劉曉鳳 王 姚周思敏曾 堯王 晨劉 濤*

（1.西藏大學，西藏 拉薩850000； 2.四川天一學院，四川 綿竹618200； 3.成都大學，四川 成都 610106）

川射干屬于鳶尾科植物鳶尾Iris tectorumMaxi.的干燥根莖［1］，主產于廣西、廣東、四川等地區(qū)，為四川的道地藥材，氣微，味甘、苦，歸肺經，具有清熱解毒、消痰利咽的功效，主治咽喉腫痛、痰咳氣喘?，F代藥理學研究表明，川射干在臨床上還具有神經保護、抗腫瘤、抑菌等作用［2?5］，具有良好的臨床利用潛力。

2020 年版《中國藥典》 一部收載川射干質量標準為用HPLC 法測定射干苷含量。據文獻報道，川射干中還含有鳶尾甲苷A、鳶尾甲苷B、野鳶尾苷、鳶尾苷元、鳶尾甲黃素A、鳶尾甲黃素B 等多種異黃酮成分［6］，具有保護心肌細胞、抗炎、抗腫瘤等功效［7?8］，因此，選擇單一的指標成分檢測難以判別藥材的優(yōu)劣。本研究建立了川射干HPLC、UV、IR 指紋圖譜，以期對該藥材內在質量進行有效表征、綜合評價和全面控制。

1 材料

P230Ⅱ型高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司）；TU?1810PC 型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；Spectrum Two 型傅里葉變換紅外光譜儀（美國Perkin Elmer 公司）；FA2004 分析電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；101?1?S 型電熱鼓風干燥箱（成都雅源科技有限公司）；PS?40 型超聲波清洗器（深圳得康清潔設備有限公司）。

川射干均購自四川逢春制藥有限公司，經成都大學劉濤研究員鑒定為鳶尾科植物鳶尾的干燥根莖，批號分別為170102、170108、170114、170123、170127、170206、170211、170221、170325、170331、170602、170608、170611、170615、170621、170708、170715、170723、170728、170813，分別編號為S1～S20，其中S3～S10、S15～S18 產自阿壩金川縣，其他批次產自四川廣元青川縣。射干苷對照品，批號wkq16070103，純度≥98%，購自四川省維克奇生物科技有限公司。甲醇和乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純；水為純凈水。

2 方法與結果

2.1 HPLC 指紋圖譜建立

2.1.1 色譜條件 Global Chromatography C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）?0.1% 磷酸（B），梯度洗脫（0～15 min，20%～24%A；15～25 min，24%～26%A；25～36 min，26%～30% A；36～50 min，30%～32% A；50～70 min，32%～20% A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長280 nm；進樣量10 μL。

2.1.2 對照品溶液制備 取射干苷對照品適量，精密稱定，加70%乙醇制成質量濃度為43 μg／mL 的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 取川射干（過3 號篩）約0.5 g，精密稱定，具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 甲醇，密塞，稱定質量，超聲（240 W、40 kHz）處理30 min，放冷，再稱定質量，補足，搖勻，濾過，取續(xù)濾液l mL，置5 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.4 方法學考察

2.1.4.1 精密度試驗 取同一供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣6 次，測得各共有峰相對保留時間RSD均小于0.5%，各共有峰相對峰面積RSD 均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.2 重復性試驗 取同一批樣品，按“2.1.2”項下方法平行制備供試品溶液6 份，在“2.1.1”項色譜條件下進樣，測得各共有峰相對保留時間RSD 均小于0.5%，相對峰面積RSD 均小于3.5%，表明該方法重復性良好。

2.1.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，于0、2、4、6、8、12 h 在“2.1.1”項色譜條件下進樣，測得各共有峰相對保留時間RSD 均小于0.3%，相對峰面積RSD 均小于4.5%，表明溶液在12 h 內穩(wěn)定性良好。

2.1.5 圖譜采集 取10 批樣品，按“2.1.2”項下方法平行制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣，結果見圖1。

2.1.6 圖譜生成 采用中國藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A 版）”，對10 批樣品的指紋圖譜進行分析，生成對照指紋圖譜。取射干苷對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下測定，共確定7 個共有峰，1 號峰為射干苷，結果見圖1。

圖1 10 批樣品HPLC 指紋圖譜

2.1.7 共有峰相對保留時間及相對峰面積 在HPLC 指紋圖譜中，1 號峰在各批樣品中均有出現，分離度良好，峰面積大，故選作參照峰，將其保留時間和峰面積記為1.000 0，其他共有峰相對保留時間、相對峰面積分別見表1～2。

表1 10 批樣品共有峰的相對保留時間

表2 10 批樣品共有峰的相對峰面積

2.1.8 相似度評價 采用中國藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A 版）”，將10 批樣品的指紋圖譜與對照指紋圖譜進行相似度分析，結果分別為0.990、0.997、0.999、0.999、1.000、0.998、0.999、1.000、0.997、0.999，平均值0.998。將相似 度平均 值80%～120%作為相似度變異可接受范圍，擬規(guī)定兩者相似度應大于0.798。

2.1.9 驗證試驗 另取10 批樣品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣。運用中國藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A 版）”，將10 批樣品的指紋圖譜與對照指紋圖譜進行相似度分析，結果分別為0.995、0.997、1.000、0.999、1.000、0.999、0.999、1.000、0.999、1.000，符合上述規(guī)定，相對保留時間、相對峰面積分別見表3～4。

表3 10 批樣品（驗證）共有峰的相對保留時間

表4 10 批樣品（驗證）共有峰的相對峰面積

2.2 紫外指紋圖譜建立

2.2.1 光譜掃描條件 以95%乙醇為空白調整基線，扣除基底影響。光譜掃描條件為光度模式，光譜帶寬2.00 nm，掃描范圍200.00～800.00 nm，掃描間隔1.0 nm，快速掃描。

由于川射干主要成分為黃酮類，其吸光度在紫外光區(qū)，故對照指紋圖譜及相似度均以200～400 nm 處的吸光度為標準進行建立并計算。

2.2.2 供試品溶液制備 取藥粉約0.5 g，精密稱定，具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 95%乙醇，密塞，稱定質量，超聲（240 W，40 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質量，補足，搖勻，濾過（續(xù)濾液稀釋312.5 倍時，圖譜吸光度均處于0.2～0.8 之間），搖勻，即得。

2.2.3 方法學考察

2.2.3.1 精密度考察 取同一供試品溶液，在“2.2.1”項條件下連續(xù)掃描6 次，得210、240、266 nm 處紫外吸光度RSD 分別為0.08%、0.52%、0.30%，表明儀器精密度良好。

2.2.3.2 重復性考察 取同一批樣品，按“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液6 份，在“2.2.1”項條件下進行掃描，測得210、240、266 nm 處紫外吸光度RSD 分別為2.95%、2.74%、3.20%，表明該方法重復性良好。

2.2.3.3 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液，于0、0.5、1、1.5、2、3 h 在“2.2.1”項條件下進行掃描，測得210、240、266 nm 處紫外吸光度RSD 分別為2.06%、2.02%、3.07%，表明溶液在3 h 內穩(wěn)定性良好。

2.2.4 圖譜采集 取10 批樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項條件下測定，紫外光譜疊加圖見圖2。

圖2 10 批樣品紫外指紋圖譜

2.2.5 圖譜生成 將“2.2.4”項下紫外圖譜各波長下的吸光度取平均值，并以其建立對照指紋圖譜［9］，見圖3。

圖3 紫外對照指紋圖譜

2.2.6 相似度分析 將10 批樣品的紫外指紋圖譜與對照紫外指紋圖譜經IBM SPSS statistics 軟件中雙變量相關“Kendall 的tau?b”分析計算相似度［10］。結果，相似度分別為0.991、0.995、0.993、0.996、0.998、0.996、0.990、0.996、0.994、0.995，平均值 為0.994，將其平 均值的80%～120%作為變異可接受范圍，擬規(guī)定兩者相似度應大于0.795。

2.2.7 驗證試驗 另取10 批樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項條件下掃描，所得紫外圖譜與對照指紋圖譜各波長下吸光度經數據處理軟件IBM SPSS statistics 中雙變量相關“Kendall 的tau?b 分析”計算相似 度。結果，相似度 分別為0.960、0.961、0.959、0.956、0.956、0.960、0.959、0.960、0.957、0.957、0.957，符合上述規(guī)定。

2.3 紅外指紋圖譜建立

2.3.1 供試品溶液制備 取藥材約0.5 g，精密稱定，具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 95%乙醇，密塞，稱定質量，超聲（240 W、40 kHz）處理30 min，放冷，補足減失質量，搖勻，濾過。精密移取0.2 mL 續(xù)濾液于瑪瑙研缽中，吹干溶劑，與約0.1 g 干燥KBr 粉末研磨均勻，于14 MPa真空環(huán)境中壓片1.5 min，即得。

2.3.2 光譜掃描條件 取按“2.3.1”項下方法制備的供試品薄片，放入傅里葉變換紅外光譜儀中掃描，并扣除空氣干擾，掃描范圍4 000～400 cm－1。

2.3.3 方法學考察

2.3.3.1 精密度試驗 取藥材粉末約0.5 g，按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.2”項條件下連續(xù)掃描6 次。取圖譜中吸收強度最強的10 個峰作為特征峰，測得特征峰波數RSD［11］均小于0.02%，表明儀器精密度良好。

2.3.3.2 重復性試驗 取同一批樣品，按“2.3.1”項下方法平行制備供試品溶液6 份，在“2.3.2”項條件下掃描，測得特征峰波數RSD 均小于0.25%，表明該方法重復性良好。

2.3.3.3 穩(wěn)定性試驗 取藥材粉末約0.5 g，按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.2”項條件下于0、0.5、1、1.5、2、3 h 掃描，測得特征峰波數RSD 均小于0.02%，表明溶液在3 h 內穩(wěn)定性良好。

2.3.4 圖譜生成 將20 批樣品按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.2”項條件下掃描，紅外光譜疊加圖見圖4，各批次吸收峰的波數見表5。

表5 20 批樣品紅外吸收峰波數（cm－1）

續(xù)表5

圖4 20 批樣品紅外指紋圖譜

2.3.5 共有峰確定 若組內吸收峰的波數最大差異顯著小于與其相鄰組之間的平均波數差，就確定該組峰是一組共有峰，反之為變異峰［12?13］。

2.3.6 雙指標序列分析法鑒定指標 雙指標序列為以某一批次樣品作參考，計算其他樣品紅外指紋圖譜的共有峰率和變異峰率，并依次排列而成的序列。

2.3.7 雙指標序列分析 對20 批樣品進行雙指標序列分析，結果表明，紅外指紋圖譜共有峰率65.22%～100.00%，變異峰率0～27.78%。其中，產自阿壩金川縣的樣品之間共有峰率78.26%～100.00%，變異峰率0～22.22%；產自四川廣元青川縣的樣品間共有峰率73.91%～100.00%，變異峰率0～16.67%，表明同一產地樣品之間共有峰率高，變異峰率低。

3 討論

現有對川射干在質量控制方面的研究，多采用HPLC方法測定一種或者多種有效成分含量，方法較為繁瑣，且中藥化學成分復雜，測定單一指標成分并不能完全代表該藥材的品質。而指紋圖譜就是研究以反映中藥的整體化學特征為立論依據，對藥品質量進行整體評價的方法。HPLC指紋圖譜是在確定中藥化學成分的基礎上對中藥進行整體控制，廣泛應用于中藥材及中成藥的真?zhèn)蝺?yōu)劣鑒別［14?17］。紫外指紋圖譜可反映中藥中具有不飽和化學鍵及其共軛體系基本物質的吸收情況，并以此控制中藥質量［18?19］。紅外指紋圖譜可反映中藥中多種化合物成分飽和鍵的吸收，并確定該中藥中的各種化學基團，以此控制中藥質量［11?13］。

本實驗建立了HPLC、UV、IR 指紋圖譜，其中HPLC、UV、IR 指紋圖譜特征均有一定差異，故將多種分析方法聯合或許能夠減少單一檢測分析方式在某些方面的不足而造成的誤差，使川射干藥材能得到簡便、可靠、完整、健全的質量控制。但此方法不能確定藥材中的化學成分及藥理活性的關系，有待進一步研究。