烏恩吉雅，馬雪妮，杜冬華，2，哈斯蘇榮，3*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物疾病診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018；2.河北北方學(xué)院動物科技學(xué)院 預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，張家口 075131；3.內(nèi)蒙古駱駝研究院，阿拉善 750300)

隨著全球氣溫升高和現(xiàn)代畜牧業(yè)的飛速發(fā)展，熱應(yīng)激(heat stress, HS)對動物的影響幾乎不可避免，已給養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生的熱量超過其將熱量散發(fā)到周圍環(huán)境的能力時，可導(dǎo)致HS的發(fā)生，進(jìn)而促使動物體核溫度升高，造成采食量、生產(chǎn)性能和繁殖能力降低，亦會影響肉類和乳制品的產(chǎn)量[3]。研究表明，肝損傷是HS病例中最致命的并發(fā)癥，也是導(dǎo)致患病動物死亡的直接原因[4-6]。因此，數(shù)十年來，HS誘導(dǎo)的肝損傷一直是國內(nèi)外學(xué)者和畜牧業(yè)關(guān)注的焦點(diǎn)。雖然HS導(dǎo)致肝損傷的機(jī)制尚未被完全闡明，但有證據(jù)表明其涉及氧化應(yīng)激(oxidative stress, OS)，且提高機(jī)體抗氧化能力可緩解HS所致組織損傷[1, 7-8]。因此，增強(qiáng)肝組織的抗氧化能力可能是預(yù)防HS所致肝損傷的有效策略。

如上所述，OS參與HS所致肝損傷的機(jī)制已被諸多研究證實(shí)。當(dāng)HS引起的體溫升高和代謝過度時可引起組織/細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生增加。在正常生理?xiàng)l件下，ROS水平可被抗氧化防御機(jī)制有效控制，包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和谷胱甘肽(GSH)等?？寡趸烙到y(tǒng)可通過限制氧化的速度和進(jìn)程來保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激[8]。然而，當(dāng)過量產(chǎn)生的ROS超過機(jī)體抗氧化系統(tǒng)處理能力時，就會導(dǎo)致OS。反過來，OS通過破壞細(xì)胞成分，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸(DNA和RNA)等，引起細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)羰基化(PCO)、脂質(zhì)過氧化和DNA突變等不良反應(yīng)，從而導(dǎo)致氧化損傷[9]。如果OS得不到有效控制，這種反應(yīng)可進(jìn)而引起廣泛的組織損傷[1]。最近的研究亦證實(shí)，ROS的過量產(chǎn)生在HS誘導(dǎo)的肝氧化應(yīng)激、肝細(xì)胞凋亡和壞死過程中發(fā)揮了重要作用[4, 8]。因此，應(yīng)用抗氧化劑干預(yù)，已成為應(yīng)對這一嚴(yán)重并發(fā)癥的重要策略。

目前，已在HS動物模型中證實(shí)，抗氧劑對肝具有保護(hù)作用[10-12]。天然抗氧化劑因具有安全、有效和廉價等特性已被用于多種疾病的輔助治療。駱駝乳清蛋白(camel whey protein, CWP)是一種強(qiáng)大的天然抗氧化劑，可降低ROS生成、提高GSH含量、緩解氧化應(yīng)激，且其抗氧化活性顯著高于牛和其它動物源乳清蛋白[13-15]。此外，CWP雖然和牛乳清蛋白成分相似，均由α-乳白蛋白(α-LA)、乳鐵蛋白(LF)、血清白蛋白(SA)、乳過氧化物酶(LPO)、肽聚糖識別蛋白(PGRP)、溶菌酶(LZM)和各種免疫球蛋白(Ig)等組成，但缺乏易引起幼齡動物和嬰幼兒過敏反應(yīng)的β-乳球蛋白(β-LG)[16]。CWP可通過誘導(dǎo)GSH和抗氧化酶的表達(dá)降低HS所致氧化應(yīng)激和組織損傷[7, 16-17]。近年來，關(guān)于CWP的研究大多集中在其獨(dú)特的抗糖尿病作用，且證實(shí)CWP可調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)是其治療糖尿病的重要因素[13]。Ebaid等[18]研究亦表明，CWP可通過激活谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)緩解肝脂質(zhì)過氧化，并可通過增加GSH水平抑制肝氧化應(yīng)激。本課題組前期在體外試驗(yàn)中也證實(shí)，經(jīng)過模擬胃腸消化的CWP可通過激活抗氧化信號通路緩解HS誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞凋亡和損傷[19]。由此可見，CWP的強(qiáng)抗氧化應(yīng)激作用使其具有潛在的抗HS所致肝損傷的醫(yī)用價值。然而，迄今為止還沒有研究報道在動物模型中CWP對HS所致肝損傷的影響。因此，本研究側(cè)重于闡明CWP對HS誘導(dǎo)的肝氧化應(yīng)激和損傷的保護(hù)作用，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

CWP由本實(shí)驗(yàn)室按先前報道的方法制備并保存[19]；組織活性氧(ROS)檢測試劑盒(DHE)購自北京百奧萊博科技有限公司；總SOD 活性檢測試劑盒(WST-8 法)、Western blot及IP細(xì)胞裂解液、蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司；丙二醛(MDA)含量及過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；還原型谷胱甘肽(GSH)含量檢測試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；蛋白定量用Pierce BCA Protein Assay Kit，購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；大鼠維持飼料購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)動物分組及處理

36只6周齡SPF級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠購自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證編號為SCXK(蒙)2015-0001，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證編號為SYXK(蒙)2015-0001。SD大鼠試驗(yàn)期間給予標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室飼料及清潔的飲水，于(21±1)℃，相對濕度60%～75%環(huán)境中隔離飼養(yǎng)，室內(nèi)燈光于每天08:00開啟，20:00關(guān)閉。將所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后隨機(jī)分為6組，每組6只。即HS致肝損傷組(HS)、CWP低劑量干預(yù)組(L組)、CWP中劑量干預(yù)組(M組)、CWP高劑量干預(yù)組(H組)、正常對照組(Control)和CWP對照組(CWP)。L、M和H組灌服CWP(CWP溶于1 mL生理鹽水，劑量分別為100、200和400 mg·kg-1)，Control組和HS組每天灌服1 mL生理鹽水，CWP組每天灌服400 mg·kg-1的CWP，連續(xù)2周。之后，除Control組和CWP組外，其余各組大鼠均按本實(shí)驗(yàn)室前期確定的程序建立HS致大鼠肝損傷模型：將大鼠置于人工氣候箱內(nèi)(溫度為(40±0.2)℃，相對濕度為60%～65%)HS處理2 h(上午10:00～12:00)，連續(xù)處理8 d。每次HS處理結(jié)束后，立即將大鼠移出人工氣候箱并于初始環(huán)境飼養(yǎng)22 h。HS期間，于每次HS處理前1 h灌服上述劑量CWP或生理鹽水。

1.3 肝功能生物標(biāo)志物AST和ALT檢測

試驗(yàn)結(jié)束后采集各組大鼠血液，1 000×g離心15 min分離血清。按試劑盒說明書操作，用Curve Expert 1.4軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算血清樣本中AST和ALT含量。

1.4 HE染色觀察肝組織病理學(xué)變化

試驗(yàn)結(jié)束后，將各組大鼠麻醉后處死并采集肝組織。將各大鼠肝組織一部分固定于4%多聚甲醛固定過夜。按常規(guī)方法，組織塊經(jīng)石蠟包埋并制成4 μm切片后進(jìn)行HE染色，觀察肝組織病理學(xué)變化。剩余大鼠肝組織用預(yù)冷PBS沖洗除去血污，于液氮冷凍后置-80 ℃保存，備用。

1.5 檢測肝組織ROS及MDA含量

按試劑盒說明書操作，采用DHE探針檢測ROS含量。取大鼠肝組織50 mg，加入1 mL勻漿緩沖液，充分勻漿后于4 ℃ 1 000×g離心10 min，取上清；采用微量法，于96孔板中依次加入勻漿后的上清190 μL和DHE探針10 μL，混勻；將96孔板于37 ℃避光孵育30 min后用酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度(Synergy H4, BioTek, USA，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長610 nm)；另取勻漿上清50 μL，采用BCA法測定樣品蛋白含量，以每毫克蛋白熒光強(qiáng)度(RFU·mg-1prot)表示ROS含量。按試劑盒說明書操作，檢測組織勻漿中MDA含量。

1.6 檢測肝組織SOD、CAT及GSH-Px活性

取50 mg肝組織，剪碎后加入200 μL Western blot及IP細(xì)胞裂解液，充分勻漿后于4 ℃ 12 000×g離心5 min，取上清用BCA法進(jìn)行蛋白定量，剩余部分進(jìn)行后續(xù)檢測。按試劑盒說明書操作，檢測組織勻漿中SOD、CAT、GSH及GSH-Px活性。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以(Mean±SE)表示，用SPSS 25.0軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD進(jìn)行組間比較，結(jié)果以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P<0.001表示差異極其顯著。

2 結(jié) 果

2.1 CWP對HS大鼠血清肝功能生物標(biāo)志物的影響

HS誘導(dǎo)的肝氧化應(yīng)激可誘發(fā)肝細(xì)胞損傷，進(jìn)而導(dǎo)致肝功能障礙[4]。因此，本研究檢測了大鼠血清中肝功能生物標(biāo)志物ALT和AST水平，以探討CWP對HS大鼠肝功能的影響。結(jié)果顯示，HS組大鼠血清ALT(圖1A)和AST(圖1B)水平和Control組相比極顯著升高(P<0.001)，表明HS處理對大鼠肝有明顯的損傷作用。CWP組大鼠ALT和AST水平和Control組相比差異不顯著(P>0.05)，表明本研究所用CWP劑量無肝毒性。同時可見，CWP以劑量依賴性方式降低了HS大鼠血清ALT和AST水平，其中H組和HS組相比差異極顯著(P<0.01)。本研究在體內(nèi)試驗(yàn)中證實(shí)，CWP可緩解HS所致肝損傷。

A.ALT水平；B.AST水平；*表示P <0.05，**表示P <0.01，***表示P <0.001。Control.正常對照組；CWP.CWP對照組；HS.HS致肝損傷組；L.CWP低劑量干預(yù)組；M.CWP中劑量干預(yù)組；H.CWP高劑量干預(yù)組。下同

2.2 CWP對HS大鼠肝組織學(xué)變化的影響

由圖2可見，Control 組和CWP組大鼠肝細(xì)胞核圓潤位于細(xì)胞中央；肝細(xì)胞排列呈索狀，肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列；肝血竇間隙大小均勻，未見擴(kuò)張或萎縮；組織中未見水腫、壞死、炎性細(xì)胞浸潤等病理變化，組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，表明CWP無肝細(xì)胞毒性。HS組大鼠肝組織部分肝小葉中央靜脈周圍和肝血竇內(nèi)可見以淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞彌散性或小灶性浸潤(如黑色箭頭所示)；大量肝細(xì)胞水腫和空泡變性，細(xì)胞顯著腫脹、胞漿淡染，細(xì)胞核固縮、深染(如橙色箭頭所示)、碎裂(如灰色箭頭所示)；大量肝細(xì)胞脂肪變性，細(xì)胞內(nèi)可見形態(tài)規(guī)則的圓形空泡(如藍(lán)色箭頭所示)；部分中央靜脈和大量肝血竇內(nèi)可見充滿大量紅細(xì)胞(如紫色箭頭所示)。結(jié)合“2.1”數(shù)據(jù)分析，HS可導(dǎo)致大鼠肝組織發(fā)生損傷。然而，重要的是，CWP可以劑量依賴性方式緩解HS誘導(dǎo)的大鼠肝損傷，高劑量組除部分肝小葉匯管區(qū)和肝血竇內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤外，肝組織病理學(xué)形態(tài)基本恢復(fù)正常，表明CWP對HS誘導(dǎo)的大鼠肝損傷有明顯的緩解作用。

2.3 CWP對HS大鼠肝氧化應(yīng)激標(biāo)志物的影響

本研究通過檢測肝中ROS和MDA水平，評價了CWP對HS大鼠肝氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，HS可誘導(dǎo)大鼠肝組織內(nèi)ROS(圖3A)及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平(圖3B)極顯著升高(P<0.001)。然而，在HS處理前灌服CWP的大鼠肝中ROS和MDA水平顯著下降(P<0.05)，且呈劑量依賴性。同時，CWP對正常大鼠肝中ROS和MDA水平無影響(P>0.05)。這些結(jié)果表明，CWP可在不引起正常機(jī)體氧化應(yīng)激前提下對HS誘導(dǎo)的大鼠肝氧化應(yīng)激有明顯緩解作用。

圖3 CWP對HS大鼠肝中ROS產(chǎn)生(A)及MDA水平(B)的影響

2.4 CWP對HS大鼠肝中抗氧化防御系統(tǒng)的影響

HS可引起組織中抗氧化酶活性和GSH水平降低，從而導(dǎo)致ROS清除障礙和氧化應(yīng)激[7]。因此，本研究檢測了HS大鼠肝中SOD、CAT、GSH-Px活性及GSH水平。結(jié)果顯示，HS降低了大鼠肝中SOD(圖4A)、CAT(圖4B)和GSH-Px(圖4C)活性及GSH(圖4D)水平，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。然而，HS處理前灌服CWP的大鼠肝中SOD、CAT、GSH-Px活性及GSH水平均有不同程度升高，且呈劑量依賴性。同時可見，CWP亦可明顯增強(qiáng)正常大鼠肝中CAT(P<0.05)及GSH-Px(P<0.05)活性。以上結(jié)果表明，CWP可通過上調(diào)抗氧化劑水平及抗氧化酶活性提高大鼠肝的抗氧化防御能力，從而保護(hù)肝組織免受HS引起的氧化損傷。

3 討 論

隨著全球氣溫升高和集約化養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，熱應(yīng)激(HS)對動物養(yǎng)殖業(yè)的危害已不可避免。據(jù)報道，肝損傷及肝功能障礙幾乎是所有HS病例中最常見且致命的病理變化[4]。雖然HS致肝損傷的機(jī)制尚未完全闡明，但有證據(jù)表明其涉及氧化應(yīng)激(oxidative stress, OS)[1, 3, 7, 16]。氧化反應(yīng)在機(jī)體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著非常重要的作用，然而，當(dāng)該反應(yīng)產(chǎn)生的ROS超過機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)處理能力時就會引起組織發(fā)生氧化損傷[20]。HS引起的肝損傷和功能障礙也是由OS所介導(dǎo)的[11]。因此，應(yīng)用抗氧化劑，尤其是安全有效的天然抗氧化劑增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，進(jìn)而緩解HS所致肝損傷已成為研究熱點(diǎn)。乳蛋白通常是通過胃腸消化后釋放的各種生物活性肽的前體，越來越受到國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。天然蛋白源的生物活性肽作為營養(yǎng)添加劑或治療藥物最大的優(yōu)點(diǎn)是在體內(nèi)幾乎沒有毒副作用[13]。CWP已被證實(shí)是一種強(qiáng)大的天然抗氧化劑，且其抗氧化活性優(yōu)于牛和其他動物源乳清蛋白，這可能是因?yàn)樗目寡趸被岷枯^高[13]。本課題組前期的體外研究亦表明，水解的CWP可通過增強(qiáng)大鼠肝細(xì)胞抗氧化能力緩解HS所致細(xì)胞損傷[19]。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步在體內(nèi)試驗(yàn)中證實(shí)了CWP對HS大鼠肝損傷的保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過增強(qiáng)肝組織抗氧化防御能力實(shí)現(xiàn)的。

本研究觀察到,HS大鼠血清ALT和AST水平升高，表明HS可導(dǎo)致大鼠肝功能障礙。ALT主要存在于肝細(xì)胞胞漿中，血清中其水平升高提示肝細(xì)胞膜受損，膜通透性增加。AST主要分布在肝細(xì)胞的胞漿和線粒體中，血清中其水平升高表明這些細(xì)胞器受損[21]。先前有報道稱，駝乳可通過降低這些肝功能生物標(biāo)志物水平改善酒精性肝損傷，但沒有明確CWP的作用[22]，本研究發(fā)現(xiàn)，HS大鼠肝功能生物標(biāo)志物水平顯著升高，表明肝細(xì)胞及肝功能已明顯受損，而CWP可顯著降低ALT和AST水平。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，HS大鼠肝組織病理學(xué)變化與肝功能生物標(biāo)志物水平一致，說明，暴露于HS環(huán)境可顯著破壞大鼠肝組織結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為大量肝細(xì)胞水腫和空泡變性，核固縮、碎裂及溶解，炎性細(xì)胞浸潤，中央靜脈及肝血竇充滿大量紅細(xì)胞等，這些病理改變與近期的另一項(xiàng)研究一致，在該研究中，暴露于HS的大鼠肝組織顯示肝細(xì)胞腫脹、空泡變性、壞死、炎性浸潤及出血[4]。而本研究發(fā)現(xiàn)，HS前用CWP進(jìn)行干預(yù)的大鼠，肝損傷程度明顯降低?？傊?，本研究首次提供了進(jìn)一步證據(jù)，證明駝乳的主要成分CWP具有潛在的抗HS所致肝功能障礙及損傷作用。

如前所述，HS誘導(dǎo)的OS，尤其是過量的自由基，如ROS，可通過靶向各種大分子，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA，誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷并導(dǎo)致肝功能障礙[23]。MDA是多不飽和脂肪酸脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，也是衡量機(jī)體氧化應(yīng)激水平的常用生物標(biāo)志物[24]。本研究中觀察到，HS顯著增加了大鼠肝細(xì)胞ROS和MDA水平，而 CWP降低了ROS及MDA水平，且呈劑量依賴性，這也是最終緩解了HS所致肝損傷及功能障礙的重要原因。先前的報道表明，水解的CWP含有可有效清除自由基的生物活性肽，因此可作為治療氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的營養(yǎng)品或治療肽[25]。針對氧化應(yīng)激疾病，機(jī)體組織/細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)化出防御系統(tǒng)，包括GSH、SOD、CAT、GSH-Px等，從而控制OS的進(jìn)程，保護(hù)組織細(xì)胞免受氧化損傷。其中，GSH是抗線粒體功能障礙和凋亡的關(guān)鍵抗氧化劑，其水平失衡可能會破壞氧化還原穩(wěn)態(tài)。SOD、CAT、GSH-Px是控制ROS水平重要的抗氧化酶，通過清除自由基參與抗氧化防御，從而限制氧化的速度和進(jìn)程，最終保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[9]。各種應(yīng)激因素會降低抗氧化防御系統(tǒng)功能，本研究中亦顯示，HS顯著降低了SOD、CAT、GSH-Px活性及GSH水平，這是HS導(dǎo)致肝發(fā)生氧化應(yīng)激的重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)，HS前補(bǔ)充CWP的大鼠肝中GSH水平及SOD、CAT、GSH-Px活性均明顯恢復(fù)。之前的研究表明，與單獨(dú)喂食被黃曲霉毒素污染飼料的動物相比，日糧補(bǔ)充CWP可恢復(fù)肝及睪丸中的抗氧化酶活性和GSH水平[13]。另一項(xiàng)研究表明，CWP可通過激活GSH-S-轉(zhuǎn)移酶減少肝脂質(zhì)過氧化并增加GSH水平來控制氧化應(yīng)激[18]。本課題組前期研究亦顯示，水解的CWP可通過增強(qiáng)抗氧化酶活性降低HS誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞損傷[19]。這些數(shù)據(jù)表明，增強(qiáng)肝的抗氧化能力可改善各種應(yīng)激因素引起的肝損傷。另外，本研究顯示，CWP可明顯增強(qiáng)正常大鼠肝中CAT及GSH-Px活性，表明了其可作為營養(yǎng)性添加劑的潛力。總之，這些結(jié)果提示，膳食補(bǔ)充CWP可以提高大鼠肝的抗氧化能力，從而緩解HS誘導(dǎo)的氧化損傷。

4 結(jié) 論

綜上所述，補(bǔ)充CWP可緩解HS所致大鼠肝損傷，其機(jī)制可能是提高了肝中GSH水平及SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶活性，進(jìn)而有效地緩解了ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激，也為CWP作為一種營養(yǎng)性添加劑抵御高溫環(huán)境引起的肝氧化損傷提供了科學(xué)依據(jù)。