楊 陽(yáng)， 邱天宇， 袁 曉， 孫嘉笛， 張銀志， 孫秀蘭*， 紀(jì) 劍

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊830052；3.廣州廣電計(jì)量檢測(cè)股份有限公司，廣東 廣州510627）

黃曲霉毒素（aflatoxins，AFT）是一種有毒的真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物，其主要由黃曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）等產(chǎn)生[1]。在真菌毒素中黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）的毒性最大，其污染事件在各種食品和飼料中頻繁發(fā)生，嚴(yán)重威脅著人和動(dòng)物的健康[2-5]。研究表明，全球每年新增的肝癌病例中有2.52萬(wàn)～15.50萬(wàn)例與黃曲霉毒素污染有關(guān)，2017年世界衛(wèi)生組織將毒性最強(qiáng)的AFB1列為Ⅰ類(lèi)致癌物[6-7]。我國(guó)南方地區(qū)高溫高濕的環(huán)境，特別是長(zhǎng)江中下游地區(qū)每年的梅雨季節(jié)為霉菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)毒提供了更為便利的條件[8-10]。2011年在我國(guó)出口歐盟的花生中多次檢測(cè)出黃曲霉毒素超標(biāo)，其超標(biāo)量達(dá)2～240μg/kg，不僅造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還嚴(yán)重影響了我國(guó)花生在國(guó)際市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)力。因此，對(duì)黃曲霉毒素脫毒的研究具有重大意義。

黃曲霉毒素的脫除方法有物理、化學(xué)和生物方法[11-14]。與物理和化學(xué)方法相比，生物方法是一種環(huán)保、高效、安全的脫毒方法[15]，它利用生物體自身對(duì)毒素的吸附或代謝物對(duì)毒素的降解作用達(dá)到減少或去除黃曲霉毒素的目的。Hernandez-mendoza等[16]篩選了一株干酪乳桿菌，對(duì)黃曲霉毒素有很好的吸附作用，并能形成一種穩(wěn)定性很好的菌體-黃曲霉毒素復(fù)合物。陰佳璐等[17]研究了一株對(duì)AFB1有降解效果的渾濁紅球菌，并發(fā)現(xiàn)其培養(yǎng)液對(duì)AFB1的降解率為93.24%，而胞內(nèi)提取物的降解率僅為9.82%。Zhang等以香豆素為唯一碳源，從飼料原料中篩選得到的一株黑曲霉菌株可在24 h內(nèi)降解58.2%的AFB1，且發(fā)酵液降解活性顯著高于菌絲體和菌絲體提取液[18]。李冰分離出一株對(duì)黃曲霉毒素降解率可達(dá)93.28%的黑曲霉，研究同樣表明降解活性物質(zhì)主要是來(lái)自黑曲霉胞外的代謝產(chǎn)物，證明黑曲霉產(chǎn)生的胞外降解酶對(duì)AFB1有降解作用[19]。

黑曲霉被公認(rèn)為是安全的工業(yè)發(fā)酵微生物，在有機(jī)酸和工業(yè)酶的生物生產(chǎn)中有著廣泛應(yīng)用[20-23]。作者所在研究小組先前從大豆醬醅中分離出的食品級(jí)安全菌株黑曲霉FS10可以有效抑制黃曲霉的生長(zhǎng)和AFB1的生物合成[24]。與其他降解菌株不同，黑曲霉FS10不僅顯示出較強(qiáng)的AFB1降解能力，而且在食品工業(yè)發(fā)酵中起著重要作用。作者將在先前的研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行探索，分別研究了黑曲霉FS10的菌懸液、孢子、菌絲體和發(fā)酵液對(duì)AFB1的脫除效果，并通過(guò)微觀(guān)結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究，探究在A(yíng)FB1刺激下黑曲霉FS10降解AFB1能力的變化。該研究中不僅更好地了解了黑曲霉FS10各組分對(duì)AFB1的降解特性，還提出了AFB1對(duì)降解菌株影響的新思路，為后期黃曲霉毒素脫除的研究和實(shí)際應(yīng)用提供了理論和實(shí)踐參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

1.1.1 菌株黑曲霉FS10（Aspergillus nigerFS10）由作者所在實(shí)驗(yàn)室從大豆醬醅中分離篩選并保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，編號(hào)為CCTCC NO M2013703。

1.1.2 培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDB培養(yǎng)基）：馬鈴薯300 g，葡萄糖20 g，氯霉素0.1 g，蒸餾水1 L；121℃高壓滅菌20 min。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：PDB培養(yǎng)基，瓊脂20 g；121℃高壓滅菌20 min。

1.2 試劑與儀器

AFB1標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）：新加坡普瑞邦生物工程有限公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈（色譜純）：美國(guó)TEDIA公司產(chǎn)品；三氯甲烷（分析純）：上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液、磷酸鹽緩沖液（PBS）：上海碧云天生物公司產(chǎn)品；總RNA提取試劑盒：天根生化科技有限公司。

WATERSMALDI SYNAPT Q-TOF-MS：美國(guó)沃特世公司產(chǎn)品；VB-40立式高溫高壓滅菌鍋：德國(guó)SYSTEC公司產(chǎn)品；BSC-1300超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；SHP-150生化培養(yǎng)箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；THZ-D臺(tái)式恒溫振蕩器：上海百典儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；EXOHOUS電子天平、旋渦振蕩儀：美國(guó)奧豪斯公司產(chǎn)品；Scientz-10N臺(tái)式冷凍干燥機(jī)、Scientz-10LS真空離心濃縮儀、SB-5200DT超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；Eppendorf離心機(jī)：德國(guó)艾本德公司產(chǎn)品；Milli-Q超純水儀：美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品；日立SU8020掃描電鏡：日本日立公司產(chǎn)品。

1.3 菌株活化及菌絲體、發(fā)酵液、孢子懸液制備

從-80℃取出黑曲霉FS10進(jìn)行復(fù)蘇，接種于PDA培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)5 d后，用含0.05%（體積分?jǐn)?shù)）吐溫80的無(wú)菌生理鹽水將孢子洗下，調(diào)整孢子濃度為106CFU/mL，作為黑曲霉FS10孢子懸液備用。

接種2%（體積分?jǐn)?shù)）的黑曲霉FS10孢子懸液于PDB培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱中在28℃、150 r/min的條件下分別培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h后，在無(wú)菌低溫條件下用快速真空抽濾，將菌絲體和濾液分別收集。所收集的菌絲體用PBS洗滌3次，再高溫滅活后放入無(wú)菌EP管中備用；所收集的濾液過(guò)0.22μm的無(wú)菌濾膜除去雜菌后，作為黑曲霉FS10發(fā)酵液備用。

1.4 AFB1的提取與檢測(cè)

取1 mL待測(cè)樣品溶液于分液漏斗中，加入等體積氯仿并上下振蕩5 min后靜置分層，收集下層氯仿層溶液，重復(fù)上述提取操作3次后將收集的液體合并，再將合并的液體通過(guò)AFB1免疫親和柱凈化，用真空冷凍干燥機(jī)將收集的洗脫液揮干，用1 mL甲醇水（V（甲醇）∶V（水）=1∶1）溶液復(fù)溶，充分振蕩混勻后，通過(guò)0.22μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，保存于棕色進(jìn)樣瓶中待檢測(cè)。

采用WATERSMALDI SYNAPT Q-TOF-MS對(duì)AFB1進(jìn)行檢測(cè)，色譜條件為：BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm）；流動(dòng)相：A為乙腈，B為甲酸銨溶液；進(jìn)樣量：5μL；流量：0.3 mL/min；柱溫：45℃；梯度洗脫如表1所示。

表1 梯度洗脫表Table 1 Gradient elution procedure

稱(chēng)取適量的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜級(jí)甲醇配成100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再用甲醇水溶液分別稀釋制得質(zhì)量濃度梯度為10、20、50、100、200、500、1 000 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。按上述色譜條件檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=21.964x+466.86，R2=0.995 5，其中x為AFB1質(zhì)量濃度，y為峰面積，R2相關(guān)系數(shù)。AFB1在10～1 000 ng/mL線(xiàn)性良好。

圖1 不同質(zhì)量濃度AFB1色譜圖和AFB1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Chromatogram of AFB1 in different concentrations and standard curve of AFB1

1.5 黑曲霉FS10不同組分對(duì)AFB1降解效果的研究

將106CFU/mL的黑曲霉FS10孢子懸液按2%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種至含有AFB1的PDB培養(yǎng)基中（AFB1終質(zhì)量濃度為1μg/mL），同時(shí)以含有相同AFB1質(zhì)量濃度的無(wú)菌PDB溶液作為空白對(duì)照組，均置于恒溫培養(yǎng)箱中在28℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)，分別培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h后取樣，提取AFB1后測(cè)定AFB1殘留量，計(jì)算AFB1殘余率，方法如下：

式中：I為AFB1殘余率，%；I0為降解前AFB1質(zhì)量濃度，μg/mL；I1為降解后AFB1質(zhì)量濃度，μg/mL。

將106CFU/mL的黑曲霉FS10孢子懸液分別吸取0、1、3、5、7、9 mL，再分別加入相應(yīng)質(zhì)量濃度AFB1和相應(yīng)體積無(wú)菌生理鹽水使AFB1終質(zhì)量濃度為1μg/mL、終體積均為10 mL。混勻后置于恒溫培養(yǎng)箱中在28℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)24 h后取樣，提取AFB1后測(cè)定AFB1殘留量，計(jì)算AFB1殘余率。

將不同培養(yǎng)時(shí)間滅活后的黑曲霉FS10菌絲體重懸于含有AFB1的PDB培養(yǎng)基中（AFB1終質(zhì)量濃度為1μg/mL），同時(shí)以含有相同AFB1質(zhì)量濃度的無(wú)菌PDB溶液作為空白對(duì)照組，均置于恒溫培養(yǎng)箱中在28℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)24 h后取樣，提取AFB1后測(cè)定AFB1殘留量，計(jì)算AFB1殘余率。

將不同培養(yǎng)時(shí)間的黑曲霉FS10發(fā)酵液吸取990μL置于EP管中，并加入10μL終質(zhì)量濃度為100μg/mL AFB1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，同時(shí)以含有相同AFB1質(zhì)量濃度的無(wú)菌PDB溶液作為空白對(duì)照組，均置于恒溫培養(yǎng)箱中在28℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)24 h后取樣，提取AFB1后測(cè)定AFB1殘留量，計(jì)算AFB1殘余率。

1.6 AFB1誘導(dǎo)黑曲霉FS10降解能力的研究

將106CFU/mL的黑曲霉FS10孢子懸液按2%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種至含有AFB1的PDB培養(yǎng)基中（AFB1終質(zhì)量濃度為1μg/mL），作為誘導(dǎo)組。同時(shí)以不含AFB1的PDB培養(yǎng)基作為未誘導(dǎo)對(duì)照組，均置于恒溫培養(yǎng)箱中在28℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)24 h后取樣，在無(wú)菌低溫條件下進(jìn)行快速真空抽濾，分離誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組上層菌體和下層發(fā)酵液，將上層菌體用PBS洗滌3次后重懸于含有1μg/mL AFB1的PBS溶液中；將下層發(fā)酵液990μL置于EP管中，并加入10μL終質(zhì)量濃度為100μg/mL AFB1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，同時(shí)以含有相同AFB1質(zhì)量濃度的無(wú)菌PDB溶液作為空白對(duì)照組。全部樣品置于恒溫培養(yǎng)箱中在28℃、150 r/min的條件下分別培養(yǎng)12、24、36 h，提取AFB1后測(cè)定AFB1殘留量，計(jì)算AFB1殘余率。

1.7 黑曲霉FS10掃描電鏡樣品的制備

將106CFU/mL的黑曲霉FS10孢子懸液按2%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種至含有AFB1的PDB培養(yǎng)基中（AFB1終質(zhì)量濃度為1μg/mL）和不含AFB1的PDB培養(yǎng)基中，分別為處理組和對(duì)照組，均置于恒溫培養(yǎng)箱中在28℃、150 r/min的條件下分別培養(yǎng)24、36、48 h后取樣，在低溫?zé)o菌條件下快速真空抽濾去除發(fā)酵液，用預(yù)冷過(guò)的PBS溶液洗滌菌體3次后取適量菌體轉(zhuǎn)移至EP管中，加入1 mL 4℃預(yù)冷的2.5%（體積分?jǐn)?shù)）戊二醛溶液，在4℃下固定過(guò)夜，吸出固定劑，用0.2 mol/L PBS溶液浸洗2次，10 min/次，再用4℃預(yù)冷的1%（體積分?jǐn)?shù)）OsO4溶液在4℃條件下固定1 h，用0.2 mol/L PBS溶液浸洗2次，10 min/次。然后用梯度乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)分別為30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）脫水，每個(gè)梯度乙醇溶液脫水2次，15 min/次。采用真空噴鍍法，將樣品安置于離蒸發(fā)源10～15 cm處的真空噴鍍儀的樣品臺(tái)進(jìn)行噴金（10 kV、220 s），噴鍍均勻后通過(guò)掃描電鏡觀(guān)察并拍攝。

1.8 黑曲霉FS10轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

將106CFU/mL的黑曲霉FS10孢子懸液按2%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種至含有AFB1的PDB培養(yǎng)基中（AFB1終質(zhì)量濃度為1μg/mL）和不含AFB1的PDB培養(yǎng)基中，分別為處理組和對(duì)照組，均置于恒溫培養(yǎng)箱中在28℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)36 h后取樣。在低溫?zé)o菌條件下快速真空抽濾去除發(fā)酵液，用預(yù)冷過(guò)的PBS溶液洗滌菌體3次后取適量菌體轉(zhuǎn)移至EP管中。將菌絲體破碎后，使用試劑盒提取RNA。將質(zhì)量合格的RNA保存在異丙醇中，委托南京派森諾基因科技有限公司進(jìn)行樣品的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為基于二代測(cè)序的Illumina平臺(tái)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉FS10菌懸液對(duì)AFB1脫除作用

黑曲霉FS10在PDB培養(yǎng)基生長(zhǎng)期間可顯著降解AFB1（見(jiàn)圖2）。在12 h后AFB1質(zhì)量濃度開(kāi)始降低，其中在12～36 h的降解速率最快，AFB1殘余率從85.08%降至29.78%。在72 h時(shí)AFB1殘余率僅為1.35%。結(jié)果表明，黑曲霉FS10菌株在生長(zhǎng)過(guò)程中可以有效脫除AFB1。

圖2 黑曲霉FS10菌懸液對(duì)AFB1脫除作用Fig.2 Removal of AFB1 by the fungal suspension of Aspergillus niger FS10

2.2 黑曲霉FS10孢子對(duì)AFB1脫除作用

由圖3可以看出黑曲霉FS10孢子懸液對(duì)AFB1的脫除效果與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，AFB1質(zhì)量濃度基本不隨孢子濃度的增加而變化，表明黑曲霉FS10孢子對(duì)AFB1無(wú)任何脫除作用，故而推測(cè)正常生長(zhǎng)狀態(tài)下的菌體及其發(fā)酵液可能具有脫除能力。

圖3 黑曲霉FS10孢子懸液對(duì)AFB1脫除作用Fig.3 Removal of AFB1 by the spores of Aspergillus niger FS10

2.3 黑曲霉FS10菌絲體對(duì)AFB1的吸附作用

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌絲體的生長(zhǎng)量越多，對(duì)AFB1的脫除效果越好。經(jīng)高溫滅活處理的菌絲體對(duì)AFB1有一定的脫除作用，這種作用可能是菌絲體具有一定的吸附能力引起的（見(jiàn)圖4）。已有研究表明微生物可通過(guò)與AFB1結(jié)合，形成菌體和AFB1復(fù)合物，該復(fù)合物整體趨于穩(wěn)定，且不易被動(dòng)物機(jī)體吸收，從而易排出體外，降低了AFB1對(duì)動(dòng)物的危害[25]。錢(qián)潘攀等[26]研究表明麝香草酚可誘導(dǎo)酵母細(xì)胞發(fā)生裂解，導(dǎo)致細(xì)胞壁上肽聚糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化并增強(qiáng)其對(duì)AFB1的吸附能力。但黑曲霉FS10吸附能力有限，與菌懸液脫除效果相比還存在較大差異，因此需對(duì)黑曲霉FS10發(fā)酵液組分進(jìn)行研究。

圖4 黑曲霉FS10菌絲體對(duì)AFB1脫除作用Fig.4 Removal of AFB1 by the mycelium of Aspergillus niger FS10

2.4 黑曲霉FS10發(fā)酵液對(duì)AFB1脫除作用

不同培養(yǎng)時(shí)間的發(fā)酵液在一定時(shí)間內(nèi)對(duì)AFB1脫除作用有明顯差異（見(jiàn)圖5）。可以推測(cè)出黑曲霉FS10培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，其發(fā)酵液對(duì)AFB1脫除效果越好，說(shuō)明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，黑曲霉FS10發(fā)酵液中脫除AFB1的物質(zhì)隨之增加。在36 h后，具有降解能力物質(zhì)大量產(chǎn)出，AFB1的殘余率顯著下降?，F(xiàn)有研究報(bào)道部分微生物對(duì)真菌毒素的降解作用是由于其分泌了有特異性的胞外酶。Wang等[27]采用白腐真菌的過(guò)氧化物錳酶（MnP）降解AFB1，培養(yǎng)48 h后AFB1的最大消除率達(dá)到86.0%。為了研究AFB1處理是否對(duì)黑曲霉FS10脫除能力有積極的影響，作者進(jìn)一步研究了AFB1誘導(dǎo)后黑曲霉FS10的脫除變化。

圖5 黑曲霉FS10發(fā)酵液對(duì)AFB1脫除作用Fig.5 Removal of AFB1 by the culture filtrate of Aspergillus niger FS10

2.5 AFB1對(duì)黑曲霉FS10脫除能力的誘導(dǎo)作用

如圖6（a）所示，AFB1刺激誘導(dǎo)24 h后的黑曲霉FS10對(duì)比未做處理的黑曲霉FS10發(fā)現(xiàn)，菌體誘導(dǎo)組對(duì)AFB1脫除效果有一定提升，但效果不顯著，可能由于短時(shí)間AFB1刺激對(duì)黑曲霉FS10生長(zhǎng)有一定抑制作用導(dǎo)致黑曲霉FS10菌體數(shù)量有限，其吸附能力在此時(shí)變小，但誘導(dǎo)組比未誘導(dǎo)組提前適應(yīng)毒素環(huán)境，大膽猜測(cè)可能AFB1進(jìn)入黑曲霉FS10菌株內(nèi)并參與了該菌株的代謝促進(jìn)產(chǎn)出更多有降解能力的物質(zhì)。而圖6（b）所示，誘導(dǎo)黑曲霉FS10后發(fā)酵液對(duì)AFB1的脫除作用明顯得到提升，36 h后脫除率提升了10.01%。從菌株降解能力層面來(lái)看，AFB1的刺激對(duì)黑曲霉FS10產(chǎn)生了積極的影響。本研究結(jié)果充分說(shuō)明了在A(yíng)FB1刺激下，黑曲霉FS10菌株發(fā)酵液脫除AFB1能力上升，推斷AFB1處理可以使黑曲霉產(chǎn)生更多的孢外降解蛋白。

圖6 AFB1對(duì)黑曲霉FS10脫除能力誘導(dǎo)作用Fig.6 Induction effect of AFB1 on Aspergillus niger FS10 removal ability

2.6 AFB1對(duì)黑曲霉FS10微觀(guān)形態(tài)的影響

為了進(jìn)一步研究黑曲霉FS10在A(yíng)FB1降解過(guò)程中的變化，分別選取了24、36、48 h 3個(gè)AFB1降解速率最快的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行黑曲霉FS10微觀(guān)結(jié)構(gòu)的分析。如圖7所示，可以觀(guān)察到24 h時(shí)，相較于對(duì)照組，AFB1處理組出現(xiàn)了明顯的皺縮，這表明AFB1刺激對(duì)黑曲霉FS10正常生長(zhǎng)產(chǎn)生了一定的影響；36 h時(shí)，AFB1處理組相較于對(duì)照組雖然仍有明顯皺縮，但與24 h時(shí)相比這種皺縮現(xiàn)象明顯減弱；而48 h時(shí)相較于對(duì)照組而言，處理組并未發(fā)現(xiàn)明顯的皺縮現(xiàn)象。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是：1）黑曲霉FS10對(duì)毒素環(huán)境已經(jīng)產(chǎn)生了一定的適應(yīng)能力；2）毒素被降解，毒素含量有明顯降低從而對(duì)其影響減小。

圖7 AFB1對(duì)黑曲霉FS10形態(tài)的影響Fig.7 Effect of AFB1 on Aspergillus niger FS10 morphology

2.7 AFB1對(duì)黑曲霉FS10轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

2.7.1 差異基因表達(dá)分析火山圖展示的是基因分布情況及基因的表達(dá)倍數(shù)差異和顯著性的結(jié)果，正常狀況下，該圖左右差異基因分布應(yīng)大致對(duì)稱(chēng)。如圖8所示，左側(cè)為AFB1處理組相比于對(duì)照組的下調(diào)基因，右側(cè)為AFB1處理組相比于對(duì)照組的上調(diào)基因。對(duì)照組和處理組共有差異基因15 545個(gè)，其中顯著表達(dá)的差異基因有27個(gè)，顯著上調(diào)的基因?yàn)?個(gè)，顯著下調(diào)的基因?yàn)?5個(gè)。

圖8 差異基因火山圖Fig.8 Volcano map of differentially expressed genes

2.7.2 差異基因功能富集分析GO富集分析主要包括細(xì)胞組分（cellcular component，CC）、分子功能（molecular function，MF） 和 生 物 過(guò) 程（biological process，BP）3類(lèi)[28]，GO富集分析結(jié)果顯示，15 545個(gè)差異基因中共有8 221個(gè)差異基因被顯著富集到183個(gè)GO條目，占所有差異基因轉(zhuǎn)錄本的52.8%。如圖9所示，挑選每個(gè)GO分類(lèi)中P-value最小，即富集最顯著的前10個(gè)GO條目進(jìn)行展示，在細(xì)胞組分類(lèi)別中，細(xì)胞的胞外區(qū)、膜的組成部分、膜的固有成分等是最有代表性的GO術(shù)語(yǔ)；在分子功能類(lèi)別中蘋(píng)果酸酶活性、蘋(píng)果酸脫氫酶活性、血紅素結(jié)合等富集較為顯著；在生物過(guò)程類(lèi)別中，L-蛋氨酸生物合成過(guò)程、蘋(píng)果酸代謝過(guò)程、腺嘌呤生物合成過(guò)程、細(xì)胞對(duì)過(guò)氧化氫的反應(yīng)等較為顯著。

圖9 差異基因GO富集柱狀圖Fig.9 GO enrichment histogram of differentially expressed genes

KEGG是一個(gè)整合了基因組信息、生化系統(tǒng)功能信息和化學(xué)信息的綜合性數(shù)據(jù)庫(kù)[29]。結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異顯著基因參與的相關(guān)代謝通路進(jìn)行富集，由圖10可知差異基因共富集到11個(gè)相關(guān)的代謝通路，其主要參與了丙酮酸代謝、硒化合物代謝、色氨酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、MAPK信號(hào)通路、氧化磷酸化等。

圖10 差異基因KEGG富集散點(diǎn)圖Fig.10 KEGG enrichment scatter plot of differentially expressed genes

三羧酸循環(huán)是生物體內(nèi)普遍存在的代謝途徑，丙酮酸是進(jìn)入三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵代謝物[30]，與丙酮酸生成有關(guān)基因PPSA、MAEB的下調(diào)，可能會(huì)減少丙酮酸的生成，從而導(dǎo)致三羧酸循環(huán)通量降低，減小能量產(chǎn)生；氧化磷酸化有關(guān)基因COX3的下調(diào)同樣會(huì)造成能量生產(chǎn)的減少。這可能是AFB1對(duì)黑曲霉的生長(zhǎng)造成一定的影響，從而導(dǎo)致黑曲霉產(chǎn)生一種自我保護(hù)機(jī)制。CAT是細(xì)胞防御體系重要的抗氧化酶，能夠催化氧化還原反應(yīng)清除活性氧，抵御氧化性損傷[31]，AFB1處理會(huì)造成黑曲霉FS10氧化性損傷的產(chǎn)生，但隨著AFB1被降解，氧化損傷得以緩解，從而造成36 h時(shí)CAT的下調(diào)，這一推測(cè)與圖7中的微觀(guān)形態(tài)研究結(jié)果相一致。MetE編碼的蛋氨酸合酶和MetH編碼的甲硫氨酸合酶是蛋氨酸合成的關(guān)鍵酶，這兩個(gè)基因的上調(diào)表明AFB1的降解可能與蛋氨酸的合成有一定的關(guān)系。研究表明MetE和MetH都能與Zn2+結(jié)合來(lái)激活同型半胱氨酸（Hcy），Hcy是蛋氨酸生物合成的最后一步[32]，先前作者所在課題組在黑曲霉FS10降解玉米赤霉烯酮（ZEN）的研究中發(fā)現(xiàn)，螯合掉發(fā)酵液中金屬離子后降解效果明顯減弱[33]，這為作者的猜想提供了一定的依據(jù)。

3 結(jié) 語(yǔ)

通過(guò)對(duì)黑曲霉FS10不同組分脫除AFB1作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)黑曲霉FS10菌懸液對(duì)AFB1脫除效果最好，72 h時(shí)AFB1殘余率僅剩1.35%，即脫除率高達(dá)98.65%。黑曲霉FS10孢子對(duì)AFB1無(wú)明顯脫除作用，但菌絲體對(duì)AFB1有一定的吸附作用。黑曲霉FS10發(fā)酵液中可能存在某種對(duì)AFB1有降解能力的特異性物質(zhì)，因此黑曲霉FS10發(fā)酵液對(duì)AFB1有明顯脫除效果。經(jīng)過(guò)AFB1提前刺激誘導(dǎo)黑曲霉FS10，其發(fā)酵液脫除AFB1能力有明顯的提升，36 h后脫除率提升了10.01%，推測(cè)可能由于A(yíng)FB1進(jìn)入黑曲霉FS10菌株內(nèi)并參與了該菌株的代謝，促進(jìn)其產(chǎn)出更多有降解能力的物質(zhì)。不同AFB1刺激時(shí)間下黑曲霉FS10的微觀(guān)形態(tài)表現(xiàn)出隨著AFB1刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，黑曲霉FS10菌體表面皺縮會(huì)向正常方向好轉(zhuǎn)，推測(cè)黑曲霉FS10已經(jīng)適應(yīng)毒素環(huán)境或者此時(shí)毒素含量有明顯降低從而對(duì)其影響減小。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，AFB1主要引起能量代謝基因和抗氧化酶基因的下調(diào)，這可能是黑曲霉FS10受AFB1刺激后產(chǎn)生的一種自我保護(hù)反應(yīng)。蛋氨酸合成基因的上調(diào)表明AFB1的降級(jí)可能與蛋氨酸的合成有一定的關(guān)系，但具體的黑曲霉FS10降解AFB1的機(jī)理還需要進(jìn)一步探究。