劉曉青 趙暉 耿興敏 李暢 肖政 蘇家樂

摘要：為明確杜鵑AsA-GSH循環(huán)在亞細(xì)胞水平上對高溫脅迫的響應(yīng)機制，以耐熱性不同的杜鵑品種胭脂蜜、紅珊瑚、紅月為試驗材料，分析高溫脅迫下AsA-GSH循環(huán)中還原型抗壞血酸（AsA）、還原型谷胱甘肽（GSH）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）和谷胱甘肽還原酶（GR）活性在細(xì)胞溶質(zhì)、葉綠體和線粒體中的變化。結(jié)果表明：胭脂蜜耐熱性高于紅珊瑚和紅月，高溫脅迫后MDA含量僅在紅月中顯著升高。高溫脅迫下胭脂蜜和紅珊瑚的AsA、APX和GSH主要存在于細(xì)胞溶質(zhì)中，其次是線粒體和葉綠體，GR的亞細(xì)胞分布為線粒體>葉綠體>細(xì)胞溶質(zhì)。紅月中4個AsA-GSH循環(huán)指標(biāo)的亞細(xì)胞分布與其他2個杜鵑品種不同，APX和GR在葉綠體中活性最高，AsA主要存在于線粒體，GSH則主要存在于細(xì)胞溶質(zhì)中。高溫脅迫下，3個杜鵑品種AsA含量在3個亞細(xì)胞組分中都有所升高，僅在胭脂蜜葉綠體中顯著下降;APX活性都有所升高，但僅在胭脂蜜和紅月細(xì)胞溶質(zhì)和紅月葉綠體中升高顯著;GR僅在胭脂蜜葉綠體中顯著升高，在紅月的細(xì)胞溶質(zhì)和線粒體中顯著下降;GSH在胭脂蜜葉綠體、紅珊瑚和紅月的細(xì)胞溶質(zhì)中顯著降低，在其他亞細(xì)胞中變化不顯著。本研究未發(fā)現(xiàn)杜鵑耐熱性強度與抗氧化指標(biāo)亞細(xì)胞分布之間存在相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：杜鵑;高溫脅迫;抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)

中圖分類號： S685.210.1? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）18-0128-06

收稿日期：2020-12-16

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31700627）;江蘇省自然科學(xué)基金（編號：BK20170607）;中央財政林業(yè)科技推廣示范資金（編號：蘇 [2018]TG02）;江蘇省林業(yè)發(fā)展專項資金（編號：蘇財資環(huán)[2020] 26號）。

作者簡介：劉曉青（1970—），女，山東青島人，研究員，主要研究方向為杜鵑花育種與栽培。E-mail：1376660436@qq.com。

通信作者：李暢，碩士，副研究員，主要從事觀賞植物種質(zhì)資源與遺傳育種研究。E-mail：changli529@foxmail.com。

抗壞血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循環(huán)是植物活性氧清除系統(tǒng)的重要組成部分[1]。APX和GR是AsA-GSH循環(huán)中重要的酶，以AsA和GSH為底物還原H2O2，并促進(jìn)AsA和GSH的循環(huán)再生[2]（表1）。有研究表明，葉綠體活性氧（ROS）可以通過超氧化物歧化酶（SOD）以及抗壞血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循環(huán)進(jìn)行清除[2]。葉綠體中AsA-GSH 循環(huán)在圓柏低溫脅迫響應(yīng)中發(fā)揮主要作用[3]。保持葉綠體AsA-GSH循環(huán)持續(xù)快速、有效運轉(zhuǎn)，降低葉綠體膜系統(tǒng)受傷害程度，維持葉肉細(xì)胞較強的光合活性，是耐鹽的菜用大豆維持較高的凈光合速率的重要生理基礎(chǔ)之一[4]。AsA-GSH循環(huán)在葉綠體ROS清除過程中發(fā)揮重要作用。同時，AsA-GSH循環(huán)也存在于細(xì)胞溶質(zhì)、線粒體、質(zhì)體和過氧化物酶體中[5-6]，對維持大部分亞細(xì)胞組分氧化還原平衡起著重要作用。AsA-GSH循環(huán)中抗氧化酶及抗氧化物質(zhì)在亞細(xì)胞分布上存在差異。三葉草在水脅迫下，AsA和GR的亞細(xì)胞分布為葉綠體>線粒體>細(xì)胞溶質(zhì)，而APX的亞細(xì)胞分布為葉綠體>細(xì)胞溶質(zhì)>線粒體[7]。高溫脅迫后，煙草AsA、GSH、APX和GR的亞細(xì)胞分布都為細(xì)胞溶質(zhì)>質(zhì)體>線粒體[8]。

杜鵑花作為我國傳統(tǒng)十大名花之一，具有很高的觀賞和應(yīng)用價值[9]。大部分杜鵑花屬植物的原始生境都是較陰涼濕潤的地區(qū)，忌炎熱和強光，因此高溫?zé)岷?dǎo)致植物發(fā)育停滯甚至死亡，是制約杜鵑花應(yīng)用于園林中的一個重要因素[10]。目前杜鵑高溫脅迫下活性氧清除系統(tǒng)研究主要集中于SOD、POD、CAT等抗氧化物酶活性的變化[11-14]，對AsA-GSH循環(huán)中APX和AsA的變化雖也有報道[12-13，15-16]，但針對AsA-GSH循環(huán)的研究以及其亞細(xì)胞定位分析尚未見報道。因此，本研究以前期篩選出的3種耐熱性不同的杜鵑為研究對象，進(jìn)行高溫脅迫，分析高溫脅迫后葉綠體、線粒體和細(xì)胞溶質(zhì)等亞細(xì)胞組分中AsA-GSH循環(huán)的抗氧化酶及抗氧化物質(zhì)的變化，以期能夠在亞細(xì)胞水平上明確杜鵑AsA-GSH循環(huán)在高溫脅迫下的活性氧調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

選擇耐熱性不同的3個杜鵑品種胭脂蜜、紅珊瑚、紅月的當(dāng)年生扦插苗（3月份扦插，7月份用于試驗）進(jìn)行試驗。2018年7月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院智能溫室中選擇大小一致、生長健壯的杜鵑幼苗，進(jìn)行脅迫處理。脅迫處理在實驗室培養(yǎng)箱中進(jìn)行，高溫處理（HS）溫度 42 ℃/30 ℃（晝/夜），對照（CK）組放置在通風(fēng)的溫室（25 ℃）中。為避免水分脅迫，盆底放置托盤補充水分，每個品種選取10株幼苗。處理72 h后取樣，樣品保存于-80 ℃冰箱中。

1.2 亞細(xì)胞提取的方法

參照于飛等的方法[3]，對葉綠體、線粒體和細(xì)胞溶質(zhì)進(jìn)行分離提取，取10 g杜鵑葉片，用液氮迅速研磨成粉，加入預(yù)冷的提取緩沖液，過濾，濾液用冷凍離心機離心。利用差速離心法進(jìn)行葉綠體（2 000 r/min，沉淀）、線粒體（12 000 r/min，沉淀）和細(xì)胞溶質(zhì)（12 000 r/min，上清液）的分離提取。用 5 mL 提取緩沖液分別懸浮葉綠體和線粒體沉淀，可獲得葉綠體和線粒體的提取液。

1.3 葉片亞細(xì)胞生理生化指標(biāo)的測定

取亞細(xì)胞提取液0.5 mL，參照Kampfenkel等的方法[17]，測定抗壞血酸（AsA）的含量：加質(zhì)量濃度6%三氯乙酸（TCA）定容至8 mL，15 600 r/min，2 ℃離心10 min，上清液即為樣品待測液，測525 nm處的吸光度。參照李玲的方法[18]，測定谷胱甘肽（GSH）的含量：加入5 mL經(jīng)4 ℃預(yù)冷的50 g/L TCA（含 5 mol/L EDTA），于4 ℃、12 000 r/min離心20 min，上清液即為樣品待測液，迅速測定顯色液在波長412 nm處的吸光度。參照湯紹虎等的方法[19]，測定抗壞血酸過氧化物酶（APX）的活性：加入5 mL pH值7.0的磷酸緩沖液（25 mmol/L），在 10 000 r/min下離心15 min，上清液即為樣品待測液，測定連續(xù) 1 min 內(nèi)290 nm下的吸光度。參照李忠光等的方法[20]，測定谷胱甘肽還原酶（GR）的活性：加入 5 mL 預(yù)冷的酶提取液，于4 ℃下 10 000 r/min 離心20 min，上清液即為樣品待測液，測定連續(xù)4 min內(nèi)340 nm下的吸光度。

采用Microsoft Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜鵑幼苗熱害癥狀變化及過氧化損傷

從圖1中可以看出，高溫脅迫處理3 d后，胭脂蜜葉片無明顯變化;紅珊瑚頂部個別幼嫩葉片出現(xiàn)輕度變黃;紅月頂部個別幼嫩葉片邊緣開始枯黃。結(jié)果表明，胭脂蜜比紅珊瑚和紅月有更好的耐熱性，紅月耐熱性最差。

MDA是膜脂過氧化作用的最終產(chǎn)物[21]。高溫脅迫后3個杜鵑品種MDA含量均呈上升趨勢（圖2）。高溫脅迫后，MDA含量在紅月中變化顯著，在胭脂蜜和紅珊瑚中變化不顯著。紅月的過氧化損傷程度比胭脂蜜和紅珊瑚嚴(yán)重。

2.2 高溫脅迫下3個杜鵑品種葉片各亞細(xì)胞中AsA含量的變化

由圖3可知，高溫脅迫后，胭脂蜜和紅珊瑚AsA含量在3個亞細(xì)胞組分中從高到低依次為細(xì)胞溶質(zhì)>線粒體>葉綠體，胭脂蜜AsA含量在線粒體和葉綠體中無顯著差異，紅珊瑚AsA含量在3個亞細(xì)胞間的分布差異顯著;而紅月AsA含量從高到低依次為線粒體>細(xì)胞溶質(zhì)>葉綠體，細(xì)胞溶質(zhì)和葉綠體中AsA含量差異不顯著。

高溫脅迫后，在細(xì)胞溶質(zhì)中，胭脂蜜和紅珊瑚AsA含量顯著上升，而紅月AsA含量無顯著性變化，3個杜鵑品種中AsA含量從高到低依次為紅珊瑚>胭脂蜜>紅月。AsA含量在線粒體中的變化與細(xì)胞溶質(zhì)中的變化一致，但3個杜鵑品種中AsA含量從高到低依次為紅月>紅珊瑚>胭脂蜜。在葉綠體中，胭脂蜜AsA含量顯著降低，紅珊瑚和紅月AsA含量顯著上升，3個杜鵑品種中AsA含量從高到低依次為紅月>胭脂蜜>紅珊瑚。

2.3 高溫脅迫下3個杜鵑品種葉片各亞細(xì)胞中APX活性的變化

由圖4可知，高溫脅迫后，胭脂蜜和紅珊瑚APX活性在3個亞細(xì)胞組分間從高到低依次為細(xì)胞溶質(zhì)>葉綠體>線粒體，紅月APX活性的亞細(xì)胞分布為葉綠體>細(xì)胞溶質(zhì)>線粒體。APX活性在胭脂蜜和紅珊瑚的葉綠體和線粒體中無顯著差異，而紅月細(xì)胞溶質(zhì)和葉綠體APX活性無顯著差異。

高溫脅迫后，3個杜鵑品種APX活性除在胭脂蜜細(xì)胞溶質(zhì)和紅月細(xì)胞溶質(zhì)和葉綠體中顯著上升外，其余APX活性與對照相比均無顯著性差異。細(xì)胞溶質(zhì)、線粒體和葉綠體中3個杜鵑品種中APX活性從高到低依次為胭脂蜜>紅珊瑚>紅月、胭脂蜜>紅月>紅珊瑚、紅月>紅珊瑚>胭脂蜜。

2.4 高溫脅迫下3個杜鵑品種葉片各亞細(xì)胞中GSH含量的變化

從圖5可知，高溫脅迫后，3個杜鵑品種GSH在細(xì)胞溶質(zhì)中含量高于線粒體和葉綠體，GSH含量在胭脂蜜的3個亞細(xì)胞組分間的分布差異顯著，紅珊瑚的細(xì)胞溶質(zhì)和線粒體GSH含量變化不顯著，但顯著高于葉綠體，紅月細(xì)胞溶質(zhì)中GSH含量顯著高于線粒體和葉綠體，并且GSH含量在線粒體和葉綠體中變化不明顯。

高溫脅迫后，在細(xì)胞溶質(zhì)中，GSH含量在紅珊瑚和紅月中顯著降低，紅月的下降幅度高于紅珊瑚，在胭脂蜜中上升但并不顯著。3個杜鵑品種細(xì)胞溶質(zhì)中GSH含量從高到低依次為胭脂蜜>紅月>紅珊瑚。在線粒體中，與對照相比，3個杜鵑品種GSH含量在高溫脅迫后均無顯著性差異，3個杜鵑品種線粒體中GSH含量從高到低依次為胭脂蜜>紅珊瑚>紅月。在葉綠體中，胭脂蜜中GSH含量下降顯著，其余2個品種無顯著變化，3個杜鵑品種葉綠體中GSH含量從高到低依次為紅月>胭脂蜜>紅珊瑚。

2.5 高溫脅迫下3個杜鵑品種葉片各亞細(xì)胞中GR活性的變化

從圖6可知，高溫脅迫后，胭脂蜜和紅珊瑚的GR活性在線粒體中含量最高，顯著高于細(xì)胞溶質(zhì)和葉綠體，GR活性在紅月的3個亞細(xì)胞組分間的分布從高到低依次為葉綠體>線粒體>細(xì)胞溶質(zhì)，且在3個亞細(xì)胞組分間的分布差異顯著。

高溫脅迫后，在細(xì)胞溶質(zhì)中，胭脂蜜和紅珊瑚的GR活性上升不顯著，胭脂蜜上升幅度高于紅珊瑚，紅月中GR活性顯著下降，3個杜鵑品種細(xì)胞溶質(zhì)中GR活性從高到低依次為紅月>胭脂蜜>紅珊瑚。在線粒體中，GR活性的變化與細(xì)胞溶質(zhì)中一致，但3個杜鵑品種線粒體中GR活性從高到低依次為胭脂蜜>紅珊瑚>紅月。在葉綠體中，胭脂蜜中GR活性在高溫脅迫后顯著上升，紅珊瑚和紅月GR活性無顯著性變化。3個杜鵑品種葉綠體中GR活性從高到低依次為紅月>紅珊瑚>胭脂蜜。

3 討論與結(jié)論

高溫脅迫導(dǎo)致杜鵑幼苗中積累過多活性氧，造成過氧化脅迫，耐熱性強的杜鵑可以維持較高的抗氧化酶活性，清除過多的活性氧[15，22]。前期研究以2年生的杜鵑扦插苗為試驗材料進(jìn)行高溫脅迫，發(fā)現(xiàn)胭脂蜜的耐熱性比紅月強，紅珊瑚的耐熱性最差[23]。而本研究中以杜鵑當(dāng)年生扦插苗試驗材料，進(jìn)行熱脅迫，發(fā)現(xiàn)胭脂蜜耐熱性與以往研究相同，而紅珊瑚的耐熱性比紅月強，這或許與幼苗苗齡以及自身營養(yǎng)狀態(tài)相關(guān)。閆圓圓等[24]和賈志國[25]分別對結(jié)球甘藍(lán)和仙客來的耐熱性研究發(fā)現(xiàn)，苗齡與植物的耐熱性具有相關(guān)性。從MDA含量變化也可以看出，紅月耐熱性最差，高溫脅迫后，紅月MDA含量變化顯著，胭脂蜜和紅珊瑚MDA含量沒有顯著變化。申惠翡等[26]和張樂華等[11]的研究表明，MDA含量與耐熱性呈負(fù)相關(guān)。

3.1 高溫脅迫后杜鵑AsA-GSH循環(huán)的亞細(xì)胞定位

APX、GR、GSH和AsA在杜鵑細(xì)胞溶質(zhì)、線粒體和葉綠體中都有分布，但4個指標(biāo)的亞細(xì)胞分布存在著品種間差異。耐熱性強的胭脂蜜和耐熱性較差的紅珊瑚AsA、GSH含量和APX活性均在細(xì)胞溶質(zhì)中含量最高，其次是線粒體和葉綠體，GR則主要分布在線粒體中。耐熱性差的紅月APX、GR在葉綠體中活性最高，AsA主要分布在線粒體，而GSH主要分布在細(xì)胞溶質(zhì)中?？寡趸笜?biāo)亞細(xì)胞分布的差異或許與基因型不同有關(guān)，也可能與脅迫類型以及耐受性不同有關(guān)。研究表明，AsA-GSH循環(huán)是葉綠體中主要的活性氧清除系統(tǒng)。白三葉在水脅迫后，MDA、H2O2以及AsA-GSH循環(huán)均主要分布在葉綠體中[27];圓柏進(jìn)行低溫脅迫發(fā)現(xiàn)，ASA-GSH 循環(huán)效率定位為葉綠體>線粒體>細(xì)胞溶質(zhì)，表明圓柏屬植物葉綠體中ASA-GSH 循環(huán)在低溫脅迫響應(yīng)中發(fā)揮主要作用[28]。

研究表明，胭脂蜜、紅珊瑚和紅月3個杜鵑品種H2O2含量的亞細(xì)胞分布為細(xì)胞溶質(zhì)>葉綠體>線粒體，耐熱性差的杜鵑紅月和紅珊瑚中MDA含量分布與H2O2的亞細(xì)胞分布相一致，耐熱性強的杜鵑胭脂蜜細(xì)胞溶質(zhì)中的MDA含量最高，但線粒體和葉綠體的排序發(fā)生了變化[23]。本研究中4個抗氧化指標(biāo)的亞細(xì)胞分布與之進(jìn)行比較，可以發(fā)現(xiàn)AsA-GSH循環(huán)與H2O2的亞細(xì)胞分布并不一致，但其中3個指標(biāo)AsA、GSH和APX也都在細(xì)胞溶質(zhì)中含量最高。另外，耐熱最好的杜鵑胭脂蜜中MDA的亞細(xì)胞分布與這3個指標(biāo)的排序完全一致，即細(xì)胞溶質(zhì)>線粒體>葉綠體。GR的排序與H2O2、MDA完全不同，這可以在一定程度上說明，高溫脅迫下AsA、GSH和APX在杜鵑抗氧化循環(huán)中起著重要作用。

3.2 高溫脅迫下3個亞細(xì)胞中AsA-GSH循環(huán)的響應(yīng)

高溫脅迫下，在胭脂蜜細(xì)胞溶質(zhì)中，4個抗氧化指標(biāo)都有所升高，但僅APX和AsA升高顯著;紅珊瑚AsA顯著升高，APX和GR變化不顯著，GSH顯著下降;耐熱性最差的紅月細(xì)胞溶質(zhì)中的APX顯著升高，AsA 變化不顯著，GSH和GR顯著下降。在細(xì)胞溶質(zhì)中，通過提高AsA-GSH循環(huán)代謝中抗氧化物含量（ASA、GSH）和抗氧化酶（APX、GR）活性，使耐熱性強的杜鵑有更好的對H2O2清除的能力。玉米細(xì)胞溶質(zhì)中ASA、GSH含量和APX、GR活性在PEG脅迫（水脅迫）后都上升[27]，使玉米對PEG脅迫有更好的耐受性。另外，3個杜鵑品種相比，高溫脅迫后，耐熱性強的胭脂蜜中發(fā)揮作用的抗氧化酶及抗氧化劑的種類多于耐性差的紅珊瑚和紅月。

高溫脅迫后，在線粒體中，耐熱性強的胭脂蜜和耐熱性較強的紅珊瑚AsA顯著升高，耐熱性差的紅月線粒體中GR顯著降低，3個杜鵑品種中其他指標(biāo)的變化在線粒體不顯著，但均在抗性強的品種胭脂蜜中含量（活性）最高。耐熱性強的杜鵑線粒體AsA-GSH循環(huán)代謝中高的抗氧化物含量（ASA、GSH）和抗氧化酶（APX、GR）活性，促進(jìn)線粒體 AsA-GSH循環(huán)對H2O2的清除作用。對枇杷幼果低溫脅迫發(fā)現(xiàn)，通過提高幼果線粒體AsA-GSH循環(huán)代謝中的抗氧化物含量（ASA、GSH）和抗氧化酶類（APX、GR）的活性，促進(jìn)幼果線粒體AsA-GSH循環(huán)對H2O2的清除作用，增強枇杷幼果在低溫脅迫下的抗寒能力[29]。孫海平等對大豆種子PEG處理發(fā)現(xiàn)，種子線粒體中APX、GR增加，提高了大豆種子抗吸脹冷害的能力[30]。

在本研究中，葉綠體AsA-GSH循環(huán)中抗氧化酶活性和抗氧化物含量的變化與杜鵑的耐熱性并不明確。3個杜鵑品種相比，紅月葉綠體中抗氧化物含量（ASA、GSH）和抗氧化酶類（APX、GR）的活性均比胭脂蜜和紅珊瑚中的要高。Gu等研究發(fā)現(xiàn)，葉綠體對高溫的反應(yīng)最為敏感，其中類囊體片層變得模糊，甚至在熱敏性杜鵑屬植物中降解[31]。耐熱性差的杜鵑葉綠體更容易受ROS的損傷，其葉綠體中抗氧化機制更容易被激活。在葉綠體中，高溫脅迫后胭脂蜜AsA和GSH呈顯著下降趨勢，有待進(jìn)一步深入研究。

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