陳 兵，楊鈺雯

(江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院 信息工程學(xué)院，江蘇 句容 212400)

病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related proteins，PRs)是寄主與病原物相互作用過程中誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類蛋白，不僅在受侵染的組織中積累，在整個(gè)植株中都有表達(dá)[1]。目前已鑒定出17個(gè)不同的PRs家族，其中許多蛋白具有抗真菌活性[2]。PR5蛋白也稱為類甜蛋白(thaumatin-like protein，TLP)，是PRs中非常重要的蛋白之一。有研究證明，TLP不僅能誘導(dǎo)真菌細(xì)胞的程序性死亡，抑制真菌侵染；還能誘導(dǎo)植物細(xì)胞的程序性死亡，激活植物防衛(wèi)反應(yīng)信號(hào)途徑，增強(qiáng)植物抗逆境能力。目前已經(jīng)從番茄[3]、玉米[4]、小麥[5]、大豆[6]等多種植物中克隆到TLP基因。研究發(fā)現(xiàn)，植物基因組中TLP以基因家族的形式出現(xiàn)，如擬南芥[7]、水稻[7]、楊樹[8-9]、蕪菁[10]基因組中分別有28，31，55，20個(gè)TLPs基因。此外，具有抗逆功能的滲調(diào)蛋白(osmotin)和類滲調(diào)蛋白(OLP)，以及permatin、zeamatin等也屬于PR5家族[4]。

抗真菌活性是TLP的主要生理功能之一。其通過誘導(dǎo)孢子裂解、抑制孢子萌發(fā)、降低菌絲活力、消耗細(xì)胞膜勢能等方式，抑制不同的致病和非致病真菌侵染。TLP的抗真菌功能可能與其具有β-1,3-葡聚糖酶活性有關(guān)[4]。也有研究認(rèn)為，TLP和病原菌的互作與真菌特異質(zhì)膜組成介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)[11]。Gómez-Casado等[12]研究發(fā)現(xiàn)，TLP與病原菌的菌體蛋白存在互作，鏈格孢菌的過敏性蛋白Alt a 1可以抑制PR5-TLP蛋白的酶活性。

西瓜是重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，隨著市場需求的增加，我國西瓜種植面積和總產(chǎn)量將繼續(xù)保持穩(wěn)中有升的發(fā)展趨勢?？菸∈菄?yán)重制約西瓜生產(chǎn)的主要病害之一，為害嚴(yán)重時(shí)可造成西瓜減產(chǎn)80%以上甚至絕收?？菸∈且活愅羵骶S管束系統(tǒng)病害，由尖鐮孢菌西瓜?；?Fusariumoxysporumf.sp.niveum)侵染引起。根據(jù)西瓜枯萎病菌對(duì)不同鑒別寄主的抗感反應(yīng)，現(xiàn)已鑒定出4種尖鐮孢菌西瓜專化型的生理小種(0，1，2和3)[13]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，枯萎病菌侵染后西瓜類甜蛋白的表達(dá)豐度顯著升高，說明類甜蛋白可能在西瓜與枯萎病菌互作過程中發(fā)揮重要作用。在此基礎(chǔ)上，本研究對(duì)西瓜類甜蛋白家族進(jìn)行全基因組鑒定，利用生物學(xué)軟件對(duì)其序列特征、蛋白結(jié)構(gòu)和聚類進(jìn)行分析，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測其在西瓜不同組織和響應(yīng)枯萎病菌侵染后的表達(dá)模式，旨在為進(jìn)一步開展類甜蛋白家族基因的功能鑒定及其與枯萎病菌互作機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以8424西瓜為試驗(yàn)材料，在兩葉一心期，取根、莖、葉組織用于TLP基因組織特異性表達(dá)分析。同時(shí)，采用灌根法接種西瓜枯萎病菌孢子液(濃度為1×106CFU/mL)，分別于侵染后0，12，24，48，120，168 h 取根系組織。取樣時(shí)隨機(jī)選取3株混合。所有樣品液氮速凍，置于-80 ℃ 超低溫冰箱備用。

1.2 TLP家族成員鑒定及結(jié)構(gòu)域分析

以擬南芥TLP蛋白和西瓜Cla97C01G003090和Cla97C10G188000序列為探針，在西瓜基因組數(shù)據(jù)庫(http://cucurbitgenomics.org/)中搜索西瓜TLP同源序列。候選蛋白序列在 Pfam 數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)中對(duì)蛋白功能域進(jìn)行確認(rèn)。利用ProtParam(http://expasy.org/tools/protparam.html)在線分析氨基酸各種理化性質(zhì)。利用TargetP-2.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測。利 用 MEME (http://meme-suite.org/tools/meme)進(jìn)行TLP蛋白的氨基酸序列保守基序(Motif)分析，基序搜索數(shù)目為6，其他參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置。用SignalP 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行信號(hào)肽分析。

1.3 TLP家族啟動(dòng)子元件分析

從西瓜基因組數(shù)據(jù)庫中獲取西瓜TLP翻譯起始位點(diǎn)(ATG)上游2 000 bp的啟動(dòng)子序列。利用 PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/)分析啟動(dòng)子反應(yīng)調(diào)控元件，并利用 TBtools[14]軟件對(duì)特定表達(dá)元件的數(shù)量開展聚類分析。

1.4 TLP系統(tǒng)進(jìn)化分析

擬南芥TLP序列下載于TAIR網(wǎng)站(http://arabidopsis.org)；水稻TLP序列來自水稻基因組數(shù)據(jù)庫RGAP (http://rice.plantbiology.msu.edu/)。利用 Clustal X 2.1和GeneDoc軟件，對(duì)擬南芥、水稻和西瓜TLP氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)和序列分析。利用MEGA 5.05 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用鄰接法(neighbor joining，NJ)作圖，Bootstrap設(shè)置為1 000次，采用泊松校驗(yàn)(poisson correction)方法計(jì)算遺傳距離。

1.5 TLP表達(dá)模式分析

取西瓜根系、莖、葉組織和枯萎病菌侵染不同時(shí)間的西瓜根系組織，分別采用RNApure Plant kit (with DNaseI)(CWBiotech,China)試劑盒提取其總RNA，使用BU-SuperScript RT Kit (Biouniquer,China)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以西瓜18S RNA為內(nèi)參基因，用SuperReal PreMix (SYBR Green,TianGen,China)熒光定量PCR試劑盒在ABI PRISM7300 PCR系統(tǒng)中進(jìn)行擴(kuò)增。設(shè)置3次重復(fù)，采用2-ΔΔCt計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量[15]，利用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ClTLP基因家族的鑒定

在西瓜響應(yīng)枯萎病菌侵染的蛋白質(zhì)組分析中，檢測到2個(gè)類甜蛋白(Cla97C01G003090和Cla97C10G188000)的表達(dá)豐度顯著升高(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。以這2個(gè)類甜蛋白序列和擬南芥TLP蛋白序列為探針，在西瓜基因組數(shù)據(jù)庫中搜索西瓜TLP同源序列，共鑒定得到28個(gè)ClTLP成員(表1)。

表1 28個(gè)ClTLP基因家族信息Table 1 Information of 28 ClTLP gene family in watermelon

表1(續(xù)) Continued table 1

由表1可見，SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，除Cla97C03G-052620、Cla97C10G202990和Cla97C10G190620外，其余25個(gè)ClTLP家族成員均含有典型的索瑪甜(THN)結(jié)構(gòu)域。生理生化分析結(jié)果顯示，ClTLP家族蛋白氨基酸殘基數(shù)為73～353。蛋白等電點(diǎn)為4.35～9.41，酸性蛋白占64.3%，疏水性蛋白占60.7%。除6、7和9號(hào)染色體外，ClTLP家族基因在其余8對(duì)染色體上均有分布，其中8號(hào)染色體上基因成員最多(8個(gè))。

2.2 ClTLP蛋白結(jié)構(gòu)及聚類分析

對(duì)ClTLP家族基因蛋白結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果如圖1所示。

圖1 28個(gè)ClTLP家族基因結(jié)構(gòu)Fig.1 Gene structure of 28 ClTLP family in watermelon

由圖1可知，該家族基因蛋白結(jié)構(gòu)主要有4類，按其中內(nèi)含子數(shù)量不同分為0，1，2，3等4類，對(duì)應(yīng)基因數(shù)分別為4，12，10和2。對(duì)內(nèi)含子的相位類型分析結(jié)果顯示，在12個(gè)含有1個(gè)內(nèi)含子的西瓜ClTLP成員中，有10個(gè)為1型相位，2個(gè)為2型相位;10個(gè)含有2個(gè)內(nèi)含子的西瓜ClTLP成員中，8個(gè)屬于1-2型相位，1個(gè)為1-1型相位，1個(gè)為2-0型相位;含有3個(gè)內(nèi)含子的2個(gè)西瓜ClTLP成員分別為1-2-1型和1-1-0型相位。

對(duì)ClTLP家族基因編碼蛋白保守氨基酸Motif分析結(jié)果(圖2)顯示，有6類Motif的保守性較強(qiáng)，分別為Motif 1(VACKSACEAFNTPEYCCSG-EYNNPNTCKPSSYSKIFKSACPKAYSYAYDD)、Motif 2(GGLDFYDVSLVDGYNLPMSVTP-TGGTGGC)、Motif 3(APPGWSGRFWGRTGCSFDSSG)、Motif 4(ATFTIVNNCPYTVWPGILSGA)、Motif 5(GAGGTPPATLAEFTL)和Motif 6(STGCAADLNGQCPSELRVKSG)。其中，Cla97C-01G003090和Cla97C10G188000含有除Motif 1以外的5個(gè)保守Motif。Cla97C01G003080、Cla97C03-G052620和Cla97C10G202990分別僅含有Motif 5、Motif 1和Motif 3。除上述5個(gè)ClTLP外，其余ClTLP家族成員均含有6個(gè)保守的Motif，說明西瓜ClTLP家族蛋白較保守。

圖2 西瓜TLP保守氨基酸基序序列分布Fig.2 Positions of TLP conserved motif sequences in watermelon

為了解ClTLP蛋白與其他物種TLP蛋白的進(jìn)化關(guān)系，根據(jù)Shatters等[16]和Guo等[17]對(duì)TLPs家族基因的分類原則，分別選取擬南芥和水稻各10個(gè)TLPs蛋白，與24個(gè)ClTLP(去除短鏈)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。由圖3可見，本研究中選取的擬南芥和水稻的10個(gè)TLPs蛋白分別隸屬于10個(gè)類群，與前人研究結(jié)果[19-20]一致，24個(gè)ClTLP也聚為10個(gè)類群。其中，類群Ⅰ含1個(gè)成員，類群Ⅱ含3個(gè)成員，類群Ⅲ、Ⅳ各含1個(gè)成員，類群Ⅴ含2個(gè)成員，類群Ⅵ含5個(gè)成員，類群Ⅶ和Ⅷ各含4個(gè)成員，類群Ⅸ含1個(gè)成員，類群X含2個(gè)成員。

Cl代表西瓜TLP序列，AT代表擬南芥TLP序列，Os代表水稻TLP序列；標(biāo)尺為氨基酸置換概率Cl means watermelon TLP sequences,AT means Arabidopsis TLP sequences,Os means rice TLP sequences.The scale bar means changes of amino acid圖3 ClTLP蛋白與擬南芥和水稻TLPs蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree among TLPs protein from watermelon (Citrullus lanatus),Arabidopsis thaliana and Oryza sativa

2.3 ClTLP家族基因啟動(dòng)子作用元件分析

對(duì)西瓜TLP家族基因上游2 000 bp啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件進(jìn)行分析(圖4)發(fā)現(xiàn)，所有成員啟動(dòng)子區(qū)均含有多個(gè)啟動(dòng)子增強(qiáng)元件(CAAT-box)。所有ClTLP家族基因均含有一個(gè)或多個(gè)激素響應(yīng)元件，包括赤霉素響應(yīng)元件(GARE-motif，P-box，TATC-box)、水楊酸響應(yīng)元件(TCA-element)、脫落酸響應(yīng)元件(ABRE)、生長素響應(yīng)元件(AuxRR-core)和茉莉酸響應(yīng)元件(TGACG-motif和CGTCA-motif)。同時(shí)，部分基因包含多個(gè)脅迫響應(yīng)元件，包括干旱響應(yīng)MYB結(jié)合位點(diǎn)MBS、機(jī)械損傷響應(yīng)元件(WUN-motif)、光響應(yīng)MYB結(jié)合位點(diǎn)MRE、低溫響應(yīng)元件(LTR)、類黃酮生物合成MYB結(jié)合位點(diǎn)MBSI和防御性響應(yīng)元件(TC-rich repeats)。這些啟動(dòng)子作用元件在基因上的分布和數(shù)量不同，說明不同的基因可能參與不同的信號(hào)通路。

2.4 ClTLP家族基因表達(dá)分析

2.4.1 組織特異性表達(dá) 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，分析ClTLPs家族基因在西瓜根、莖、葉器官中的表達(dá)模式。結(jié)果(圖5)顯示，除Cla97C10G204510和Cla97C10G185260在所有檢測組織中都不表達(dá)外，其余26個(gè)CITLP基因在所有檢測組織中均有表達(dá)，說明其為組成型表達(dá)基因。其中，Cla97C01G003090、Cla97C01G019790和Cla97C04G074700表達(dá)相對(duì)較弱，其余基因表達(dá)較強(qiáng)。Cla97C01G019800表達(dá)量在3個(gè)器官中相當(dāng)，其余基因表達(dá)量在不同器官中各有不同，除Cla97C01G003090和Cla97C10G185250外，其余基因在根中表達(dá)量高于莖和葉。Cla97C01G003090基因在莖中表達(dá)量高于根和葉。ClTLP家族基因在葉中的表達(dá)量總體略低，僅Cla97C10G185250基因在葉片中表達(dá)量高于根和莖，而Cla97C01G019790在葉片中幾乎不表達(dá)。

圖4 西瓜TLP基因啟動(dòng)子順式作用元件分析Fig.4 Analysis of putative cis-acting elements in upstream promoter region of TLP genes

圖5 CITLP基因在西瓜不同組織中的表達(dá)特異性Fig.5 Expression specificity of CITLP genes in different watermelon organs

2.4.2 枯萎病菌侵染的誘導(dǎo)表達(dá) 枯萎病菌侵染后，利用qRT-PCR分析ClTLPs基因的誘導(dǎo)表達(dá)模式。結(jié)果(圖6)顯示，與在組織表達(dá)中一致，Cla97C10G204510和Cla97C10G185260在枯萎病菌侵染后不表達(dá)，而其他基因的表達(dá)均受到枯萎病菌的誘導(dǎo)。其中，Cla97C01G019790和Cla97C10G-185250隨著枯萎病菌侵染時(shí)間的延長，表達(dá)量逐漸升高，浸染168 h時(shí)達(dá)最高。Cla97C01G003080和Cla97C10G197610在枯萎病菌侵染前有微量表達(dá)，侵染12 h后表達(dá)被抑制，浸染24 h表達(dá)再次被誘導(dǎo)且達(dá)到峰值。此外，Cla97C10G188000、Cla97C10-G202990和Cla97C10G190620等3個(gè)基因表達(dá)在侵染后24 h達(dá)到高峰，而其他大部分基因表達(dá)量均在侵染后120 h達(dá)到峰值。

圖6 ClTLP家族基因在西瓜與枯萎病菌互作過程中的表達(dá)分析Fig.6 Expression of ClTLP gene in interaction of watermelon and Fusarium oxysporum

3 討 論

病程相關(guān)蛋白5家族在植物生長發(fā)育和脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。TLP為多基因家族，在擬南芥中有28個(gè)、水稻中44個(gè)、楊樹中55個(gè)。研究證明，基因家族數(shù)目可能與基因組進(jìn)化中染色體的重組事件或植株生長過程中的環(huán)境脅迫有關(guān)。本研究基于前期西瓜從枯萎病菌互作的蛋白組中挖掘到的高豐度表達(dá)類甜蛋白，進(jìn)行西瓜全基因組分析鑒定，獲得了28個(gè)西瓜TLP序列；并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)對(duì)各基因在不同組織器官及枯萎病菌侵染后的表達(dá)進(jìn)行了分析。

本研究通過序列分析發(fā)現(xiàn)，西瓜TLP家族成員分布在8條染色體上，且各染色體上的數(shù)目不同。其中10號(hào)染色體上分布有8個(gè)成員，3號(hào)和8號(hào)染色體上則各有4個(gè)成員，說明基因存在集中分布現(xiàn)象。這可能與西瓜基因組的全基因組復(fù)制事件有關(guān)[18]。西瓜TLP基因有4種結(jié)構(gòu)類型和7種不同的內(nèi)含子相位，類型較為豐富，說明西瓜TLP在復(fù)制時(shí)易發(fā)生可變剪切。內(nèi)含子相位相同的基因可能來源于共同祖先，也可能是染色體內(nèi)或染色體間復(fù)制擴(kuò)張的結(jié)果，本研究與對(duì)水稻TLP的分析結(jié)果[19]一致。

本研究的系統(tǒng)聚類分析結(jié)果顯示，西瓜TLP蛋白分為10個(gè)聚類群，與已報(bào)道的擬南芥[20]、楊樹[17]和水稻[19]結(jié)果一致，說明西瓜TLP蛋白有較強(qiáng)的保守性。有研究指出，TLP聚類分析中每個(gè)聚類群組功能各不相同，其中群組V成員最多，且與植物應(yīng)答病原菌脅迫有關(guān)[4,20]。本研究中，聚類群組Ⅵ中西瓜TLP數(shù)量最多，說明該組基因由于具有相同的生物學(xué)活性，而導(dǎo)致了基因的復(fù)制擴(kuò)張[17]。聚類群組Ⅴ中僅含有2個(gè)基因(Cla97C01G003090和Cla97C10G188000)，其是否參與西瓜響應(yīng)病原菌脅迫需進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究中西瓜TLP在10個(gè)聚類群中均有分布，也說明了其功能的多樣性。同時(shí)，在西瓜TLP家族基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與激素和脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，進(jìn)一步說明了其功能的復(fù)雜性，預(yù)示其在西瓜生長發(fā)育和脅迫應(yīng)答過程中可能具有重要作用。

前人研究結(jié)果顯示，TLP基因在植物不同組織器官中表現(xiàn)為組成型表達(dá)，且表達(dá)活性不盡相同[21]。本研究中，大部分西瓜TLP基因在根中的表達(dá)量最高，該結(jié)果與大豆[6]和水稻[18]中的多個(gè)TLP基因表達(dá)結(jié)果類似，說明這些基因可能在根系生長發(fā)育或根系響應(yīng)脅迫應(yīng)答中發(fā)揮作用。本研究中，Cla97C01G019800在所有器官中均有較強(qiáng)表達(dá)，說明其可能參與了西瓜整個(gè)生長過程，該結(jié)果與辣椒Capana00g000465[18]的表達(dá)結(jié)果一致。大多數(shù)ClTLP家族基因在葉片中表達(dá)量較低，僅Cla97C10G185250基因在葉片中高表達(dá)，說明該基因可能參與葉片的生長發(fā)育或脅迫應(yīng)答。另外，大量研究表明，不同植物中的TLP過表達(dá)均提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗真菌能力。在香蕉中高效表達(dá)水稻TLP能夠提高香蕉對(duì)4號(hào)枯萎病菌的抗性[22]。Zamani等[23]將黑麥TLP基因轉(zhuǎn)入油菜中，增強(qiáng)了油菜對(duì)菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)的抗性。在土豆中過量表達(dá)茶樹CsTLP基因提高了土豆對(duì)甘薯炭腐病菌(M.phaseolina)和晚疫病菌(P.infestans)的抗性[24]。本研究中，枯萎病菌侵染可以誘導(dǎo)大部分西瓜TLP基因的表達(dá)。聚類群組V中的2個(gè)基因表達(dá)各不相同，Cla97C10G188000表達(dá)量在侵染后24 h最高，推測該基因可能參與西瓜抗枯萎病菌的早期響應(yīng)；Cla97C01G003090表達(dá)在侵染后120 h達(dá)到峰值。另外，隨著枯萎病菌的侵染，Cla97C01G019790和Cla97C10G185250 兩個(gè)基因表達(dá)量逐漸升高，推測其在西瓜抗枯萎病菌侵染的整個(gè)過程中都發(fā)揮作用，下一步將重點(diǎn)對(duì)這幾個(gè)基因的功能進(jìn)行研究。