吳堅(jiān)，付瑛

1.贛州市人民醫(yī)院，江西 贛州 341000；2.青島市市立醫(yī)院，山東 青島 266500

糖尿病是一種長期血糖水平增高為特征的代謝性疾病，由于胰島素絕對(duì)或相對(duì)不足及靶細(xì)胞對(duì)胰島素敏感性降低引起的代謝紊亂綜合征，常伴嚴(yán)重的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量。糖尿病中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥是糖尿病常見并發(fā)癥之一，可導(dǎo)致患者認(rèn)知功能障礙，甚至發(fā)展為癡呆［1-2］。相關(guān)資料顯示，60%～70%的糖尿病患者在疾病晚期存在不同程度認(rèn)知功能障礙，但其導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)制尚不明了［3］。糖尿病認(rèn)知功能障礙患者常表現(xiàn)為學(xué)習(xí)、記憶功能的減退，導(dǎo)致生活、社交及工作能力的降低甚至喪失，因此如何預(yù)防或延緩糖尿病認(rèn)知功能障礙的發(fā)生具有重要意義。黃芪多糖是黃芪的主要活性成分之一，具有雙向調(diào)節(jié)血糖的作用，可通過調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞免疫、體液免疫及細(xì)胞因子活性在糖尿病及其并發(fā)癥治療中發(fā)揮著重要作用，并可通過多途徑延緩糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展［4］。格列美脲是新型第三代磺酰脲類降糖藥，可刺激胰島素分泌和釋放，改善胰島素抵抗，還可促進(jìn)肌肉組織對(duì)外周葡萄糖的攝取，降低血糖［5］。本研究分析黃芪多糖聯(lián)合格列美脲對(duì)糖尿病小鼠認(rèn)知功能障礙的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

鏈脲佐菌素（上海明萱生物科技有限公司）；黃芪多糖（上海韻泰信息科技有限公司）；格列美脲（北京伊塔生物科技有限公司）；戊巴比妥鈉（中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司）；DAB 顯色試劑盒（北京伊塔生物科技有限公司）；RIPA 裂解液（哈爾濱新?；驒z測有限公司）；MDA 試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；SOD 試劑盒（上海廣銳生物科技有限公司）；葡萄糖測定試劑盒（艾美捷科技有限公司）。

高壓蒸汽滅菌器（北京佳源興業(yè)科技有限公司）；恒溫水浴箱（上海輔澤商貿(mào)有限公司）；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（杭州諾丁科學(xué)器材有限公司）；凝膠圖像處理系統(tǒng)（上海輔澤商貿(mào)有限公司）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（北京安麥格貿(mào)易有限公司）；磁力攪拌器（北京益奧柏科貿(mào)有限公司）；熒光正置顯微鏡（廣州科適特科學(xué)儀器有限公司）；Morris 水迷宮（上海玉研科學(xué)儀器有限公司）；腦立體定位儀（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；全自動(dòng)生化分析儀（上海帝博思生物科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模及分組

選取雄性SPF 級(jí)ICR 小鼠40 只，6～8 周齡，體質(zhì)量18～22 g，購于北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵循國家動(dòng)物飼養(yǎng)和使用指南，飼養(yǎng)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心7 d，自由飲水?dāng)z食以適應(yīng)周圍實(shí)驗(yàn)環(huán)境。隨機(jī)選取10 只小鼠為正常對(duì)照組，其余小鼠采用高脂飼料喂養(yǎng)4 周后，給予小劑量鏈脲佐菌素（STZ）40 mg/kg 腹腔注射，建立糖尿病小鼠模型，72 h 檢測小鼠空腹血糖≥13.88 mmol/L 即為造模成功。將造模成功的小鼠隨機(jī)分為模型組、格列美脲組、黃芪多糖聯(lián)合格列美脲組（聯(lián)合組），格列美脲組給予灌胃給藥0.5 mg·kg-1·d-1，聯(lián)合組給予灌胃給藥黃芪多糖400 mg·kg-1·d-1、格列美脲0.5 mg·kg-1·d-1；正常對(duì)照組和模型組給予生理鹽水灌胃，連續(xù)6 周。

1.3 檢測方法

（1）體質(zhì)量、空腹血糖：連續(xù)給藥6 周后，測定小鼠體質(zhì)量和空腹血糖，計(jì)算每組小鼠平均體質(zhì)量和空腹血糖。（2）Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)：水迷宮為150 cm×50 cm×30 cm 的圓形水池，分為4 個(gè)象限，在距池壁一定距離的池內(nèi)任何一個(gè)象限，在水面以下2 cm 處放置一個(gè)直徑10 cm 的平臺(tái)，并在水中加入墨汁，防止動(dòng)物在清水下看平臺(tái)。隱藏平臺(tái)實(shí)驗(yàn)：每只小鼠分別從不同象限面朝池壁入水，記錄尋找平臺(tái)的逃逸潛伏期，并考察其學(xué)習(xí)能力。記錄時(shí)間為90 s，如果在90 s 內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，則將小鼠引導(dǎo)至平臺(tái)并熟悉平臺(tái)20 s?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：取下平臺(tái)后，將小鼠從平臺(tái)對(duì)側(cè)入水點(diǎn)放入水池，記錄小鼠在90 s 內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)，測試其記憶能力。（3）透射電鏡：10%水合氯醛麻醉小鼠，收集胰腺尾部和海馬組織，切成1 mm×1 mm×1 mm 大小，置于2.5%戊二醛中固定，組織經(jīng)梯度脫水后用環(huán)氧樹脂固定。超薄切片經(jīng)200 目篩，用醋酸雙氧鈾和醋酸鉛染色，透射電鏡觀察各組小鼠胰島β 細(xì)胞、海馬組織神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)。（4）海馬組織葡萄糖依賴性促胰島素多肽（glucose dependent insulinotropic peptide，GIP）和胰高血糖素樣肽-1（gucagon like peptide-1，GLP-1）檢測：根據(jù)默克密理博Milliplex MAP 試劑盒說明檢測各組小鼠海馬組織GIP、GLP-1 含量。（5）腦組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量：采用硫酸巴比妥法檢測各組小鼠腦組織SOD 活力、黃嘌呤氧化酶法檢測MDA 含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)均采用表示，采用單因素方差分析多組間數(shù)據(jù)的比較，兩組間數(shù)據(jù)比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量、血糖的變化比較

給藥處理后，格列美脲組、聯(lián)合組小鼠體質(zhì)量較模型組明顯升高，空腹血糖較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且聯(lián)合組小鼠體質(zhì)量明顯高于格列美脲組、空腹血糖明顯低于格列美脲組（P<0.05），見表1。

表1 各組小鼠體質(zhì)量、血糖的變化比較（）

表1 各組小鼠體質(zhì)量、血糖的變化比較（）

注：與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與格列美脲組比較，cP<0.05。

2.2 各組小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力比較

Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示，自第4 天開始格列美脲組、聯(lián)合組小鼠逃避潛伏期明顯短于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；格列美脲組、聯(lián)合組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)明顯高于模型組（P<0.05），且聯(lián)合組明顯高于格列美脲組（P<0.05）。見圖1、2。

圖1 各組小鼠逃避潛伏期

圖2 各組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)

2.3 各組小鼠胰島β 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化比較

透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組胰島β 細(xì)胞含豐富的胰島素分泌顆粒，核膜完整，核染色質(zhì)分布均勻；模型組胰島β 細(xì)胞分泌顆粒減少，線粒體嵴斷裂，空泡現(xiàn)象增多；格列美脲組可見少量胰島β 細(xì)胞粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張及空泡現(xiàn)象；聯(lián)合組胰島β 細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核糖體較為豐富，可見較多分泌顆粒，核染色質(zhì)分布均勻。見圖3。

圖3 透射電鏡下觀察胰島β細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)（400倍鏡）

2.4 各組小鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化比較

正常對(duì)照組海馬神經(jīng)元核膜清晰，常染色質(zhì)豐富，核質(zhì)均勻，線粒體膜光滑，嵴板狀或管泡狀；模型組細(xì)胞膜不規(guī)則，染色質(zhì)凝集，細(xì)胞質(zhì)溶解，變性線粒體、膜不清，嵴致密；格列美脲組細(xì)胞膜斷續(xù)不明顯，核膜部分規(guī)整，有常染色質(zhì)分布，有的嵴斷裂，局部呈空泡狀；聯(lián)合組細(xì)胞膜連續(xù)，核膜完整，常染色質(zhì)較多且均勻，線粒體大小不等，嵴斷裂呈空泡狀。見圖4。

圖4 透射電鏡下觀察海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)（400倍鏡）

2.5 各組小鼠海馬組織中GIP、GLP-1 的含量比較

模型組小鼠海馬組織中GIP、GLP-1 含量明顯低于正常對(duì)照組（P<0.05），格列美脲組、聯(lián)合組小鼠海馬組織中GIP、GLP-1 含量明顯高于模型組（P<0.05），且聯(lián)合組明顯高于格列美脲組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 各組小鼠海馬組織中GIP、GLP-1的含量比較（pg/mg，）

表2 各組小鼠海馬組織中GIP、GLP-1的含量比較（pg/mg，）

注：與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與格列美脲組比較，cP<0.05。

2.6 各組小鼠腦組織中MDA、SOD 含量比較

模型組小鼠腦組織中MDA 含量明顯高于正常對(duì)照組、SOD 活性低于正常對(duì)照組（P<0.05），格列美脲組、聯(lián)合組小鼠腦組織中MDA 含量明顯低于模型組、SOD 活性高于模型組（P<0.05），聯(lián)合組對(duì)MDA、SOD 改善明顯優(yōu)于格列美脲組（P<0.05）。見表3。

表3 各組小鼠腦組織中MDA、SOD含量比較（）

表3 各組小鼠腦組織中MDA、SOD含量比較（）

注：與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與格列美脲組比較，cP<0.05。

3 討論

糖尿病是引發(fā)認(rèn)知功能障礙的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，其中代謝異常、高血糖、胰島素信號(hào)通路異常、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、神經(jīng)元鈣穩(wěn)態(tài)失衡和突觸可塑性。血腦屏障損傷等均參與其中，組成了復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制。黃芪多糖是黃芪的重要成分，具有增強(qiáng)免疫、抗炎及降血糖等多種藥理作用［6-7］。已有研究證實(shí)用于糖尿病及并發(fā)癥中黃芪多糖具有改善胰島素抵抗、減輕機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激水平、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等多種作用［8］。臨床上，黃芪多糖可通過改善糖代謝，降低轉(zhuǎn)化生長因子β1來治療糖尿病腎病；并可增強(qiáng)腫瘤放化療患者的免疫力，起到輔助治療的作用［9］。有學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可顯著提高2 型糖尿大鼠胰島素敏感性，降低胰島素抵抗大鼠脂肪組織中抵抗素蛋白的表達(dá)，有望成為新的中藥類胰島素增敏劑和脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)劑［10］。格列美脲為第三代長效口服磺脲類降糖藥，治療糖尿病具有安全性高、有效藥物作用持續(xù)時(shí)間長等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)單用胰島素血糖控制不佳者效果尤為明顯。格列美脲藥物治療機(jī)制在于其可與胰島β 細(xì)胞表面的磺酰尿受體結(jié)合，促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素，進(jìn)而增加外周組織對(duì)胰島素的敏感，抑制肝臟葡萄糖的合成；并可通過血腦屏障進(jìn)入大腦參與能量代謝［11-12］。有學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)，采用STZ 建立糖尿病小鼠模型后并給予格列美脲進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示格列美脲可明顯改善糖尿病小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力，且機(jī)制是通過降血糖作用而達(dá)成的［13］。本研究采用黃芪多糖聯(lián)合格列美脲對(duì)糖尿病小鼠進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)可明顯降低小鼠空腹血糖水平，且效果優(yōu)于單一使用格列美脲。此外本研究在Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，格列美脲組、聯(lián)合組小鼠逃避潛伏期明顯短于模型組，小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)明顯高于模型組（P<0.05），提示黃芪多糖聯(lián)合格列美脲明顯改善STZ 所誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

海馬結(jié)構(gòu)和功能完整性與學(xué)習(xí)記憶的鞏固密切相關(guān)，海馬的損傷通常影響記憶的形成，與認(rèn)知衰退相關(guān)的神經(jīng)退行性病變存在密切聯(lián)系［14］。本研究通過透射電鏡發(fā)現(xiàn)模型組細(xì)胞膜不規(guī)則，染色質(zhì)凝集，細(xì)胞質(zhì)溶解，變性線粒體、膜不清，嵴致密；聯(lián)合組細(xì)胞膜連續(xù)，核膜完整，常染色質(zhì)較多且均勻，線粒體大小不等，嵴斷裂呈空泡狀。由此可見黃芪多糖聯(lián)合格列美脲可改善STZ 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，緩解海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷。GIP 是一種腸道內(nèi)K 細(xì)胞分泌的腸促胰素，可促進(jìn)胰島β 細(xì)胞第一時(shí)相分泌胰島素；GLP-1 是腸道L細(xì)胞分泌的腸促胰素，可抑制胰高糖素和促進(jìn)葡萄糖在組織中的代謝。GIP、GLP-1 在突出可塑性的控制和記憶形成中發(fā)揮著重要作用［15-16］。本研究檢測海馬組織中GIP、GLP-1 含量發(fā)現(xiàn)，格列美脲組、聯(lián)合組小鼠海馬組織中GIP、GLP-1 含量明顯高于模型組（P<0.05），且聯(lián)合組明顯高于格列美脲組（P<0.05），提示黃芪多糖聯(lián)合格列美脲明顯改善糖尿病小鼠海馬組織GIP、GLP-1 含量，可能為改善小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的機(jī)制之一。此外本研究還發(fā)現(xiàn)，格列美脲組、聯(lián)合組小鼠腦組織中MDA 含量明顯低于模型組、SOD 活性高于模型組（P<0.05），提示黃芪多糖聯(lián)合格列美脲可通過降低糖尿病小鼠腦組織氧化應(yīng)激程度改善海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改善糖尿病認(rèn)知功能障礙。

綜上所述，黃芪多糖聯(lián)合格列美脲可通過提高海馬組織GIP、GLP-1 含量及抗氧化能力，進(jìn)而緩解糖尿病導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙，為糖尿病認(rèn)知功能障礙的防治提供新的靶點(diǎn)。