趙 姝，張 英，陳 晶，趙曉娟

(青島市中心醫(yī)院產(chǎn)科，山東 青島 266042)

孕產(chǎn)婦母嬰傳播是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染的重要傳播途徑，通過母嬰傳播的HBV感染者占HBV感染人群的30%以上[1]。感染HBV的新生兒超過90%會(huì)逐漸發(fā)展為HBV感染患者[2]，故孕期母嬰阻斷治療對(duì)預(yù)防新生兒感染HBV有重要意義。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是人體炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答體系的重要參與因子，其基因多態(tài)性與HBV感染的發(fā)生密切相關(guān)[3]。研究表明機(jī)體TNF-α-308 G/A基因多態(tài)性影響體內(nèi)TNF-α的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)，當(dāng)TNF-α-308位點(diǎn)為G變?yōu)锳等位基因時(shí)，機(jī)體內(nèi)TNF-α-308位點(diǎn)周圍轉(zhuǎn)錄因子無法識(shí)別激活蛋白-2，影響TNF-α的表達(dá)[4]。目前，關(guān)于TNF-α-308基因多態(tài)性與HBV感染孕產(chǎn)婦母嬰阻斷治療效果的研究報(bào)道較少，本研究選取104例HBV感染的孕產(chǎn)婦為研究對(duì)象，分析HBV感染母嬰阻斷療效的影響因素及其與TNF-α-308基因多態(tài)性的關(guān)系，為臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2018年7月至2019年12月青島市中心醫(yī)院收治的104例HBV感染母嬰阻斷治療孕產(chǎn)婦為研究對(duì)象，根據(jù)治療效果分為阻斷失敗組(21例)、阻斷成功組(83例)，所有研究對(duì)象均符合以下納入及排除標(biāo)準(zhǔn)。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合2019年版《慢性乙型肝炎防治指南》[5]中關(guān)于HBV診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡大于20歲；③HBV DNA病毒載量大于2×105IU/mL且同意接受抗病毒藥物干預(yù)；④自然妊娠、單胎、足月分娩；⑤自愿簽署本研究知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①重要臟器功能障礙者；②伴有急性感染、嚴(yán)重內(nèi)外科疾病者；③伴有惡性腫瘤、酒精等造成的肝臟損傷者；④伴有免疫功能缺陷者；⑤存在認(rèn)知或溝通障礙者；⑥近1個(gè)月內(nèi)接受過抗病毒治療者；⑦伴有甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染者；⑧入組患者之間具有親緣關(guān)系者。

1.2 方法

1.2.1 母嬰阻斷治療

所有研究對(duì)象參照《感染乙型肝炎病毒的育齡女性臨床管理共識(shí)》[6]對(duì)所有HBV感染孕產(chǎn)婦自妊娠24～28周開始服用富馬酸替諾福韋二吡呋酯或替比夫定抗病毒治療。

1.2.2 TNF-α-308基因多態(tài)性檢測(cè)

所有孕產(chǎn)婦分娩前均抽取靜脈血液3mL，乙二酸四乙酸二鉀抗凝用DNA純化試劑盒提取，嚴(yán)格按照試劑盒使用說明操作。查詢美國國立生物技術(shù)信息中心官網(wǎng)獲取人類TNF-α基因序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增TNF-α-308 G/A位點(diǎn)基因在熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀上擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增方法：反應(yīng)體系25μL：上下游引物各1μL、cDNA模板1μL，95℃預(yù)變性2min，95℃變性1min，62℃退火1min，75℃延伸1min，循環(huán)35次，最后一次75℃延伸5min，5℃終止反應(yīng)，最后分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行TNF-α-308 G/A位點(diǎn)的等位基因及基因型鑒定。TNF-α上游引物為5′-AGGCCTAATCAGGTTTTCCAT-3′，下游引物為5′-TCCTGCTGCACTCCATTCG-3′。

1.2.3 血漿HBV病毒載量檢測(cè)

所有孕產(chǎn)婦分娩前抽取空腹靜脈血5mL，肝素抗凝，抗凝全血6h內(nèi)進(jìn)行離心處理(3 000r/min離心10min，離心半徑12cm)，收集血漿，采用核酸提取儀(法國梅里埃Easy-MEG型)、病毒載量檢測(cè)儀(瑞士羅氏TaqMan96型)、HBV病毒載量檢測(cè)試劑盒(法國梅里埃公司)、PCR儀(瑞士羅氏LightCycler 96型)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量測(cè)定HBV DNA病毒載量，試驗(yàn)嚴(yán)格參照說明書標(biāo)準(zhǔn)操作。

1.3 觀察指標(biāo)

①母嬰阻斷療效。嬰兒完成主被動(dòng)免疫(嬰兒出生6h內(nèi)、出生15d分別注射200IU乙型肝炎免疫球蛋白，出生24h內(nèi)、出生后1個(gè)月、出生后6個(gè)月分組注射重組酵母乙肝疫苗10μg)，之后于7月齡時(shí)采集外周血，HBsAg陽性、HBV DNA陽性(伴或不伴HBeAg陽性)則記為阻斷失敗，否則記為阻斷成功[7]。②比較阻斷成功組和阻斷失敗組臨床資料，包括年齡、孕前體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)、產(chǎn)次、抗病毒治療藥物類型、分娩方式、HBV感染病程、產(chǎn)后是否停藥、母乳喂養(yǎng)情況，產(chǎn)后谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)水平、C反應(yīng)蛋白(C-reaction protein，CRP)含量、外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-4、IL-18，分娩前HBV基因型、乙型肝炎e抗原(Hepatitis B e antigen，HBeAg)、乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface antigen，HBsAg)、血漿HBV病毒載量、TNF-α-308基因多態(tài)性及新生兒合并口腔潰瘍情況等。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料比較

阻斷失敗組孕前BMI、ALT、C反應(yīng)蛋白、IL-6、IL-4、HBeAg、HBsAg、HBV DNA病毒載量均顯著高于阻斷成功組(P<0.05)，而IL-18顯著低于阻斷成功組(P<0.01)。兩組患者其余臨床資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組患者臨床資料比較Table 1 Comparison of clinical data of the patients between the two groups

2.2 TNF-α-308 G/A位點(diǎn)基因型頻率、等位基因頻率與HBV感染母嬰阻斷失敗的關(guān)系

TNF-α-308 G/A位點(diǎn)基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)(P>0.05)，具有群體代表性。阻斷失敗組TNF-α-308 G/A位點(diǎn)A等位基因頻率表達(dá)顯著高于阻斷成功組(P<0.05)，見表2。

表2 TNF-α-308 G/A位點(diǎn)基因型頻率、等位基因頻率與HBV感染母嬰阻斷失敗的關(guān)系[n(%)]Table 2 Relationships of genotype frequency and allele frequency of TNF-α-308 G/A locus with failed mother-to-child transmission blocking of HBV infection[n(%)]

2.3 影響HBV感染孕產(chǎn)婦母嬰阻斷失敗的多因素分析

以HBV感染孕產(chǎn)婦母嬰阻斷是否失敗為因變量(成功=0，失敗=1)，孕前BMI、ALT、CRP、IL-6、IL-4、HBeAg、HBsAg、HBVDNA病毒載量、IL-18、TNF-α-308 G/A位點(diǎn)A等位基因頻率為自變量，并將上述自變量賦值為連續(xù)變量進(jìn)行Logistic回歸分析，多因素分析顯示HBV DNA病毒載量高、TNF-α-308 G/A位點(diǎn)A等位基因頻率是HBV感染孕產(chǎn)婦母嬰阻斷失敗的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表3。

表3 影響HBV感染孕產(chǎn)婦母嬰阻斷失敗的多因素分析Table 3 Multiple factor analysis of failed mother-to-infant trasmission blocking of HBV infection

3 討論

HBV母嬰垂直傳播是家族聚集性HBV感染的重要原因，感染者發(fā)生肝硬化、肝癌的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加，且發(fā)病年齡逐代提前[8]。我國HBV攜帶者約40%為女性，部分地區(qū)孕產(chǎn)婦HBsAg陽性率可高達(dá)10%左右[9]。因此，盡早對(duì)HBV感染孕產(chǎn)婦母嬰阻斷情況進(jìn)行判斷，及時(shí)開展診療措施對(duì)改善預(yù)后意義重大。

3.1 HBV感染孕產(chǎn)婦母嬰阻斷療效的影響因素

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)阻斷失敗組孕前BMI、ALT、CRP、IL-6、IL-4、HBeAg、HBsAg、HBV DNA病毒載量均顯著高于阻斷成功組(P<0.05)，而IL-18顯著低于阻斷成功組(P<0.01)，且阻斷失敗組TNF-α-308 G/A位點(diǎn)A等位基因頻率表達(dá)顯著高于阻斷成功組(P<0.05)。多因素分析結(jié)果顯示HBV DNA病毒載量高、TNF-α-308 G/A位點(diǎn)A等位基因頻率是HBV感染孕產(chǎn)婦母嬰阻斷失敗的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，提示HBV DNA病毒載量、TNF-α-308 G/A位點(diǎn)A等位基因頻率與HBV感染孕產(chǎn)婦母嬰阻斷失敗有關(guān)。研究表明隨著母親HBV DNA病毒載量的增高，其分娩的新生兒接種HBV疫苗后出現(xiàn)免疫失敗的風(fēng)險(xiǎn)也隨之提高，即HBV感染孕產(chǎn)婦HBV DNA病毒載量越高，母嬰阻斷失敗的發(fā)生率也明顯增高[10]，與本研究結(jié)果類似，共同證實(shí)HBV感染孕產(chǎn)婦HBV DNA病毒載量與HBV感染孕產(chǎn)婦母嬰阻斷失敗相關(guān)。在HBV感染過程中TNF-α的表達(dá)與HBV感染患者病毒載量、HBeAg等密切相關(guān)，當(dāng)機(jī)體TNF-α-308位點(diǎn)由G變?yōu)锳等位基因時(shí)，機(jī)體內(nèi)TNF-α-308位點(diǎn)周圍轉(zhuǎn)錄因子無法識(shí)別激活蛋白-2，TNF-α轉(zhuǎn)錄效率增加7倍左右，造成患者體內(nèi)TNF-α表達(dá)異常，影響HBV感染后對(duì)病毒的清除作用。

3.2 TNF-α-308基因多態(tài)性與HBV感染孕產(chǎn)婦母嬰阻斷失敗的關(guān)系

TNF-α是激活細(xì)胞因子體系的啟動(dòng)因子，是誘導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，當(dāng)機(jī)體組織發(fā)生損傷、感染等不良事件后，TNF-α在人體循環(huán)中迅速高表達(dá)，使人體內(nèi)細(xì)胞級(jí)聯(lián)效應(yīng)被激活，導(dǎo)致過度炎癥，使炎性細(xì)胞活化，加劇炎性反應(yīng)，導(dǎo)致或加劇機(jī)體感染事件的發(fā)生[11]。本研究TNF-α-308 G/A位點(diǎn)基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，具有群體代表性。TNF-α-308基因多態(tài)性可能是通過機(jī)體激活蛋白-2與TNF-α基因的結(jié)合對(duì)其轉(zhuǎn)錄情況產(chǎn)生影響，激活蛋白-2具有明顯抑制TNF-α啟動(dòng)因子活性的作用，進(jìn)而影響TNF-α的表達(dá)，TNF-α-308位點(diǎn)長10bp的DNA片段可使激活蛋白-2得識(shí)別序列被激活，當(dāng)TNF-α-308位點(diǎn)等位基因?yàn)镚，激活蛋白-2可有效識(shí)別序列并相互結(jié)合，使TNF-α啟動(dòng)因子的活性受到抑制，抑制TNF-α的表達(dá)，但當(dāng)機(jī)體TNF-α-308位點(diǎn)由G變?yōu)锳等位基因時(shí)，激活蛋白-2無法識(shí)別序列，進(jìn)而影響TNF-α的表達(dá)，影響機(jī)體對(duì)HBV病毒的清除作用，增加了HBV感染孕產(chǎn)婦母嬰阻斷失敗的風(fēng)險(xiǎn)[12]。

綜上所述，TNF-α-308基因多態(tài)性與HBV感染孕產(chǎn)婦母嬰阻斷失敗相關(guān)，HBV DNA病毒載量高、TNF-α-308 G/A位點(diǎn)A等位基因頻率是HBV感染孕產(chǎn)婦母嬰阻斷失敗的危險(xiǎn)因素，但結(jié)果仍需多中心大樣本研究進(jìn)一步驗(yàn)證。