型（G14），青Q88、Ji1194、Sv51741和青Q72-1屬于相同標(biāo)記基因型（G16），青Q72-2（G17）、會(huì)理大白殼（G18）和大邑白豌豆（G33）分別屬于3個(gè)不同標(biāo)記基因型，犍為大綠（G21）和青Q79（G30）分別單獨(dú)組成一個(gè)標(biāo)記基因型。

圖3 400份豌豆種質(zhì)資源抗白粉病標(biāo)記基因型鑒定聚類分析Fig.3 Cluster analysis of molecular marker genotyping of 400 pea germplasms resistance to powdery mildew

3 討論

隨著世界豌豆產(chǎn)業(yè)受白粉病危害越來越嚴(yán)重，主產(chǎn)國對白粉病基礎(chǔ)和應(yīng)用研究更為重視，重點(diǎn)開展了種質(zhì)資源的抗性鑒定、抗性基因挖掘、高密度構(gòu)建遺傳圖譜和基因組等研究工作，培育豌豆抗病品種應(yīng)對白粉病危害在主產(chǎn)國效果顯著[4,15,22-23]。豌豆在我國屬于小雜糧作物，其基礎(chǔ)研究較為薄弱，抗白粉病資源篩選與分子鑒定的研究不多。20世紀(jì)90年代，彭化賢等[24]在四川省攀枝花市和西昌市白粉病重病區(qū)對國內(nèi)外811份豌豆資源采用田間人工接種誘發(fā)法進(jìn)行抗白粉病鑒定，沒有發(fā)現(xiàn)抗性資源。2009-2011年，曾亮等[25]對國內(nèi)外535份豌豆材料開展連續(xù)3年白粉病抗性田間鑒定，對表現(xiàn)出抗性的20個(gè)材料進(jìn)行室內(nèi)苗期接種鑒定，最終僅篩選出1份高抗、2份抗病和13份中抗材料。2012-2013年，陸建英等[26]對國內(nèi)外收集的436份豌豆資源進(jìn)行田間鑒定，篩選出主要來自于我國云南、甘肅和青海省的35份抗病材料。王仲怡等[27]采用北京和云南白粉菌分離物對396份國內(nèi)外豌豆資源在溫室進(jìn)行接種鑒定，篩選出46份雙免疫資源，僅8份雙免疫資源來源于中國云南。從上述研究可以看出，抗性材料所占比例非常低，且國內(nèi)抗性資源更少。本研究對400份豌豆種質(zhì)資源在溫室進(jìn)行白粉病抗性鑒定，篩選出16份抗白粉病資源，其中10份抗白粉病資源為四川地方品系，主要分布在四川省中部的不同緯度地區(qū)，且有4份資源對白粉病免疫，這將為四川豌豆抗白粉病育種提供有效抗源。

開發(fā)有效的分子標(biāo)記有利于準(zhǔn)確鑒定抗白粉病基因。王仲怡等[27]和付海寧等[28]均利用4個(gè)與er1連鎖的分子標(biāo)記對豌豆抗性資源進(jìn)行分子鑒定并區(qū)分標(biāo)記基因型，發(fā)現(xiàn)感病品種與部分抗性品種（系）的擴(kuò)增條帶和標(biāo)記基因型相同，表明目前開發(fā)的分子標(biāo)記不能有效鑒定er1基因。Tiwari等[18]利用與er1連鎖的分子標(biāo)記PD10650鑒定15個(gè)加拿大豌豆品種（含4個(gè)感病品種）時(shí)，發(fā)現(xiàn)除品種JI 1758外均能擴(kuò)增出大小相似的片段，且沒有檢測出擴(kuò)增片段序列的差異。前人研究表明，開發(fā)的連鎖SCAR標(biāo)記不能有效鑒定er1基因，主要由于PsMLO1（白粉病感病基因，MLO基因家族）位點(diǎn)存在不同堿基突變的er1等位基因，如er1-1～er1-7[5,16,27-33]。本研究采用與豌豆抗白粉病er1（Er1）、er2和Er3基因連鎖的7個(gè)SCAR標(biāo)記在抗病或感病資源中均有擴(kuò)增，擴(kuò)增出條帶的資源比例均高于抗病資源所占比例，且6個(gè)分子標(biāo)記擴(kuò)增出條帶的資源比例均在80%以上，雖有研究表明白粉病菌分為不同的毒力型，但沒有充分證據(jù)表明其存在生理分化[13,26]，因此表明這7個(gè)分子標(biāo)記均不能有效鑒定er1（Er1）、er2和Er3基因，需開發(fā)適用性更好的SSR分子標(biāo)記。盡管利用7個(gè)分子標(biāo)記不能有效鑒定豌豆資源是否含有er1（Er1）、er2和Er3基因，但7個(gè)分子標(biāo)記仍可用于區(qū)分豌豆資源不同標(biāo)記基因型，揭示豌豆資源的遺傳多樣性，本研究中7個(gè)分子標(biāo)記將400份種質(zhì)資源區(qū)分為39個(gè)標(biāo)記基因型，且16份抗性種質(zhì)資源分屬7個(gè)不同標(biāo)記基因型，可為培育抗白粉病豌豆品種組配不同來源的親本提供參考依據(jù)。

目前，國外報(bào)道的豌豆抗白粉病種質(zhì)資源中，尚未發(fā)現(xiàn)新的抗病基因及抗病位點(diǎn)。大部分抗病品種（資源）的抗性由er1基因控制，如Glenroy、Kiley、Mukta、ATC1181、M257-3-6、M257-5-1 和PSI11[34]；LE25、ATC823[34]和 JI210[14]，ATC649、ATC1036[34]和 Stratagem、JI1210[14]，Tara、AC Tamor[14]和955180[35]等材料；除er2基因的來源材料SVP 951和SVP 952外，受er2基因控制的抗豌豆白粉病品種只有1份，為JI 2480[14]；受顯性基因Er3控制的抗豌豆白粉病資源是來自ICARDA的野生型豌豆P660-4[8]。本研究篩選到16份抗性種質(zhì)資源，通過7個(gè)分子標(biāo)記均不能有效判定是否含有抗白粉病er1、er2和Er3基因，因此推測其可能含有新的抗病基因位點(diǎn)或等位基因，將通過構(gòu)建遺傳群體，通過定位對抗白粉病基因進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

篩選出了四川本地抗白粉病豌豆資源，明確了其在四川省的大致地理分布；并利用抗白粉病er1、er2和Er3基因的7個(gè)分子標(biāo)記對400份豌豆資源進(jìn)行了抗白粉病分子標(biāo)記基因型鑒定，可為組配抗白粉病雜交組合提供參考依據(jù)，為四川豌豆抗白粉病育種研究提供有效的抗源材料，同時(shí)四川抗白粉病資源可在四川豌豆生產(chǎn)中直接被利用，促進(jìn)豌豆產(chǎn)業(yè)發(fā)展。