王勝男，付曉婷，許加超，高 昕

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266003）

羊棲菜是一種馬尾藻屬褐藻，主要分布于北太平洋北部海岸，在我國分布廣泛，遼東半島、雷州半島以及從北部山東至南部廣東的沿海海域均有分布[1?2]。羊棲菜是我國重要的經(jīng)濟(jì)型海藻，主要在浙江省洞頭縣大規(guī)模養(yǎng)殖，并出口日本等國家。羊棲菜口感醇厚，風(fēng)味良好，富含多種營養(yǎng)元素與營養(yǎng)成分，又被稱為“長壽菜”。羊棲菜入藥在我國歷史悠久，《神農(nóng)本草經(jīng)》、《本草綱目》等藥典中均有記載。

羊棲菜的營養(yǎng)價值與藥用價值與其所含的功能性多糖有密切關(guān)系，羊棲菜中總糖含量可達(dá)干重的40%，其中以褐藻膠和褐藻糖膠為兩種主要的功能性多糖。褐藻膠是以β-D甘露糖醛酸（M）和α-L-古羅糖醛酸（G）通過1-4連接而成的線性多糖，雖沒有特別突出的生物活性，但由于具有獨特的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，其作為食品添加劑和醫(yī)學(xué)材料等應(yīng)用廣泛[3]。褐藻糖膠是主要由L-巖藻糖和硫酸基團(tuán)組成的水溶性雜多糖，以其優(yōu)越的生物活性得到廣泛關(guān)注[4]。研究表明，羊棲菜褐藻糖膠具有免疫調(diào)節(jié)[5]、抗炎[6]、抗黑色素瘤[6]、降血糖[7]、抗衰老[8]、抗菌[9]等多種生物活性。Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)酶輔助提取法從羊棲菜中提取的褐藻糖膠在角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT）及斑馬魚胚胎和幼魚均表現(xiàn)出顯著的紫外線保護(hù)作用。Chen等[5]發(fā)現(xiàn)從羊棲菜中分離純化得到的褐藻糖膠組分可以通過激活CD14/IKK/NF-κB和P38/NF-κB信號通路在RAW 264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用。此外，已有文獻(xiàn)報道了提取自羊棲菜的多糖具有抗氧化作用，但大多集中于對羊棲菜總粗多糖的抗氧化活性研究[11?14]，目前針對于羊棲菜褐藻糖膠抗氧化活性的報道主要集中在其體外抗氧化活性的研究[15?16]，本文利用體內(nèi)模型對羊棲菜褐藻糖膠的抗氧化活性進(jìn)行更深入研究。

斑馬魚（Danio rerio）是一種強(qiáng)大的脊椎動物模型，被廣泛用于各種人類疾病的研究[17?19]，主要優(yōu)點在于其高度發(fā)達(dá)的免疫系統(tǒng)，與哺乳動物的生理和形態(tài)相似性，較低的養(yǎng)殖成本，加之其胚胎及幼魚的光學(xué)透明度，使其更有利于體內(nèi)形態(tài)檢測[20?21]。

氧化應(yīng)激過程與活性氧（ROS）產(chǎn)生和清除的不平衡有關(guān)，正常的ROS生成可以通過細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)清除，環(huán)境壓力、毒性等刺激細(xì)胞會造成ROS過量產(chǎn)生而無法清除，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞損傷和凋亡，誘發(fā)各種疾病[22]。2,2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（AAPH）可誘導(dǎo)斑馬魚胚胎產(chǎn)生氧化損傷，生成過量ROS，造成大量細(xì)胞死亡[23]。斑馬魚體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平可以通過檢測ROS生成水平、細(xì)胞死亡率來進(jìn)行評價。

本實驗首先對提取自羊棲菜的褐藻糖膠進(jìn)行體外抗氧化活性評價，并進(jìn)一步利用優(yōu)化的AAPH誘導(dǎo)斑馬魚氧化應(yīng)激模型進(jìn)行體內(nèi)抗氧化活性研究，為羊棲菜褐藻糖膠在功能性食品、化妝品工業(yè)中的應(yīng)用提供了一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊棲菜 2018年5月收獲自浙江省洞頭縣；成年野生AB系斑馬魚 上海費曦生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH） 上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；2,2'-聯(lián)氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS） 大連美侖生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜（DMSO） 北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；AAPH、三卡因、吖啶橙、2,7-二氟熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA） 美國Sigma公司；無水乙醇、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、硫酸鎂、鹽酸、過硫酸鉀、亞甲基藍(lán) 分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

SPX-100B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司; Powerwave XS型酶標(biāo)儀 美國Biotek公司；斑馬魚全自動循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng) 山東中科?？萍技瘓F(tuán)有限公司；SZ61體式顯微鏡 日本奧林巴斯；A1R HD25激光共聚焦顯微鏡 日本Nikon公司；FA2004B電子天平 上海天美天平儀器有限公司；FD5-2.5冷凍干燥機(jī) 北京金西盟儀器有限公司；Milli Q純水機(jī) 默克密理博實驗室設(shè)備（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 羊棲菜多糖的制備 羊棲菜褐藻糖膠的制備方法參考Ni等[24]和李雅靜[25]的研究。新鮮羊棲菜用蒸餾水沖洗干凈，經(jīng)冷風(fēng)干燥后，粉碎，過60目篩，保存于?20 ℃。取20 g藻粉按照1:20 g/mL料液比加入95%乙醇，40 ℃攪拌2 h以除去色素、多酚和脂質(zhì)。脫脂樣品用超純水（1:30，w/v）于70 ℃水浴搖床中振蕩提取12 h，經(jīng)4000 r/min離心、過濾后取上清液。此后，用三倍體積乙醇沉淀得到羊棲菜粗多糖（SFPSC）；或上清液加入2% CaCl2溶液沉淀，4000 r/min離心，所得上清液旋蒸濃縮，用截留分子量3.5 kDa的透析膜透析3 d，加入3倍體積無水乙醇，于4 ℃冰箱靜置過夜，離心后將沉淀復(fù)溶，旋蒸至無乙醇味，凍干得到羊棲菜褐藻糖膠（SFPS）。

1.2.2 化學(xué)組成分析 總糖含量的測定參照Dubois等[26]報道的方法，并稍作修改。以巖藻糖為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算總糖含量。硫酸根含量的測定參照Kawai等[27]報道，利用明膠-BaCl2比濁法，以硫酸鉀為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線計算硫酸根含量。蛋白質(zhì)含量的測定根據(jù)Winters等[28]報道的方法，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算?？偡雍康臏y定根據(jù)Chandler等[29]報道的福林酚法，以間苯三酚為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計算。

1.2.3 體外抗氧化能力測定

1.2.3.1 DPPH自由基清除能力測定 DPPH自由基清除能力參照Tierney等[30]和Li等[31]的報道進(jìn)行測定，并稍作修改。將100 μL不同濃度樣品溶液和100 μL乙醇或乙醇配制的DPPH工作液分別加入到96孔板中，室溫下避光孵育30 min，在515 nm波長下測定吸光度值。抑制率按照下式計算。

式中，Asample表示樣品吸光度值（樣品+DPPH工作液），Asampleblack表示樣品空白的吸光度值（樣品+乙醇），Acontrol表示對照吸光度值（DPPH工作液+去離子水），Acontrolblack表示對照空白（乙醇+去離子水）。

1.2.3.2 ABTS自由基清除能力測定 ABTS自由基清除能力的測定參照Frattaruolo等[32]的報道，并稍作修改，將ABTS溶液（7 mmol/L）與過硫酸鉀溶液（2.45 mmol/L）混合，室溫避光孵育12~16 h，使用前用去離子水稀20~30倍，734 nm波長下吸光度值為0.70±0.02，分別將各濃度樣品溶液和ABTS工作液或去離子水加入96孔板，室溫下避光孵育10 min，測定734 nm波長下各孔吸光度值。抑制率按照下式計算。

式中，Asample表示樣品吸光度值（樣品+ABTS工作液），Asampleblack表示樣品空白的吸光度值（樣品+去離子水），Acontrol表示對照吸光度值（ABTS工作液+去離子水），Acontrolblack表示對照空白（去離子水）。

1.2.4 斑馬魚體內(nèi)抗氧化活性檢測

1.2.4.1 斑馬魚喂養(yǎng)及胚胎收集 根據(jù)文獻(xiàn)[33]，繁殖期野生斑馬魚飼養(yǎng)于中科海公司的半自動循環(huán)系統(tǒng)中，水溫（26±1）℃，系統(tǒng)每24 h光照時長14 h、黑暗時長10 h，每日早晚以新鮮豐年蝦各飼喂一次。取健康雌雄魚自然交配，用一次性培養(yǎng)皿中收集斑馬魚胚胎并培養(yǎng)于（28.5±1）℃恒溫培養(yǎng)箱。

1.2.4.2 斑馬魚胚胎給藥 挑選正常發(fā)育至7~9 hpf（hours post fertilization）的斑馬魚胚胎，以20枚/孔轉(zhuǎn)移至24孔板中，去除舊培養(yǎng)液，根據(jù)實驗?zāi)康呐c設(shè)計，每孔分別加入空白胚胎培養(yǎng)液（10% NaCl，0.3% KCl，0.3% CaCl2，0.79% MgSO4）、胚胎培養(yǎng)液配制的樣品溶液或AAPH誘導(dǎo)溶液，培養(yǎng)體系為2 mL培養(yǎng)液，每組設(shè)置三個平行對照孔，給藥完成后置于（28.5±1）℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[23]。

1.2.4.3 AAPH氧化誘導(dǎo)模型優(yōu)化 根據(jù)參考文獻(xiàn)[22?23,33]，對不同濃度AAPH（10、15、20、25、30 mmol/L）誘導(dǎo)的斑馬魚氧化應(yīng)激模型進(jìn)行優(yōu)化。待斑馬魚胚胎發(fā)育至8~9 hpf時進(jìn)行一次胚胎給藥，置于（28.5±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，后續(xù)分別進(jìn)行斑馬魚胚胎存活率、卵黃囊大小、幼魚體內(nèi)ROS生成率及細(xì)胞死亡率的檢測。

1.2.4.4 SFPS毒性評價 選擇一定濃度（50、100、200、400 μg/mL）SFPS進(jìn)行毒性評價實驗，于胚胎發(fā)育的7~8 hpf加入樣品，其后置于（28.5±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，進(jìn)行斑馬魚胚胎存活率、正常發(fā)育率、心跳速率、幼魚體內(nèi)細(xì)胞死亡率的檢測。

1.2.4.5 SFPS對AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚氧化應(yīng)激模型的保護(hù)作用評價 根據(jù)毒性評價結(jié)果，選擇SFPS無氧化毒性的濃度范圍進(jìn)行抗氧化活性評價實驗，于胚胎發(fā)育的7~8 hpf進(jìn)行胚胎給藥，于恒溫培養(yǎng)箱（28.5±1）℃中進(jìn)行預(yù)孵育，1 h 后利用佳AAPH誘導(dǎo)濃度（20 mmol/L）進(jìn)行氧化誘導(dǎo)。實驗分為空白對照組，AAPH誘導(dǎo)組，AAPH誘導(dǎo)+SFPS組，每組設(shè)置三個平行孔，實驗體系均為2 mL?？瞻讓φ战M：2 mL空白胚胎培養(yǎng)液；AAPH誘導(dǎo)組：2 mL胚胎培養(yǎng)液配制的AAPH誘導(dǎo)物（終濃度20 mmol/L）；AAPH誘導(dǎo)+SFPS組：每孔加入胚胎培養(yǎng)液配制的無毒性濃度范圍的SFPS樣品溶液1.9 mL，預(yù)孵育1 h后，加入AAPH誘導(dǎo)物0.1 mL（至終濃度20 mmol/L）。給藥完成后，將斑馬魚胚胎轉(zhuǎn)移至（28.5±1）℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育，待后續(xù)進(jìn)行胚胎存活率、心跳速率、卵黃囊大小，幼魚體內(nèi)細(xì)胞死亡率、ROS生成率的測定。

斑馬魚存活率：統(tǒng)計每天按時觀察胚胎發(fā)育情況，及時移除死亡胚胎，最后統(tǒng)計發(fā)育至72 hpf時期各實驗組幼魚存活率情況[34]。

斑馬魚正常發(fā)育率統(tǒng)計：斑馬魚胚胎正常發(fā)育率的統(tǒng)計參照文獻(xiàn)[33]。于顯微鏡下觀察斑馬魚發(fā)育情況，計數(shù)發(fā)育至3 dpf時期正常形態(tài)下的斑馬魚幼魚。

幼魚卵黃囊大小檢測：卵黃囊大小的評估根據(jù)Na等[35]的報道，并稍作修改。待斑馬魚胚胎發(fā)育至30 hpf時，對胚胎進(jìn)行擺位后，利用帶攝像頭的顯微鏡后進(jìn)行拍照，并用ImageJ軟件測量卵黃囊大小，每個胚胎計算三次取平均值。最終數(shù)據(jù)以給藥組卵黃囊大小與空白對照組卵黃囊大小的比值表示。

幼魚心跳速率測定：待斑馬魚胚胎發(fā)育至48 hpf時期并脫膜后，利用體式顯微鏡觀察，對各組幼魚心跳速率進(jìn)行人工計數(shù)，每次計數(shù)30 s，每條幼魚計數(shù)三次取平均值[36]。心跳速率數(shù)值以給藥組心跳數(shù)與空白對照組心跳數(shù)的比值表示。

斑馬魚幼魚體內(nèi)熒光染色與分析：根據(jù)Zou等[34]的報道，并稍作修改，待斑馬魚胚胎發(fā)育至72 hpf時期，分別選擇各濃度組幼魚數(shù)條，并用相應(yīng)的熒光染色試劑進(jìn)行熒光染色。各組幼魚分別用胚胎培養(yǎng)液稀釋的吖啶橙溶液（7 μg/mL）或DCFH-DA（15 μg/mL）進(jìn)行避光孵育（（28.5±1）℃）。孵育完成后，用胚胎培養(yǎng)液沖洗幼魚以洗去未結(jié)合的熒光試劑，重復(fù)5次。拍攝熒光圖片前，用0.03%的三卡因溶液麻醉幼魚，并將其置于激光共聚焦顯微鏡下捕獲圖片。圖片熒光強(qiáng)度的分析用ImageJ軟件進(jìn)行。各組ROS生成率（%）、細(xì)胞死亡率（%）以樣品組熒光強(qiáng)度與空白組熒光強(qiáng)度的比值表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復(fù)三次，實驗結(jié)果以Xˉ ±SD表示；實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析利用SPSS19軟件進(jìn)行，通過單因素（ANOVA）分析，Turkey檢驗對組間差異性進(jìn)行比較，P<0.05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖的化學(xué)組成

SFPS基本化學(xué)組成的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如表1所示，以巖藻糖為標(biāo)準(zhǔn)品繪制的總糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=3.5706x+0.0618，其中R2=0.9990，對SFPS和SFPSC進(jìn)行測定，得到其總糖含量分別為75.30%±1.77%和40.41%±0.19%。利用明膠-BaCl2比濁法得到硫酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程為y=0.2959x+0.0331，其中R2=0.9996，計算得SFPS和SFPSC硫酸根含量分別是21.39%±1.07%和17.10%±0.42%。以BSA為標(biāo)準(zhǔn)品繪制的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=4.0167x+0.2176，其中R2=0.9968，計算得SFPS和SFPSC的蛋白質(zhì)含量分別為1.78%±0.19%和2.01%±0.17%。以間苯三酚為標(biāo)準(zhǔn)品繪制的多酚含量標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=22.952x+0.0412，其中R2=0.9991，計算得SFPS和SFPSC的多酚含量分別是1.47%±0.02%和1.50%±0.09%。各物質(zhì)含量數(shù)據(jù)結(jié)果如表2所示，SFPS的總糖含量比SFPSC高近一倍。綜上，可以說SFPSC與SFPS都是硫酸化多糖，均含有較高的硫酸根含量。大量研究表明，海藻多糖具有優(yōu)越的抗氧化活性[4,15,22,37]，因此推測SFPSC與SFPS也具有一定的抗氧化潛力。

2.2 體外抗氧化能力測定結(jié)果

DPPH與ABTS自由基清除法是兩種有效評價和篩選活性物質(zhì)抗氧化活性的方法。兩種樣品體外抗氧化能力測定結(jié)果如表3所示，SFPS的DPPH與ABTS自由基清除能力均明顯強(qiáng)于SFPSC。其中，SFPS的DPPH自由基清除能力IC50值為0.59 mg/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于提取自Sargassum fulvellum的褐藻糖膠的IC50值（6.90 mg/mL）[22]，表明SFPS具有優(yōu)越的體外抗氧化活性。目前，AAPH已被廣泛用作自由基誘導(dǎo)劑用于抗氧化研究[38?39]。因此，本實驗采用AAPH誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，并進(jìn)一步評價SFPS在斑馬魚體內(nèi)的抗氧化保護(hù)作用。

表 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Table 1 Equations of standard curves

表 2 SFPSC與SFPS的化學(xué)組成Table 2 Chemical components of SFPSC and SFPC

表 3 SFPSC與SFPS的自由基清除能力Table 3 Free radical scavenging activities of SFPSC and SFPS obtained from S. fusiform

2.3 AAPH誘導(dǎo)斑馬魚氧化模型優(yōu)化

2.3.1 AAPH誘導(dǎo)濃度對斑馬魚胚胎存活率、卵黃囊大小的影響 如圖1所示，各個實驗濃度的AAPH均對胚胎存活有一定的負(fù)面影響，且胚胎存活率與AAPH濃度呈劑量依賴型降低，且經(jīng)高濃度AAPH（30 mmol/L）誘導(dǎo)，斑馬魚胚胎存活率降低到50%以下（6.67%），不適用于進(jìn)一步指標(biāo)檢測。而中、低濃度AAPH（10、15、20、25 mmol/L）誘導(dǎo)造成的存活率均大于等于50%，可以滿足后續(xù)指標(biāo)檢測及誘導(dǎo)效果評價。

斑馬魚從胚胎到幼魚時期的發(fā)育依靠卵黃囊提供營養(yǎng)，而不需從外界獲取營養(yǎng)物質(zhì)，因此胚胎卵黃囊大小可在一定程度上指示胚胎發(fā)育程度[40]。所選濃度對斑馬魚胚胎卵黃囊大小的影響結(jié)果如圖2所示，在不同濃度AAPH誘導(dǎo)下，斑馬魚胚胎卵黃囊均有一定程度的腫大，其中，與對照組相比，在10、15、25 mmol/L AAPH誘導(dǎo)下，斑馬魚胚胎卵黃囊呈現(xiàn)出非顯著性的腫大（111.11%、119.30%、123.25%），而在20 mmol/L誘導(dǎo)濃度下，斑馬魚卵黃囊顯著腫大。因此初步認(rèn)定20 mmol/L為最優(yōu)誘導(dǎo)濃度。后續(xù)選擇誘導(dǎo)效果較好的三個組（15、20、25 mmol/L）進(jìn)行后續(xù)檢測。

圖 1 AAPH誘導(dǎo)濃度對斑馬魚胚胎存活率的影響Fig.1 Effect of AAPH-induced concentration on the survival rates of zebrafish embryos

圖 2 不同濃度AAPH對斑馬魚胚胎卵黃囊大小的影響Fig.2 Effect of different concentrations of AAPH on the yolk sac size of zebrafish embryos

2.3.2 AAPH誘導(dǎo)濃度對斑馬魚幼魚體內(nèi)細(xì)胞死亡率和ROS生成率的影響 斑馬魚體內(nèi)細(xì)胞死亡和ROS生成的熒光檢測數(shù)據(jù)如圖 3和圖4所示。結(jié)果表明，三個濃度AAPH誘導(dǎo)均可顯著提高斑馬魚體內(nèi)細(xì)胞死亡水平（P<0.05），其中誘導(dǎo)濃度為20 mmol/L時，幼魚體內(nèi)細(xì)胞死亡率和ROS生成率分別可達(dá)221.48%和274.42%，均高于15、25 mmol/L誘導(dǎo)濃度下的過氧化應(yīng)激水平。因此，選擇20 mmol/L AAPH濃度建立斑馬魚氧化應(yīng)激誘導(dǎo)模型進(jìn)行后續(xù)活性物質(zhì)的抗氧化活性評價。此造模濃度高于鄒婭雪等[33]在研究中選擇的濃度（15 mmol/L），但低于Kang等[23]在實驗中選擇的濃度（25 mmol/L）。

圖 3 不同濃度AAPH對斑馬魚幼魚體內(nèi)細(xì)胞死亡率的影響Fig.3 Effect of different concentrations of AAPH on the cell death of zebrafish larvae

圖 4 不同濃度AAPH對斑馬魚幼魚體內(nèi)活性氧生成率的影響Fig.4 Effect of different concentrations of AAPH on the reactive oxygen species (ROS) production rate in zebrafish larvae

2.4 SFPS毒性評價

2.4.1 SFPS濃度對斑馬魚存活發(fā)育的影響 選擇50~400 μg/mL濃度范圍進(jìn)行SPFS毒性評價，不同濃度SFPS對斑馬魚存活率的影響如圖5a所示，50、100、200、400 μg/mL的SFPS均對斑馬魚胚胎無致死毒性。低濃度SFPS組（≤200 μg/mL）對斑馬魚胚胎沒有致畸毒性，但是高濃度（400 μg/mL）SFPS不利于斑馬魚胚胎的正常發(fā)育，導(dǎo)致斑馬魚畸形發(fā)育（圖5b），其正常發(fā)育率降低至91.67%（圖5c）。對斑馬魚胚胎脫膜后幼魚進(jìn)行心跳速率的檢測，檢測結(jié)果如圖 5d所示，在SFPS濃度為400 μg/mL時，與空白組相比，幼魚心跳速率顯著提高至108.26%（P<0.05），而低濃度SFPS則對斑馬魚生長發(fā)育無此負(fù)面影響。

2.4.2 SFPS濃度對斑馬魚幼魚體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響 如圖6所示，200 μg/mL以下濃度的樣品組細(xì)胞死亡率與空白組相比沒有顯著性差異（P>0.05），而400 μg/mL SFPS使斑馬魚幼魚體內(nèi)細(xì)胞死亡率顯著升高（P<0.05）。綜合以上實驗結(jié)果，選擇小于200 μg/mL的安全濃度進(jìn)行后續(xù)抗氧化活性評價，與從Sargassum fulvellum[22]和Undaria pinnatifida[41]提取的褐藻糖膠（均為100 μg/mL）相比，可用于體內(nèi)抗氧化研究的濃度范圍更大，由此揭示了SFPS更優(yōu)越的應(yīng)用前景。

2.5 SFPS對AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚氧化應(yīng)激模型的保護(hù)作用評價

2.5.1 不同濃度SFPS對AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎存活發(fā)育的影響 如圖7a所示，與空白對照組相比，AAPH誘導(dǎo)組斑馬魚胚胎存活率降低至65.00%，實驗結(jié)果與圖1一致，而各濃度組SFPS均對AAPH導(dǎo)致的存活率降低有顯著抑制作用（P<0.05），且抑制作用呈劑量依賴性提高。在SFPS濃度為200 μg/mL時，顯著改善AAPH誘導(dǎo)導(dǎo)致的胚胎死亡（P<0.05），存活率可達(dá)100%，與空白對照組完全一致，證明SFPS對AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎具有有效的保活作用。

圖 5 SFPS濃度對斑馬魚胚胎存活發(fā)育的影響Fig.5 Effect of different concentrations of SFPS on the survival rate and development of zebrafish embryos

圖 6 SFPS濃度對斑馬魚幼魚體內(nèi)細(xì)胞死亡率的影響Fig.6 Effect of different concentrations of SFPS on the cell death of zebrafish larvae

圖 7 不同濃度SFPS對AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎存活率（a）、卵黃囊大?。╞）、心跳速率（c）的影響Fig.7 Effect of different concentrations of SFPS on the survival rate (a), yolk sac size (b) and heart-beat rate (c) of AAPHinduced zebrafish

如圖7b所示，斑馬魚胚胎經(jīng)AAPH誘導(dǎo)后發(fā)育變緩，消耗的營養(yǎng)物質(zhì)減少，卵黃囊出現(xiàn)明顯的非正常腫大，高達(dá)空白對照組斑馬魚的1.5倍。而經(jīng)SFPS預(yù)孵育處理的實驗組卵黃囊大小隨濃度升高呈劑量依賴性減小，且在最高濃度200 μg/mL時與空白對照組無顯著性差異。

斑馬魚幼魚心跳速率檢測結(jié)果如圖7c所示，在AAPH誘導(dǎo)下，斑馬魚心跳速率顯著升高至空白對照組的116.97%（P<0.05），而三個濃度SFPS實驗組均顯著抑制AAPH引起的幼魚心跳速率升高（P<0.05），其中最優(yōu)SFPS濃度為200 μg/mL，經(jīng)此濃度預(yù)孵育的實驗組心跳速率降低至與空白組無顯著性差異（P>0.05）。實驗結(jié)果表明SPFS對AAPH誘導(dǎo)斑馬魚模型產(chǎn)生的氧化損傷具有良好的保護(hù)作用。

2.5.2 不同濃度SFPS對AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響

2.5.2.1 不同濃度SFPS對AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚體內(nèi)細(xì)胞死亡的影響 樣品對AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚體內(nèi)細(xì)胞死亡率的影響結(jié)果如圖8所示，根據(jù)熒光圖像可以看出，AAPH誘導(dǎo)組熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于空白組熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，證明經(jīng)AAPH誘導(dǎo)，斑馬魚體內(nèi)大量細(xì)胞凋亡，凋亡細(xì)胞結(jié)合熒光染料，使其發(fā)出強(qiáng)烈熒光。而各濃度SFPS預(yù)孵育組均顯著降低了AAPH誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞死亡（P<0.05），且降低作用呈劑量依賴型增強(qiáng)，其中最高濃度200 μg/mL呈現(xiàn)出最強(qiáng)的抑制作用，與空白對照組無顯著差異（P>0.05），且僅為AAPH誘導(dǎo)組的29.41%。Wang等[22]研究報道了從另一種馬尾藻屬褐藻Sargassum fulvellum中提取的巖藻聚糖硫酸酯在最優(yōu)濃度下將AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚體內(nèi)的細(xì)胞死亡降低至55%左右，遠(yuǎn)高于SFPS的29.41%，這表明SFPS具有優(yōu)越的抗氧化活性。

2.5.2.2 不同濃度SFPS對AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚體內(nèi)活性氧生成率的影響 不同濃度SFPS對斑馬魚體內(nèi)ROS生成率的影響結(jié)果如圖9所示，AAPH的加入顯著誘導(dǎo)斑馬魚幼魚體內(nèi)活性氧的過量生成至261.81%（P<0.05），但SFPS預(yù)孵育劑量依賴性降低ROS的生成。在50、100、200 μg/mL分別將ROS生成降低至220.08%、187.40%、129.13%。在最優(yōu)濃度200 μg/mL時，與AAPH誘導(dǎo)組相比，活性氧生成的抑制率可達(dá)50.68%。

圖 8 不同濃度SFPS對AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚體內(nèi)細(xì)胞死亡率的影響Fig.8 Effect of different concentrations of SFPS on the cell death rate of AAPH-induced zebrafish in vivo

圖 9 不同濃度SFPS對AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚體內(nèi)活性氧生成率的影響Fig.9 Effect of different concentrations of SFPS on ROS production of AAPH-induced zebrafish in vivo

3 結(jié)論與討論

上述實驗結(jié)果表明本實驗提取的SFPS具有良好的體內(nèi)抗氧化活性，且最優(yōu)濃度為200 μg/mL，遠(yuǎn)高于Lee等[42]從另一種褐藻Ishige okamurae提取的褐藻糖膠最優(yōu)濃度（6.25 μg/mL）。一定濃度范圍（50~200 μg/mL）的SFPS在斑馬魚體內(nèi)發(fā)揮抗氧化保護(hù)作用主要是通過直接清除AAPH誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS，并進(jìn)一步減少細(xì)胞死亡來實現(xiàn)的。同樣有研究表明，利用酶提法從韓國濟(jì)州島沿岸收集的Hizikia fusiforme中提取的粗多糖在H2O2誘導(dǎo)的斑馬魚體內(nèi)同樣發(fā)揮了劑量依賴性抑制活性氧生成的作用，但抑制率僅達(dá)18.50%[14]，表明本實驗中提取的褐藻糖膠具有良好的抗氧化活性。另外，與已報道過的其他褐藻糖膠相比[22,42]，本實驗中使用的SFPS抗氧化效果也更優(yōu)，與這進(jìn)一步印證了羊棲菜褐藻糖膠SFPS優(yōu)越的的抗氧化活性。

據(jù)文獻(xiàn)[2]報道，硫酸多糖的抗氧化活性與硫酸根含量呈正相關(guān)。本研究中褐藻糖膠SFPS是一種硫酸化多糖，硫酸根含量可達(dá)21.39%，高于其他已報道的褐藻糖膠[9,14,22]，這或許是揭示本實驗中SFPS表現(xiàn)出更強(qiáng)抗氧化活性的原因。

本研究首先對提取自羊棲菜的褐藻糖膠（SFPS）進(jìn)行了化學(xué)組成測定，證明SFPS是一種硫酸根含量較高的硫酸化多糖，且體外自由基清除實驗證明SFPS抗氧化能力與粗多糖SFPSC相比更有優(yōu)勢。本研究又通過不同誘導(dǎo)濃度優(yōu)化得到20 mmol/L AAPH誘導(dǎo)的最優(yōu)斑馬魚氧化應(yīng)激模型，并首次利用該模型對樣品SFPS進(jìn)行了體內(nèi)抗氧化活性的探究。一定濃度SFPS（50、100、200 μg/mL）劑量依賴性抑制AAPH誘導(dǎo)引起的胚胎死亡、卵黃囊腫大以及心跳速率過快（P<0.05），同時有效抑制了AAPH誘導(dǎo)導(dǎo)致的斑馬魚幼魚體內(nèi)細(xì)胞死亡率和ROS生成率升高（P<0.05），細(xì)胞死亡率和ROS生成率均降低至與正常組無顯著差異，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。實驗結(jié)果為SFPS作為天然抗氧化劑的開發(fā)利用提供了可靠的理論依據(jù)，證明SFPS具有極大的應(yīng)用價值和市場前景。