李 娜， 曲音波， 楊培龍， 余曉斌， 羅 瑋*

（1.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122；2.山東大學 微生物技術國家重點實驗室，山東 青島266237；3.中國農業(yè)科學院飼料研究所 農業(yè)農村部飼料生物技術重點實驗室，北京100081）

三孢布拉霉（Blakeslea trispora）是一種重要的絲狀真菌，因其具有類胡蘿卜素積累量高、工藝相對簡單、成本較低和易于提取等優(yōu)點，可用于工業(yè)大規(guī)模生產類胡蘿卜素。目前，對于三孢布拉霉的研究主要集中在通過傳統誘變選育手段獲得類胡蘿卜素高效合成菌株，但該技術工作量大、效率低，且獲得的菌株容易出現退化[1]。采用系統代謝工程策略和合成生物學技術無疑是解決上述問題的最好替代方法，但是目前缺乏針對三孢布拉霉的高效遺傳轉化工具。

根癌農桿菌介導轉化（Agrobacterium tumefaciensmediated transformation，ATMT）是依靠T-DNA在誘導條件下轉移基因到宿主基因組中的能力，將外源基因導入宿主的轉化技術[2]，已成功在卷枝毛霉[3]、里氏木霉[4]等絲狀真菌得到應用。相比于其他遺傳轉化方法，ATMT具有轉化效率高、侵染受體選擇多樣等優(yōu)點[5]，已是絲狀真菌遺傳轉化系統中常用的方法。黃瓊瑤[6]首次證明農桿菌介導三孢布拉霉孢子遺傳轉化的可行性。但在研究中發(fā)現農桿菌介導的孢子轉化法難以得到轉化子，其原因可能是孢子細胞壁厚的緣故。

由ku80基因編碼的ku80蛋白是組成ku蛋白的兩個亞基之一，最早是在患有多肌炎硬皮病重疊綜合征的日本姓ku的患者血清中發(fā)現[7]，因該亞基的相對分子質量大小為83 000，故命名為ku80[8]。Ku80參與的非同源末端連接（NHEJ）修復途徑，是造成三孢布拉霉等絲狀真菌敲除困難的原因之一[9]。有研究表明對絲狀真菌中涉及NHEJ的相關基因進行敲除后，能夠提高同源重組（HR）頻率[10]，比如在黑曲霉[11]、粗糙脈孢霉[12]、大麗花輪枝孢[13-14]、里氏木霉[15]中均有研究報道。本研究中通過根癌農桿菌介導三孢布拉霉原生質體轉化的方法，導入敲除片段進三孢布拉霉基因組，從而實現ku80基因的敲除。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒野生型三孢布拉霉（Blakeslea trispora）負菌NRRL2896、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、質粒pDHt-sk、質粒pCSN44：作者所在實驗室保藏；根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404：購自蘇州金唯智公司；載體pMD18-T：購自大連寶生物工程有限公司。

1.1.2 抗生素和試劑卡那霉素、利福平、潮霉素B、頭孢噻肟鈉、乙酰丁香酮（AS）：上海生物工程公司產品；DNA抽提試劑盒、膠回收試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司產品；HiScript II One Step RTPCR Kit（Dye Plus）試劑盒、EsTaq聚合酶：南京諾唯贊生物公司產品；高保真酶PrimerSTAR Max酶，限制性內切酶SmaⅠ、XhoⅠ：TaKaRa公司產品；溶壁酶、纖維素酶、蝸牛酶：北京索萊寶公司產品；引物合成及測序：蘇州金唯智公司提供；其他試劑：國藥集團化學試劑有限公司產品。

1.1.3 培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L）用于大腸桿菌DH5α和根癌農桿菌LBA4404的培養(yǎng)；糖度5°麥汁培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基（玉米粉30 g/L，大豆粉50 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L；pH 6.5）用 于 三 孢 布 拉 霉NRRL2896的培養(yǎng)。

1.1.4 引物實驗中用到的引物序列見表1。

表1 實驗中用到的引物Table 1 Primers used in this experiment

1.2 方法

1.2.1 三孢布拉霉ku80基因的克隆在NCBI中，根據瓜笄霉ku80（OBZ83437.1）蛋白質序列，在三孢布拉霉全基因組中進行tblast，找到ku80基因序列，設計Ku80-F和Ku80-R引物擴增得到Btku80基因（三孢布拉霉的ku80基因）。以提取的RNA為模板，使用HiScript II One Step RT-PCR Kit（Dye Plus）試劑盒直接擴增出Btku80 cDNA序列。

1.2.2 敲除載體pDH-85H3構建挑取部分三孢布拉霉野生型菌絲接種于種子培養(yǎng)基中，25℃、180 r/min培養(yǎng)48 h，液氮研磨后按照基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA。以基因組DNA為模板，以85-F和85-R為引物擴增ku80基因的5′同源臂，以83-F和83-R為引物擴增ku80基因的3′同源臂。以質粒pCSN44為模板，以8H-F和8HR為引物擴增編碼HygR（潮霉素抗性基因）的DNA片段。以上3個片段均使用高保真酶PrimerSTAR Max酶擴增，并通過重疊延伸PCR技術連接起來，得到敲除片段85H3，隨后通過SmaⅠ、XhoⅠ雙酶切連接至雙元載體pDHt-sk，得到敲除載體pDH-85H3。敲除原理見圖1，敲除載體具體構建過程見圖2。

圖1 Btku80基因敲除原理示意Fig.1 Gene replacement strategy of Btku80

圖2 敲除質粒pDH-85H3構建示意Fig.2 Construction procedure of knock-out vector p DH-85H3

1.2.3 敲除載體轉化根癌農桿菌LBA4404制備根癌農桿菌LBA4404感受態(tài)細胞，方法如Jyothishwaran等[16]所述。取根癌農桿菌感受態(tài)細胞100μL，加1.5μL質粒，冰浴30 min；放入液氮中速凍1 min，37℃溫浴5 min，冰浴3 min；加入LB液體培養(yǎng)基300μL，200 r/min、28℃搖床培養(yǎng)3.5 h；隨后4℃、8 000 r/min離心10 min，吸除上清液200 μL，剩下的輕輕吹吸混勻，涂于LB（含卡那霉素50 μg/mL）培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3 d。待平板上出現單菌落后，取單菌落接入50 mL LB液體培養(yǎng)基（含卡那霉素50μg/mL）中，200 r/min、28℃搖床培養(yǎng)過夜，提取質粒，進行PCR檢測。

1.2.4 三孢布拉霉原生質體的制備將在種子培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d的菌絲體8 000 r/min離心10 min，去上清液，使用滅菌稱量勺盡量刮取上層培養(yǎng)基，并用滅菌水洗2次菌絲體，然后每克菌絲體加入5 mL復合酶液，置于搖床上，28℃、75 r/min避光酶解4 h。其中復合酶液組成為：2 g/dL溶壁酶、3 g/dL纖維素酶、3 g/dL蝸牛酶，用穩(wěn)滲液0.6 mol/L NaCl溶解；pH 6.0。酶解獲得足夠多的三孢布拉霉原生質體后，使用4層滅菌擦鏡紙過濾菌絲體，4℃、4 000 r/min離心10 min，去上清液并用穩(wěn)滲液重懸，得到三孢布拉霉原生質體懸浮液，計數并將原生質體細胞濃度稀釋到106個/mL備用。

1.2.5 根癌農桿菌介導三孢布拉霉原生質體轉化將根癌農桿菌LBA4404接種于含有50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min培養(yǎng)至OD600nm≈0.6備用。取根癌農桿菌200μL和三孢布拉霉原生質體200μL混合，加入終濃度為200 mmol/L的AS誘導，置于25℃、180 r/min共同培養(yǎng)2 d，再加入麥汁液體培養(yǎng)基過夜活化后，涂布于含有40μg/mL潮霉素B和150μg/mL頭孢噻肟鈉的麥汁培養(yǎng)基中，待長出單菌落后進行PCR驗證。

1.2.6 三孢布拉霉轉化子的鑒定采用堿裂解法[17]快速提取三孢布拉霉基因組。挑取少量菌絲體于80μL 0.5 mol/L氫氧化鈉溶液中浸泡15 s，隨后加入160μL 0.1 mol/L Tris-HCI中和混勻，取1μL上清液做模板。以快速提取的基因組為模板，使用引物對Ku80-F和Ku80-R、引物對8H1-F和8H1-R（或8H2-F和8H2-R）進行PCR擴增驗證，根據擴增片段的大小以及測序結果確定ku80基因是否被敲除。

2 結果與分析

2.1 三孢布拉霉ku80基因的克隆

經NCBI tblast比對，在野生型三孢布拉霉基因組中搜索到了與瓜笄霉ku80蛋白質序列相近的Btku80序列。提取基因組，以Ku80-F和Ku80-R為引物擴增Btku80基因全長。提取總RNA，經逆轉錄反應及PCR擴增，測序得到Btku80的CDS序列。得到的Btku80基因全長2 716 bp，CDS區(qū)2 202 bp，編碼732個氨基酸；保守域有3個，分別為vWFA、KU80、Ku-PK-bind domains。

2.2 敲除載體pDH-85H3的驗證

敲除載體pDH-85H3經SmaⅠ在30℃酶切2 h后，加入XhoⅠ，37℃再次酶切2 h，隨后進行核酸電泳，結果如圖3。結果顯示敲除載體pDH-85H3經SmaⅠ和XhoⅠ雙酶切后，出現了大小分別約為7 400 bp和4 400 bp的兩個片段，分別與質粒pDHtsk線性化大小、敲除片段大小一致，初步證明敲除載體pDH-85H3構建成功。

圖3 敲除載體pDH-85H3經雙酶切后的電泳圖Fig.3 Identification of knock-outvector pDH-85H3 digested by SmaⅠand XhoⅠ

2.3 含敲除載體的根癌農桿菌陽性克隆子的鑒定

采用化學轉化法將敲除載體pDH-85H3導入根癌農桿菌LBA4404，28℃培養(yǎng)，挑取單菌落提取質粒，使用引物8H-F和8H-R進行PCR擴增HygR基因并經電泳驗證，結果見圖4。由圖4可見，2～7號轉化子均得到片段大小約為1 400 bp的擴增產物，與HygR片段預期大小一致，且測序正確，說明敲除載體pDH-85H3已成功轉化進根癌農桿菌LBA4404中。

圖4 提取根癌農桿菌LBA4404中重組敲除載體pDH-85H3對其PCR產物的電泳分析Fig.4 Analysis of PCR products of recombinant vector pDH-85H3 extracted from Agrobacterium tumefaciens LBA4404

2.4 潮霉素B與頭孢噻肟鈉篩選壓力的選擇

野生型三孢布拉霉原生質體在含有潮霉素B質量濃度為0～100μg/mL的高滲再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)，發(fā)現潮霉素B質量濃度達到40μg/mL時，野生型三孢布拉霉不能生長，因此以40μg/mL潮霉素B作為三孢布拉霉轉化子的篩選壓力。

根癌農桿菌LBA4404在含有質量濃度為0～200 μg/mL頭孢噻肟鈉的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d后，發(fā)現頭孢噻肟鈉質量濃度達到150μg/mL時，根癌農桿菌完全不能生長，而三孢布拉霉生長不受頭孢噻肟鈉影響，因此篩選培養(yǎng)基中加入終質量濃度為150μg/mL的頭孢噻肟鈉來抑制根癌農桿菌生長。

2.5 三孢布拉霉轉化子的鑒定

受侵染的原生質體經活化后，涂布于含有40 μg/mL潮霉素B和150μg/mL頭孢噻肟鈉的麥汁培養(yǎng)基。頭孢噻肟鈉可以抑制根癌農桿菌在培養(yǎng)基上的生長，三孢布拉霉的生長不受影響，而潮霉素B對野生型三孢布拉霉有抑制作用，對于具有潮霉素抗性的轉化子的生長則無影響。經過潮霉素初篩，得到20個三孢布拉霉轉化子，結果見圖5（a）。為進一步確定潮霉素抗性基因是否插入且替換了ku80基因，對這20株轉化子進行PCR驗證，并對PCR產物進行sanger測序驗證。第一輪驗證轉化子中是否含有ku80基因，使用引物Ku80-F和Ku80-R進行擴增，擴增得到的ku80片段存在于野生型三孢布拉霉中，不存在于轉化子中，結果見圖5（b）。

第二輪驗證敲除片段。8H1-F和8H1-R引物擴增5′同源臂下部分和HygR基因上部分，得到8H1片段，大小約為1 180 bp，8H2-F和8H2-R引物擴增3′同源臂上部分和HygR基因下部分，得到8H2片段，大小約為1 800 bp。這兩個片段無法在野生菌中擴增得到，而能在轉化子擴增得到。20株轉化子經PCR擴增和sanger測序驗證發(fā)現，其中18株含有插入的敲除片段，轉化率高達90%，有2個轉化子是經過同源重組交換的正確敲除株，敲除率為10%，結果見圖5（c）。

圖5 三孢布拉霉轉化子的鑒定Fig.5 Identification of Blakeslea trispora transformants

3 結 語

對絲狀真菌基因功能的研究依賴于遺傳轉化系統的建立。絲狀真菌遺傳轉化方法有PEG介導的原生質體法、農桿菌介導侵染法、基因槍法、電激法等[18]。原生質體法轉化成功的關鍵在于原生質體的再生，因三孢布拉霉原生質體再生相對困難[6]，再生率小于10%[19]，難以得到轉化子[6]。基因槍法的原理是在高壓作用下，將表面包被有外源DNA的微小金粒或鎢粒，高速射入到受體細胞或組織，從而實現外源基因與受體基因組的整合[18]。黃瓊瑤[6]曾利用基因槍法，將融合基因表達載體導入到三孢布拉霉中，但影響其轉化成功的因素較多且成本較高[18]。電激法對部分絲狀真菌的轉化效率較低，應用受到限制[18]，尚未發(fā)現成功使用電激法進行三孢布拉霉遺傳轉化的研究。

相較于以上轉化方法，本研究中考慮使用根癌農桿菌轉化法，但如果以細胞壁極厚的孢子作為受體，很難侵染成功，因此首次將原生質體作為農桿菌轉化的受體，雖過程相對煩瑣，但轉化率得到了很大提高，可以用于三孢布拉霉遺傳轉化。

另外，以同源重組（HR）為基礎的基因敲除技術是進行基因功能研究的常用方法，但包括三孢布拉霉在內的大多數絲狀真菌因非同源末端連接（NHEJ）修復占主導[20-21]，同源重組頻率極低，降低了基因敲除的效率，因此有必要對參與NHEJ過程的基因進行破壞，以此促進HR[22]。本研究中發(fā)現利用同源重組原理敲除ku80基因，敲除率僅為10%，可見三孢布拉霉同源重組頻率較低，將來可以通過進一步研究，以此缺陷株為受體，來提高基因敲除效率[23]。