李 敏，白耘榧，黎秋玲，李 志，周智友，李漢廣

（江西農(nóng)業(yè)大學 生物科學與工程學院/江西農(nóng)業(yè)大學應用微生物研究所/江西省菌物資源保護與利用重點實驗室，江西 南昌 330045）

【研究意義】生物質(zhì)能源不僅具有來源廣泛，可再生的優(yōu)點，還能減少溫室氣體排放，有助于生態(tài)平衡的維持和人類生活環(huán)境的改善[1]。在眾多生物質(zhì)能源中，生物柴油因具備與化石柴油高度相似的能源密度和燃燒性，且其可再生性的優(yōu)點而備受人們關注。微藻相對于傳統(tǒng)生物柴油原料（大豆、油菜、茶籽），具有油脂含量豐富、形態(tài)結構簡單、生長周期短等優(yōu)勢，被視為生物柴油的第三代原料[2－3]。微藻的油脂產(chǎn)量是限制微藻生物柴油工業(yè)進程的主要因素[4-5]，因此提高微藻油脂產(chǎn)量是微藻生物質(zhì)能源領域的研究熱點之一?！厩叭搜芯窟M展】李雙雙[6]、張婷[7]和潘孝妍等[6-8]通過單因素試驗和正交試驗的方法分別優(yōu)化培養(yǎng)基中的碳、氮、磷、鎂、鈣等因素濃度將微藻油脂產(chǎn)量提高了30%～41%。微藻培養(yǎng)基組分的優(yōu)化是一個復雜的過程，傳統(tǒng)優(yōu)化方法的局限性使優(yōu)化效果無法達到最大化[9－10]。響應面法采用多元二次回歸方程擬合因素與響應值之間的函數(shù)關系，分析回歸方程來尋求最優(yōu)的工藝參數(shù)，是一種考慮因素間相互作用并能得到試驗水平外優(yōu)選值的數(shù)學統(tǒng)計方法[11]。Yang 等[12]利用響應面法優(yōu)化Scenedesmussp.培養(yǎng)基的碳、氮、磷源等，從而獲得超出實驗水平之外的優(yōu)選值，使其油脂產(chǎn)量提高了54.64%。【本研究切入點】Desmodesmus intermediusZ8是本實驗室分離的一株兼性且具有較強產(chǎn)油脂能力的藻種[13]。由于大多數(shù)微藻屬于光合自養(yǎng)生物，國內(nèi)外對微藻培養(yǎng)條件的優(yōu)化工作主要集中在自養(yǎng)培養(yǎng)條件上[14]。同時，采用的方法比較單一且各方法的局限性導致優(yōu)化效率并不高?！緮M解決的關鍵問題】因此，本文以所在實驗室自主篩選的藻株Z8為試驗對象，通過單因素試驗、Plackett-Burman 因素篩選試驗和響應面法對藻株Z8的異養(yǎng)培養(yǎng)基組分進行遞進式優(yōu)化，以期獲得較高油脂產(chǎn)量的最佳培養(yǎng)工藝，為微藻生物柴油產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供可參考的實踐經(jīng)驗。

1 材料與方法

1.1 藻種

藻種：本試驗所用的藻種為鏈帶藻Z8（Desmodesmus intermediusZ8），由本課題組從學校附近水域分離獲得[13]。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方式 異養(yǎng)培養(yǎng)[15]：以10%的接種量將對數(shù)生長期末期的藻液接種至BG-11 異養(yǎng)培養(yǎng)基中（用葡萄糖替換Na2CO3，使其作為唯一碳源），于120 r/min、溫度（27±1）℃條件下避光培養(yǎng)6 d。

1.2.2 單因素試驗設計 以藻株Z8作為試驗對象，以改良的異養(yǎng)BG-11培養(yǎng)基異養(yǎng)培養(yǎng)藻株Z8，研究不同葡萄糖濃度（0，5，10，15，20，25，30 g/L）、硫酸鎂濃度（0，25，50，75，150，300，450，600 mg/L）、硝酸鈉濃度（0，0.1，0.2，0.3，0.5，1.5，2.5，3 g/L）、氯化鈣濃度（0，0.01，0.02，0.04，0.08，0.12，0.25，0.5 g/L）、磷酸氫二鉀濃度（0，0.01，0.02，0.04，0.08，0.12，0.25，0.5 g/L）、檸檬酸濃度（0，1，2，4，6，8，10，12 mg/L）對藻株Z8生長及總脂量的影響，處理組的其它因素與異養(yǎng)BG-11培養(yǎng)基一致的條件下，以藻株Z8的生物量和總脂量為參考指標，確定響應面試驗的中心水平[16]。

1.2.3 響應面實驗設計 Plackett-Burman（P-B）因素篩選試驗[17]：根據(jù)單因素試驗確定的各個因素的水平，運用Design expert 8.0 設計12 次的P-B 試驗，對硝酸鈉、硫酸鎂、氯化鈣、磷酸氫二鉀、葡萄糖、檸檬酸、EDTA 等7 個因素進行總脂量的顯著性考察，每個因素設2 個水平，以單因素最優(yōu)值為中心點上下取值，即高水平（+1）和低水平（-1）。

1.2.4 分析方法 生物量的測定[18]：取10.0 mL 穩(wěn)定期藻液，將其通過0.22 μm 的濾膜進行真空抽濾，將抽濾所得藻泥用蒸餾水洗滌2～3次，然后將干凈藻泥置于烘箱中于60～80 ℃條件下烘干至恒質(zhì)量。以抽濾過培養(yǎng)基的濾膜為對照，按以下公式計算生物量。

式（1）中：B為微藻生物量（g/L），M為烘干后藻泥質(zhì)量（g），m為濾膜質(zhì)量（g）。

總脂量的測定[19]：取冷凍干燥的藻粉1.0 g 置于離心管，加入8.0 mL 4 mol/L 的HCl，振蕩均勻，靜置35 min，沸水浴12 min 后冷卻至室溫，然后加入16 mL 氯仿-甲醇（V/V=1∶1）提取劑，充分振蕩，浸提20 min。于4 000 r/min條件下離心20 min，取氯仿層，加入8.0 mL含量為1.5 mg/L NaCl溶液，4 000 r/min離心20 min，取氯仿層于已稱量的100 mL 錐形瓶中，將錐形瓶放置于烘箱中于60～80 ℃條件下烘至恒質(zhì)量，兩次質(zhì)量差即為1.0 g藻粉的油脂質(zhì)量，總脂量的計算公式如下：

式（2）中：P為總脂量（g/L），L為油脂質(zhì)量（g），B為生物量（g/L）。

2 結果與分析

2.1 單因素影響分析

為獲得響應面優(yōu)化中因素設計的有效閾值，本論文首先對影響藻株Z8的生物量和總脂量中的葡萄糖、硝酸鈉、硫酸鎂、氯化鈣、磷酸氫二鉀及檸檬酸進行單因素試驗，其結果如圖1所示。

圖1 不同濃度因素處理下的生物量和總脂量Fig.1 Biomass and total lipids under different concentration factors

從圖1 可知，隨著葡萄糖添加濃度的增加，生物量與總脂量的趨勢均先上升后不變；隨著硫酸鎂、硝酸鈉、磷酸氫二鉀及檸檬酸的濃度提高，生物量與油脂產(chǎn)量均出現(xiàn)先上升后下降的趨勢；然而，伴隨著氯化鈣添加濃度的增加，生物量與總脂量的趨勢沒有顯著變化。最終從上圖可知最優(yōu)的葡萄糖、硝酸鈉、硫酸鎂、氯化鈣、磷酸氫二鉀及檸檬酸的質(zhì)量濃度分別為：15，1.5，75，0.04，0.12 g/L和4 mg/L。

2.2 響應面試驗分析及參數(shù)優(yōu)化

2.2.1 Plackett-Burman（P-B）試驗 P-B 試驗是一種兩水平優(yōu)化試驗的方法，其可在較少的試驗次數(shù)內(nèi)對眾多因素的主效應進行精確估計［20］，試驗各因素及編碼水平見表1。藻株Z8培養(yǎng)條件優(yōu)化的P-B試驗設計和結果見表2。采用Design-expert 8.0軟件對實驗結果進行方差分析，可以得到油脂產(chǎn)量的一階模型：

表1 P-B試驗設計各因素及編碼水平Tab.1 Level of factors in P-B test design

表2 Plackett-Burman試驗設計與結果Tab.2 Plackett-Burman design and results

由表3 可知，該試驗模型顯著（P＜0.05），且試驗各因素中硫酸鎂、磷酸氫二鉀、葡萄糖和檸檬酸為顯著影響的因素。

表3 Plackett-Burman試驗模型及方差分析Tab.3 lackett-Burman model and variance analysis

2.2.2 響應面優(yōu)化 根據(jù)P-B因素篩選結果，依據(jù)中心組合試驗原理通過Design expert 8.0軟件進行響應面中心旋轉組合試驗設計及分析，尋找最優(yōu)化組合，以總脂量為響應值，進行4因素5水平的響應面優(yōu)化，因素及編碼水平如表4所示，設計編碼與響應值結果如表5所示，回歸模型及系數(shù)的顯著性檢驗見表6。

表4 試驗因素水平及編碼Tab.4 Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in central composite design（CCD）

表5 中心旋轉組合試驗設計與響應值Tab.5 Design and response value of central rotation combined test

利用Design-expert 8.0 軟件對結果進行多元回歸擬合后，經(jīng)過分析可以得到硫酸鎂（X1）、磷酸氫二鉀（X2）、葡萄糖（X3）、檸檬酸（X4）等4個因素對油脂含量的多元回歸模型：

從表6中可知，模型的F值為5.11，P＜0.05，顯示具備顯著效應（表示為*），決定系數(shù)R2=0.826 6，校正系數(shù)RAdj2=0.664 8，說明實際總脂量與模型的回歸值具有良好的一致性，同時該模型能解釋66.48%的響應值的變化。另外失擬項的F=3.44，P=0.926＞0.05，說明失擬項不顯著，所以該方程能較好地反映實際情況。因此，該模型可用于微藻油脂產(chǎn)量的分析和預測。從回歸模型來看，X3對總脂量影響極顯著，X2、X4以及交互項X3X4對總脂量影響顯著，其余項不顯著。說明試驗因素不是簡單地線性關系；4 個因素對總脂量的影響程度大小分別為：葡萄糖、磷酸氫二鉀、檸檬酸和硫酸鎂。

表6 中心旋轉組合試驗設計方差分析Tab.6 Analysis of variance in the design of central rotation combined experiment

最終通過Design expert 8.0 軟件分析，得出藻株Z8異養(yǎng)培養(yǎng)的最佳工藝條件為：葡萄糖18 g/L、檸檬酸9 mg/L、磷酸氫二鉀0.07 g/L、硫酸鎂200 mg/L，在此條件下總脂量最大理論值為3.17 g/L，未優(yōu)化培養(yǎng)基的總脂量1.39 g/L，相比之下優(yōu)化后提高了128%。

采取上述優(yōu)化條件進行3 次重復試驗，結果測得藻株Z8的總脂量為3.17 g/L，與預測值基本一致（估讀后數(shù)值一樣），說明該回歸方程與實際情況擬合較好，該模型可以較好地模擬和預測油脂產(chǎn)量。

3 討論與結論

單因素試驗只考慮單一因素的影響，采用這種試驗方法必須首先假定各因素間沒有交互作用，如果各因素間存在交互作用，利用這種方法一般會得出錯誤的結論[21]。正交試驗雖然彌補了單因素的不足，但是無法對試驗水平之外的最優(yōu)值進行預測，所得的最優(yōu)結果仍不夠精確[22]。由于響應面法能在整個區(qū)域上找到因素和響應值之間的函數(shù)表達式，是一種能研究幾種因素間交互作用并對區(qū)域外的響應值進行預測的回歸分析方法[23]，可以克服傳統(tǒng)經(jīng)驗方法的局限性[24]。發(fā)酵培養(yǎng)基各組分往往具有一定的相互作用，不同碳氮比[25]、氮磷比[26]、金屬離子[27]及有機酸比例[28-29]都會對發(fā)酵過程及結果產(chǎn)生不同程度的影響。為提高藻株Z8的油脂產(chǎn)量，本論文首先通過單因素試驗獲得藻株Z8油脂生產(chǎn)的最佳工藝條件：葡萄糖15 g/L、硫酸鎂75 mg/L、硝酸鈉1.5 g/L、氯化鈣0.04 g/L、磷酸氫二鉀0.12 g/L、檸檬酸4 mg/L。然后，通過軟件Design-expert 8.0 依據(jù)單因素試驗結果，設計P-B 試驗和中心組合試驗。通過P-B 試驗的結果，可以看出硫酸鎂、磷酸氫二鉀、葡萄糖、檸檬酸對藻株Z8總脂量具有顯著影響且呈現(xiàn)正向作用。因此，分別選擇這4個因素的高水平作為中心組合試驗設計的中心點，再進行進一步的優(yōu)化。最終得出藻株Z8油脂生產(chǎn)的最佳工藝條件：硫酸鎂200 mg/L、磷酸氫二鉀0.07 g/L、葡萄糖18 g/L、檸檬酸9 mg/L，其它條件與單因素優(yōu)化結果一致。藻株Z8在此條件下，總脂量達到3.17 g/L，與未優(yōu)化前培養(yǎng)條件相比提高了128%。

本論文不僅可豐富產(chǎn)油微藻的藻種資源，而且從本論文結果可知響應面優(yōu)化策略是一種簡單易行的提高藻株Z8生物量及油脂含量的方式，本研究結果可為它通過遞進式優(yōu)化策略提高微生物發(fā)酵性能提供可供參考的實踐經(jīng)驗。