李青，劉武軍，郭瀟佳，王倩，趙宗保

（1 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所生物技術(shù)研究部，遼寧 大連 116023；2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）及其還原性形式（NADH）是生命體中氧化還原反應(yīng)的重要輔因子[1]。在自然界中，NAD有兩個(gè)異頭物，即β-NAD和α-NAD（圖1），其中與煙酰胺環(huán)N1位共價(jià)結(jié)合的異頭碳原子的絕對(duì)構(gòu)型分別為R和S。因?yàn)棣?NAD 是細(xì)胞內(nèi)的主導(dǎo)構(gòu)型，而且大多數(shù)野生型NAD 依賴型酶偏好于β-NAD，因此除另有說明，文獻(xiàn)和本文中使用的NAD 都為β-NAD。通常NAD依賴型氧化還原酶以β-NAD 為輔因子時(shí)具有很高活性，而利用α-NAD 時(shí)幾乎檢測(cè)不到活性[2-4]。除氧化還原酶外，許多其他酶，包括聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARPs）、去乙?；讣碍h(huán)腺苷二磷酸核糖（cADPR）合成酶等，都以β-NAD 為底物完成其生物學(xué)功能[5-7]。α-NAD 被認(rèn)為是β-NAD 的代謝副產(chǎn)物，可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化還原輔因子通量的減少[8]。僅個(gè)別酶能識(shí)別α-NAD，腎胺酶抗體氧化異構(gòu)化α-NADH為β-NAD[9]，腺苷二磷酸核糖受體水解酶降解α-NAD 為腺苷二磷酸核糖和煙酰胺[5,10]。因此，NAD 依賴型天然酶被認(rèn)為已進(jìn)化出可區(qū)別煙酰胺周圍立體構(gòu)型的NAD結(jié)合口袋。

NAD 依賴型氧化還原酶廣泛應(yīng)用于手性醇類和手性胺類化合物的高效制備。開發(fā)高效NAD 類似物降低NAD 使用成本一直是生物催化領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。許多結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的合成NAD 類似物（圖1）已被制備并應(yīng)用于多種氧化還原酶，以評(píng)價(jià)其作為氧化還原輔因子的潛力[11-20]，如1-甲基-3-氨甲?；拎ぃ∕NA）用于硫辛酰胺脫氫酶[21]、1-苯乙基-3-氨甲酰基吡啶（P2NA）用于葡萄糖脫氫酶[22]及研究最廣泛的1-芐基-3-氨甲?；拎ぃ˙NA）用于馬肝醇脫氫酶[23]、細(xì)胞色素P450 BM3 突變體（P450 BM3 R966D/W1046S）[24]、2-羥基聯(lián)苯3-單加氧酶[25]和烯醇還原酶[22,26-27]，但這些類似物中與煙酰胺N1 共價(jià)連接的碳原子（Cα）為非手性，而且其催化活性有待提高。此外，煙酰胺核糖（NAR）作為NAD 重要的前體物質(zhì)之一，NAR 類似物對(duì)于揭示NAR 在細(xì)胞生化過程中的作用及開發(fā)新型藥物具有重要意義[28]；在呋喃糖環(huán)或煙酰胺部分單原子取代的穩(wěn)定的NAD 類似物可作為NAD 消耗酶的抑制劑[17,29]；腺嘌呤部分取代的NAD類似物可作為熒光探針于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)各種NAD 消耗酶[30]，腺嘌呤替換為胞嘧啶的NAD 類似物用于開發(fā)生物正交氧化還原體系[15,31]；但這些類似物中與煙酰胺N1共價(jià)連接的碳原子（Cα）立體化學(xué)與β-NAD 相同。因?yàn)槊傅妮o因子結(jié)合口袋被視為手性環(huán)境，因此探索酶對(duì)具有Cα立體化學(xué)的手性NAD 類似物的差異性識(shí)別以及設(shè)計(jì)特定手性中心的NAD 類似物具有積極的研究意義，也是不對(duì)稱生物催化工程的預(yù)期應(yīng)用目標(biāo)之一。

圖1 NAD及其類似物的結(jié)構(gòu)

從P2NA的結(jié)構(gòu)出發(fā)，在Cα位引入一個(gè)官能團(tuán)來取代其中一個(gè)氫原子，非手性類似物P2NA可以轉(zhuǎn)化為手性化合物。當(dāng)羧基被引入時(shí)，相應(yīng)的NAD 類似物為α-氨基-3-苯丙酸（即苯丙氨酸，Phe）的煙酰胺化衍生物。因此，本文利用具有生物相容性并且易于建立Cα手性中心的光學(xué)純芳香族氨基酸作為手性源制備手性NAD 類似物。本研究以光學(xué)純?chǔ)?β-氨基-3-苯丙酸為原料通過Zincke反應(yīng)合成了兩對(duì)手性NAD 類似物對(duì)映異構(gòu)，并應(yīng)用于巨型芽孢桿菌來源的細(xì)胞色素P450 BM3 突變體（P450 BM3 R966D/W1046S）[24]和來源于硫化葉菌的葡萄糖脫氫酶突變體（SsGDH I192T/V306I）[22]兩種氧化還原酶。

1 材料和方法

1.1 材料

煙酰胺，ABCR公司；2,4-二硝基氯苯及D-苯丙氨酸（D-Phe），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇，天津大茂試劑廠；二氯甲烷，北京化工廠；L-苯丙氨酸（L-Phe），北京索萊寶科技有限公司；S-3-氨基-3-苯丙酸（3S-Phe）及R-3-氨基-3-苯丙酸（3R-Phe），薩恩化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司；12-對(duì)硝基苯氧基十二烷酸（12-pNCA），成都卡麥爾醫(yī)藥科技有限公司。

1.2 儀器

核磁共振波譜儀（NMR），AVANCE III 400 MHz型，瑞士布魯克拜厄斯賓有限公司；高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜（HRMS），Q-TOF 6540 型，美國(guó)Agilent 公司；旋光儀，MCP200型，奧地利Anton Paar公司；紫外分析儀，WD-9403F 型，北京市六一儀器廠；多功能微孔酶標(biāo)儀，BIO-TEK Synergy H1型，美國(guó)BioTek Instruments公司。

1.3 NAD類似物的合成

1.3.1 1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲?；拎ぢ然}（Zincke鹽）的合成

將煙酰胺（2.44g，20mmol）和2,4-二硝基氯苯（12.15g，60mmol）加到25mL 圓底燒瓶中，加熱到90℃，反應(yīng)2h，待反應(yīng)冷卻至室溫，加入甲醇溶解，加入乙醚重結(jié)晶，重復(fù)3次后，得到黃色泡沫狀固體1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲?；拎ぢ然}（5.38g, 82.9%）。1H NMR (400MHz, D2O)δ: 9.60 (s, 1H), 9.34 (d, J = 2.4Hz, 1H), 9.28 (d, J =6.4Hz, 1H), 9.21 (d, J = 8.4Hz, 1H), 8.88 (dd, J = 8.8,2.4Hz, 1H), 8.43 (dd, J = 8.4, 6.4Hz, 1H), 8.20 (d, J =8.8Hz, 1H)。13C NMR (101MHz, D2O) δ: 165.0, 149.8,147.5,147.3,145.6,142.7,138.3,134.2,131.1,130.7,128.6,122.8。

1.3.2 手性NAD類似物合成

手性NAD類似物合成方法見本文2.1節(jié)，具體步驟如下：分別向含有L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸、S-3-氨基-3-苯丙酸或R-3-氨基-3-苯丙酸（1mmol）的2mL 甲醇溶液中，滴加含有Zincke 鹽（357mg，1.1mmol）的2mL 甲醇溶液，滴加完畢后，加入三乙胺1mmol，分別在反應(yīng)0h、4h、9h 分3 次加入，室溫下攪拌24h 后，薄層色譜法（TLC）檢測(cè)（展開劑為二氯甲烷∶甲醇=3∶1，體積比）原料Zincke salt反應(yīng)完全。過濾除去反應(yīng)液中的不溶物，濾液減壓濃縮除溶劑，硅膠柱層析純化，二氯甲烷及甲醇梯度洗脫，洗脫劑梯度為二氯甲烷→二氯甲烷∶甲醇=10∶1→二氯甲烷∶甲醇=7∶1→二氯甲烷：甲醇=5∶1→二氯甲烷∶甲醇=3∶1→二氯甲烷：甲醇=2∶1→二氯甲烷∶甲醇=1∶1→甲醇，合并含NAD 類似物的洗脫液，減壓濃縮除溶劑，加水溶解并冷凍干燥，獲得橙色粉末狀固體。

L-PheNA,110mg，產(chǎn)率36.0%，1H NMR(400 MHz,D2O) δ∶9.06 (s, 1H), 8.88 (d, J = 6.4Hz, 1H), 8.77 (d,J = 8.0Hz, 1H), 8.04 (dd, J = 8.0, 6.4Hz, 1H), 7.30-7.15 (m, 3H), 7.07 (dd, J = 7.6, 1.8Hz, 2H), 5.58 (dd,J = 10.8, 4.8Hz, 1H), 3.83 (dd, J = 14.8, 4.8Hz, 1H),3.47 (dd, J = 14.8, 10.8Hz, 1H)。13C NMR (101MHz,D2O) δ: 171.1, 165.5, 146.64 144.5, 144.3, 135.2,133.2, 129.1, 128.7, 127.7, 127.6, 77.5, 38.9。HRMS:C15H15N2O3+計(jì)算值271.1077，檢測(cè)值271.1074.[α]20D=-5.50o。

D-PheNA,93mg，產(chǎn)率30.5%，1H NMR(400MHz,D2O) δ∶9.11 (s, 1H), 8.92 (d, J = 6.0Hz, 1H), 8.83 (d,J = 8.0Hz, 1H), 8.09 (dd, J = 8.0, 6.0Hz, 1H), 7.38–7.25 (m, 3H), 7.13 (dd, J = 7.2, 1.8Hz, 2H), 5.63 (dd,J = 11.2, 4.8Hz, 1H), 3.89 (dd, J = 14.8, 4.8Hz, 1H),3.53(dd,J=14.8,11.2 Hz,1H)。13C NMR(101MHz,D2O)δ 171.1,165.6,146.6,144.4,144.2,135.2,133.3,129.2,128.7,127.8,127.6,77.5,39.0，HRMS:C15H15N2O3+計(jì)算值271.1077，檢測(cè)值271.1086。[α]20D=+5.50o。

3S-PheNA,202mg，產(chǎn)率66.0%，1H NMR(400MHz,D2O) δ∶9.39 (s, 1H), 9.15 (d, J = 6.0Hz, 1H), 8.87 (d,J = 8.0Hz, 1H), 8.17 (dd, J = 8.0, 6.4Hz, 1H), 7.69–7.44(m,5H),6.38(t,J=7.6Hz,1H),3.46(d,J=8.0Hz,2H)。13C NMR (101MHz, D2O) δ: 175.6, 165.7, 145.6,144.6,143.3,134.9,134.1,130.2,129.6,128.6,127.8,73.6,41.4。HRMS:C15H15N2O3+計(jì)算值271.1077,檢測(cè)值271.1085。[α]20D=-83.49o。

3R-PheNA，224mg，產(chǎn) 率73.2%，1H NMR(400MHz,D2O)δ:9.39(s,1H),9.15(d,J=6.0Hz,1H),8.87(d,J=8.0Hz,1H),8.17(t,J=6.8Hz,1H),7.65–7.44(m,5H),6.38(t,J=7.6Hz,1H),3.46(d,J=7.6Hz,2H)。13C NMR (101MHz, D2O) δ: 175.6, 165.7, 145.6,144.6,143.3,134.9,134.1,130.2,129.6,128.6,127.8,73.6, 41.4。HRMS: C15H15N2O3+計(jì)算值271.1077，檢測(cè)值271.1082。[α]20D=+73.99o。

1.3.3 NAD類似物BNA及其還原型BNAH的合成BNA及BNAH按參考文獻(xiàn)[27]方法合成。

1.4 手性NAD 類似物作為氧化還原輔酶的反應(yīng)行為

1.4.1 氧化還原酶的表達(dá)純化

具有N 端組氨酸標(biāo)簽的pET30a-P450 BM3 F87A 質(zhì)粒獲贈(zèng)于中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過程技術(shù)研究所李盛英教授。利用定點(diǎn)突變技術(shù)引入P450 BM3雙位點(diǎn)突變R966D/W1046S，引物序列及蛋白表達(dá)純化同文獻(xiàn)報(bào)道[24]。SsGDH I192T/V306I基因是由中國(guó)蘇州泓迅生物科技公司合成，并插入在pET28a 質(zhì)粒的EcoR I 和Hind III 酶切位點(diǎn)之間，獲得具有N 端組氨酸標(biāo)簽質(zhì)粒pET28a-SsGDH I192T/V306I，蛋白表達(dá)純化按照參考文獻(xiàn)[22]的方法進(jìn)行。

1.4.2 P450 BM3 R966D/W1046S 利用手性NAD 類似物的活性及動(dòng)力學(xué)

用Bio-Tek 酶標(biāo)儀在25℃下測(cè)定P450 BM3 R966D/W1046S 對(duì)手性NAD 類似物的活性及動(dòng)力學(xué)，反應(yīng)體積100μL，每個(gè)樣品3 個(gè)平行。P450 BM3 R966D/W1046S消耗還原型輔因子，因此反應(yīng)中應(yīng)用的手性NAD 類似物、BNA 及NAD 為經(jīng)Na2S2O4原位還原的儲(chǔ)備液。原位還原輔因子的制備方法如下：將手性NAD類似物或BNA或NAD（10mmol/L）用四倍摩爾當(dāng)量的Na2S2O4和Na2CO3在脫氧H2O 中還原30min，得到的溶液作為儲(chǔ)備溶液。

P450 BM3 R966D/W1046S 利用手性NAD 類似物的活性測(cè)定。體系如下：100mmol/L pH 8.0 Tris-HCl 緩沖液，50μmol/L 12-pNCA、0.8μmol/L P450 BM3 R966D/W1046S，0.5mmol/L 手性NAD 類似物。分別以BNA 和NAD 為對(duì)照，以不添加輔因子樣品為陰性對(duì)照，以還原型BNAH和商品化NADH為陽性對(duì)照。記錄10min 內(nèi)410nm 處的吸光值的變化。標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定對(duì)硝基酚在相應(yīng)酶標(biāo)儀測(cè)定條件的表觀消光系數(shù)為4.1L/mmol。一個(gè)酶活力單位為25℃下每分鐘產(chǎn)生1.0μmol對(duì)硝基苯酚的酶量。

P450 BM3 R966D/W1046S 對(duì)手性NAD 類似物的動(dòng)力學(xué)測(cè)定。體系如下：100mmol/L pH 8.0 Tris-HCl 緩沖液，50μmol/L 12-pNCA, 0.8μmol/L P450 BM3 R966D/W1046S，梯度濃度還原型輔因子。記錄10min 內(nèi)410nm 的吸光值的變化。每個(gè)濃度3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。測(cè)定結(jié)果用OriginPro 8.5.1 軟件對(duì)Michaelis-Menten 方程進(jìn)行擬合。還原型輔因子的制備方法

1.4.3 手性NAD類似物作為SsGDH I192T/V306I的輔酶

用Bio-Tek酶標(biāo)儀在45℃下測(cè)定手性NAD類似物在SsGDH I192T/V306I 中的活性，反應(yīng)體積100μL，每個(gè)樣品3 個(gè)平行。反應(yīng)體系如下：100mmol/L pH 8.0 Tris-HCl，10mmol/L D-葡萄糖，0.1mg/mL SsGDH I192T/V306I， 2.0mmol/L 手 性NAD 類似物或BNA 或NAD。以不添加輔因子樣品為陰性對(duì)照。每個(gè)樣本重復(fù)3 次。記錄60min 內(nèi)NAD 類似物樣品在360nm 處（或NAD 樣品在340nm處）吸光值的變化。一個(gè)酶活力單位定義為在45℃下1min生成1μmol還原型輔因子的酶量。

2 結(jié)果與討論

2.1 手性NAD類似物的合成

Zincke反應(yīng)是通過Zincke鹽與伯胺在正丁醇溶劑中加熱回流進(jìn)行胺交換反應(yīng)制備吡啶鹽類化合物的反應(yīng)[32]，已被用于合成NAD[33]及其類似物[34-36]，并且保留原有的手性中心。本研究通過Zincke反應(yīng)以光學(xué)純?chǔ)?β-氨基-3-苯丙酸為原料合成兩對(duì)手性NAD 類似物對(duì)映異構(gòu)體L/D-PheNA 和3S/3RPheNA（圖2）。因手性原料中含有羧基酸性基團(tuán)，伯氨基已形成質(zhì)子化狀態(tài)，不利于氨基對(duì)Zincke鹽2 位的親和進(jìn)攻，故研究選擇三乙胺（Et3N）作為堿催化劑抑制氨基質(zhì)子化，促進(jìn)Zincke反應(yīng)過程中的質(zhì)子傳遞，反應(yīng)可進(jìn)行完全。兩對(duì)手性NAD 類似物對(duì)映體具有十分相似的核磁共振結(jié)果。以LPheNA 為例，其氫譜中化學(xué)位移5.58 的dd 峰歸屬于手性Cα上的氫原子，因Cα立體構(gòu)型及苯環(huán)的空間位阻導(dǎo)致與Cα相鄰亞甲基上的兩個(gè)氫原子相對(duì)于Cα氫原子的空間位置分別在Cα—C鍵的同側(cè)（化學(xué)位移3.47）和異側(cè)（化學(xué)位移3.83），其中同側(cè)氫原子與Cα氫原子的耦合常數(shù)為10.8Hz，異側(cè)氫原子與Cα氫原子的耦合常數(shù)較小為4.8Hz，而亞甲基的兩個(gè)非等位氫原子間的耦合常數(shù)為14.8Hz。對(duì)于3S/3R-PheNA，其Cα相鄰亞甲基相連基團(tuán)為羧基，空間位阻較小，導(dǎo)致與Cα相鄰亞甲基的C—C單鍵可自由旋轉(zhuǎn)，該亞甲基上的兩個(gè)氫原子的核自旋環(huán)境相同，因此Cα氫（化學(xué)位移6.38）為三重峰而亞甲基氫（化學(xué)位移3.46）為雙峰。兩對(duì)對(duì)映異構(gòu)體具有相反的旋光性且大小相近，進(jìn)一步表明，類似物保留了手性氨基酸原料的立體化學(xué)。

圖2 手性NAD類似物對(duì)映體的合成

2.2 手性NAD類似物作為氧化還原輔酶的活性及動(dòng)力學(xué)

2.2.1 P450 BM3 R966D/W1046S 利 用 手 性NAD 類似物的活性

為了確定氧化還原酶是否僅偏好一種手性NAD類似物對(duì)映體，選擇利用還原型BNA（BNAH）為輔因子來催化脂肪酸羥基化的P450 BM3 突變體P450 BM3 R966D/W1046S[24]。 P450 BM3 R966D/W1046S活性測(cè)定是利用經(jīng)Na2S2O4原位還原的手性NAD 類似物為輔因子，以12-pNCA 為模式底物進(jìn)行的[37]。其中12-pNCA 被氧化為ω-氧十二烷酸和對(duì)硝基苯酚，對(duì)硝基苯酚在410nm處有吸收。以不添加輔因子樣品為陰性對(duì)照，以商品化β-NADH或合成的BNAH 為陽性對(duì)照，測(cè)定結(jié)果（圖3）表明P450 BM3 R966D/W1046S 對(duì)所有還原型輔因子都有活性，而對(duì)陰性對(duì)照無活性，表明酶活性的確是由原位還原的輔因子引起的，而不是的Na2S2O4自身。盡管P450 BM3 R966D/W1046S 對(duì)還原型手性NAD 類似物的活性比陽性對(duì)照的活性低，但重要的是，P450 BM3 R966D/W1046S對(duì)L-PheNAH和3S-PheNAH 的活性比其對(duì)映體的活性高得多，這表明P450 BM3 R966D/W1046S更偏好S構(gòu)型的輔因子而不是R構(gòu)型的輔因子。

圖3 P450 BM3 R966D/W1046S對(duì)還原型手性NAD類似物的活性

2.2.2 P450 BM3 R966D/W1046S 利 用 手 性NAD 類似物的動(dòng)力學(xué)

測(cè)定P450 BM3 R966D/W1046S 對(duì)不同還原型輔因子的動(dòng)力學(xué)，酶反應(yīng)速率對(duì)輔因子濃度曲線為雙曲線且輔因子濃度和飽，表明P450 酶動(dòng)力學(xué)曲線符合Michaelis-Menten 方程曲線（圖4）。手性NAD 類似物對(duì)映體之間的動(dòng)力學(xué)曲線存在明顯差異，L-PheNAH 和3S-PheNAH 的最大反應(yīng)速率vmax值均高于其對(duì)映體[圖4(a)]。P450 酶對(duì)原位還原的BNAH 和β-NADH 的動(dòng)力學(xué)特征與P450 酶對(duì)陽性對(duì)照的合成BNAH和商品化β-NADH的動(dòng)力學(xué)特征非常相似，具有基本相同的Vmax[圖4(b)]，以上結(jié)果證明利用原位還原輔因子測(cè)定動(dòng)力學(xué)是可行的。

圖4 P450 BM3 R966D/W1046S對(duì)NADH及類似物的動(dòng)力學(xué)曲線

P450 BM3 R966D/W1046S 對(duì)不同還原型輔因子的動(dòng)力學(xué)具體數(shù)據(jù)見表1。P450 BM3 R966D/W1046S 對(duì)L-PheNAH 的Km值 是D-PheNAH 的37%，對(duì)L-PheNAH 的催化效率（Kcat/Km） 比DPheNAH 高3.4 倍，表明P450 BM3 R966D/W1046S對(duì)L-PheNAH 有更高的親和力和催化效率。相似地，與3R-PheNAH 相比，P450 酶對(duì)3S-PheNAH的催化效率提高了4.0 倍。需要注意的是，原位還原的BNAH 和β-NADH 的Km值高于陽性對(duì)照的合成BNAH和商品化NADH，這可能是由Na2S2O4還原反應(yīng)的不完全性或副反應(yīng)引起的[38]，因?yàn)槊笜?biāo)儀測(cè)定100μL體系中輔因子的摩爾消光系數(shù)，其中原位還原的BNAH 和NADH 的摩爾消光系數(shù)分別為0.70L/mmol 和0.71L/mmol， 均 低 于 合 成BNAH（1.73L/mmol）和商品化NADH（1.09L/mmol）；因此需要較高的原位還原輔因子濃度來達(dá)到最大反應(yīng)速率，從而表現(xiàn)出較高Km值。然而，原位還原BNAH 和β-NADH 的Kcat值與它們的陽性對(duì)照物相同，表明P450 酶對(duì)相同還原輔因子的具有相同的內(nèi)在催化性能。綜上所述，P450 BM3 R966D/W1046S 更傾向于利用S-PheNAH 而不是RPheNAH，并且手性NAD類似物中Cα的立體構(gòu)型對(duì)P450酶的活性有影響。

表1 P450 BM3 R966D/W1046S對(duì)NADH及類似物的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)

值得注意的是，如果將β-NAD 煙酰胺環(huán)、Cα及Cα氫原子與NAD 類似物的對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)保持在同一平面，3S-PheNA的羧基與β-NAD的Cα所在核糖環(huán)的2,3-位羥基同側(cè)，且同為極性基團(tuán)。而如果將β-NAD的Cα所在核糖環(huán)的C4—O鍵斷裂使O連接在Cα上，并使其煙酰胺環(huán)、Cα及其氫原子與NAD 類似物的對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)保持在同一平面，則β-NAD 中Cα上O 原子與L-PheNA 的羧基在平面同側(cè)，而β-NAD 中大位阻的腺嘌呤核糖二磷酸核糖基與LPheNA 的芐基位于平面另一側(cè)。因此手性NAD 類似物的立體構(gòu)型及取代基極性等因素導(dǎo)致P450 BM3 R966D/W1046S偏好S-構(gòu)型PheNAH。

2.2.3SsGDH I192T/V306I利用NAD類似物的活性

為測(cè)定其他氧化還原酶利用手性NAD 類似物的活性，SsGDH因其具有較松馳的輔因子特異性[22]被選擇。已報(bào)道SsGDH 可以利用簡(jiǎn)單的NAD 類似物，而且突變體SsGDH I192T/V306I 對(duì)P2NA 具有較高的活性[22]。SsGDH I192T/V306I 對(duì)手性NAD 類似物測(cè)定結(jié)果見表2，SsGDH I192T/V306I 僅對(duì)BNA 和β-NAD 有活性，對(duì)手性NAD 類似物均無活性。因L/D-PheNA 和3R/3S-PheNA 可以用氫原子取代與Cα相連的羧基和羧基甲基簡(jiǎn)化為P2NA 和BNA，酶活性結(jié)果表明羧基或羧基甲基的存在會(huì)對(duì)SsGDH I192T/V306I 輔因子結(jié)合袋的相互作用產(chǎn)生不利影響。此外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持氧化還原酶的輔因子結(jié)合袋可能預(yù)先決定了手性環(huán)境，因此合成的手性NAD 類似物的立體化學(xué)是與酶蛋白形成有效分子間相互作用的重要因素。因此建議未來通過定向進(jìn)化[39]等先進(jìn)方法改造NAD 依賴的氧化還原酶以利用手性NAD類似物。

表2 SsGDH I192T/V306I對(duì)NADH及類似物的活性

3 結(jié)論

本文利用三乙胺為質(zhì)子傳遞促進(jìn)劑，通過Zincke 鹽與光學(xué)純氨基酸在室溫下的胺交換反應(yīng)，制備了兩對(duì)手性NAD 類似物非對(duì)映體。原位還原的手性NAD 類似物均可作為P450 BM3 R966D/W1046S 的輔因子參與P450 催化的氧化反應(yīng)，但P450 酶更偏好于利用S 構(gòu)型手性NAD 類似物而不是R 構(gòu)型手性NAD 類似物。結(jié)果表明需要設(shè)計(jì)更多的手性NAD 類似物來提高對(duì)氧化還原酶的催化活性。