張 濤，薛瑩瑩，陳遠濤，熊憶舟，于偉杰，張鈞煜，萬 浩，張若彤，葉 瑋，王 平*

(1.浙江大學生物傳感器國家專業(yè)實驗室，生物醫(yī)學工程教育部重點實驗室，生儀學院，浙江 杭州 310027；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院，上海 200011)

口臭是指從口腔中散發(fā)出的令人不愉快或令人討厭的氣味，嚴重影響個人的社交活動[1]。已有研究表明，口臭的發(fā)病率在30%以上[2]，多達85%的病例是由牙周炎、牙齦炎或厚舌苔等口源性因素導致[3]。當口腔衛(wèi)生或健康狀況出現問題時，革蘭氏陰性菌等厭氧細菌會大量增殖，通過分解含硫氨基酸產生揮發(fā)性含硫化合物(Volatile Sulfur Compounds，VSCs)導致口臭[4]。其中硫化氫和甲硫醇作為口源性口臭的標志物已經被逐漸地應用于臨床上對口臭的評估[5]，因此檢測口腔內這兩種揮發(fā)性硫化物的種類和濃度，對口臭的診斷及進一步治療有重要的意義。

當前口臭的診斷方法主要包括感官評分法，氣相色譜法，便攜式氣相色譜儀和便攜式硫化物檢測儀等[6]。其中感官評分法是利用人的嗅覺器官-鼻子來評價口臭的強度，被認為是口臭檢測的金標準，目前國內外應用最廣泛的為20世紀90年代Rosenberg提出的0~5分制感官評分標準，將口臭嚴重程度分為了6個等級[7]。但由于不同個體甚至是同一個體在不同狀態(tài)下嗅覺敏感度是有差異的，因此就有必要對辨嗅員進行培訓，以達到統一標準。氣相色譜法能對口腔呼出氣體中的VSCs進行定性和定量分析，適用于需要精確知道VSCs種類和濃度的場合，但因設備昂貴、操作復雜，在臨床上的應用并不常見。便攜式氣相色譜儀“Oral Chroma”以空氣作為載氣，能同時測量硫化氫、甲硫醇和二甲基硫三種硫化物的濃度；便攜式硫化物檢測儀“Halimeter”只能測量出口腔中VSCs的總濃度，無法區(qū)分硫化物的種類。作為商用的口臭診斷儀器，便攜式氣相色譜儀和硫化物檢測儀因為價格較高、便攜性差等因素，其使用范圍只能局限于口腔門診。

口臭會對個人形象帶來嚴重的負面影響，而不少口臭患者卻沒有意識到自己患有口臭。隨著人們社交活動越來越頻繁，設計一種具有個人或家庭使用前景的口臭標志物檢測及口臭等級判別的電子鼻具有重要的現實意義。本研究利用氣相色譜與質譜聯用技術(Gas Chromatography-Mass Spectroscopy，GC-MS)建立了基于口腔呼出氣體中VSCs檢測的標準化流程，分析了GC-MS測量結果與感官評分的關系并確定了不同感官評分間的VSCs濃度閾值。并以GC-MS的檢測結果作為傳感器篩選的前提，在此基礎上設計了一套用于口臭標志物定量檢測及口臭等級判別的電子鼻系統。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和儀器

實驗過程使用的材料及儀器包括:100 mL Tedlar采樣袋，GC-MS(QP2010 Plus，島津，日本)，GS-GasPro色譜柱(30 m×0.32 mm，安捷倫，美國)，氣密性進樣針(1 mL，島津，日本)，配氣儀(Gas Blender 100 Series，MCQ Instruments，意大利)，硫化氫標準氣體(1.06×10-7mol/mol)，甲硫醇標準氣體(1.04×10-7mol/mol)，二甲基硫標準氣體(1.0×10-7mol/mol)，高純氦氣(99.999%)，標準空氣。

1.2 實驗過程

1.2.1 口腔檢查

口腔檢查過程在上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院口腔預防科進行。受試者的入選標準為:①未患有全身系統性疾病的成年就診者；②受試前三個月未進行牙周治療，包括預防性潔治、齦下刮除和牙周手術；③受試前兩周內沒有抗生素服用史。所有受試者在接受檢查前未使用嗽口水、抽煙、飲酒及食用洋蔥、大蒜等辛辣食物，口腔檢查過程在上午8:30~12:00間進行。

牙科醫(yī)生對入選標準內的就診患者進行了口腔健康檢查和感官評分。口腔健康檢查主要查看受試者是否患有牙齦炎、牙周炎或厚舌苔。感官評分由訓練有素的辨嗅員對受試者的口臭等級作出評價，操作步驟為:受試者口含長度為10 cm的一次性醫(yī)用無菌吸管的一端，吸管的另一端穿過屏風中間的小孔到達辨嗅員鼻前約2 cm~3 cm處。測試時受試者先緊閉雙唇1 min，然后緩慢呼氣，辨嗅員根據聞到的氣味給出感官評分。采用0~5分制感官評分標準對口臭嚴重程度進行等級量化:0分表示無口臭；1分表示幾乎沒有明顯的口臭；2分表示輕微但能明顯聞到的口臭；3分表示中等程度的口臭；4分表示強烈的口臭；5分表示非常難聞的口臭。

1.2.2 口氣樣本采集及GC-MS檢測的標準化流程

Tedlar采樣袋在使用前經過了老化處理，以消除背景對檢測結果的影響?？跉鈽颖静杉瘯r首先將一次性無菌特氟龍管的一端與Tedlar采樣袋的進氣口連接，受試者口含特氟龍管的另一端并緊閉嘴唇30 s，然后緩慢打開采樣袋的閥門，受試者平穩(wěn)呼吸，通過特氟龍管向采樣袋內緩慢呼氣，待收集滿100 mL口氣樣本后立即關閉采樣袋的閥門。一個成人每次呼吸會排出約500 mL氣體，其中前150 mL氣體是來自上呼吸道和鼻咽，后350 mL氣體來自肺部[8]，因此采集到的100 mL口氣樣本基本不會受到肺泡氣的干擾。每個采樣袋上會注明該患者的就診信息及感官評分。

檢測時GC柱溫箱的起始溫度設置為80℃，以40℃/min的升溫速率將柱箱溫度升至220℃，并在該溫度下保持2 min；采用分流進樣方式，分流比設置為4，進樣口的溫度設置為100℃；流量控制方式設置為恒壓模式，柱流量設置為2.59 mL/min，吹掃流量設置為3 mL/min。MS離子源的溫度設置為200℃，接口溫度設置為250℃，轟擊電子能量設置為70 eV；采用SIM模式進行檢測，硫化氫、甲硫醇和二甲基硫的定量離子分別為m/z＝34、m/z＝47和m/z＝62，整個檢測程序的運行時間為5.5 min。

氣體樣本進行分析時首先將容量為1 mL的氣密性進樣針扎進采樣袋，來回推拉進樣針的活塞3次，以去除死腔氣體；然后抽取1 mL樣本，迅速轉移至GC進樣口，勻速推擠活塞直至全部氣體進入GC中；最后點擊GC面板的“Start”按鈕后儀器便開始分析。從總離子流圖(圖1)中可知硫化氫、甲硫醇和二甲基硫的保留時間分別為1.50 min、3.05 min和4.85 min。

圖1 硫化氫、甲硫醇和二甲基硫的總離子流圖

采用外標法對口氣樣本中的VSCs進行定量分析，三種硫化物的標準曲線如圖2所示，由圖可知標準曲線具有良好的線性度(R2>0.995)。對檢測方法進行回收率和精密度實驗，結果顯示三種硫化物的回收率在92%~97%之間，相對標準偏差(RSD)<6%，表明本文所建立的使用GC-MS對口氣樣本中的硫化氫、甲硫醇和二甲基硫進行定量檢測的方法是可行的。

圖2 硫化氫、甲硫醇和二甲基硫的標準曲線

2 臨床結果分析

2.1 臨床樣本統計

本文研究時共采集了102例臨床樣本，詳細信息如表1所示。

表1 臨床樣本的基本信息

102例患者口氣中的VSCs濃度(硫化氫、甲硫醇和二甲基硫的濃度和)分布在2×10-9~2 569×10-9之間，濃度值的中位數和四分位間距分別為159×10-9和277×10-9，感官評分范圍在0~4分之間，共5個等級。

感官評分是基于口腔呼出氣體中VSCs及其他致臭氣體給人嗅覺系統造成不愉悅程度的一個綜合評價。已有研究表明，沒有一種純粹的氣體具有口臭的特征，實際的口腔異味由多種氣味分子組成，產生主要和次要的氣味[9]。進一步地，采用Spearman相關分析法對GC-MS的測量結果與感官評分之間的相關性進行分析，統計結果見表2。由統計結果可知GC-MS測量的硫化氫、甲硫醇以及VSCs濃度均與感官評分呈顯著正相關(P<0.05)，而二甲基硫濃度與感官評分之間不具有顯著相關性(P>0.05)。VSCs為三種硫化物的濃度和，若以VSCs*表示硫化氫和甲硫醇的濃度和，其與感官評分的相關系數明顯大于VSCs與感官評分的相關系數，表明口腔中存在的二甲基硫不是導致口臭的主要因素，因此可以將硫化氫和甲硫醇的濃度和作為評價口臭嚴重程度的指標。此外，硫化氫濃度與感官評分的相關系數大于甲硫醇濃度與感官評分的相關系數，表明硫化氫是比甲硫醇更為關鍵的致臭氣體。

表2 GC-MS測量的各指標與感官評分相關性分析

2.2 不同感官評分間的VSCs濃度閾值

本文采用受試者工作曲線分析方法確定不同感官評分間的VSCs濃度閾值。受試者工作曲線(Receiver Operating Characteristic Curve，簡稱ROC曲線)又稱為ROC曲線，廣泛應用于生物醫(yī)學研究中以評估診斷的準確性。在二分類問題(例如“有病”或“無病”)中，診斷測試的決定通常基于某標記物是否超過閾值。對于未患病的個體，診斷測試可能給出陽性結果，而對于患病的個體則可能給出陰性結果，靈敏度定義為患病個體被正確預測為患有疾病的概率，特異性定義為未患病個體能被正確預測為陰性的概率。這些概率隨標記物閾值的變化而改變，ROC曲線針對所有可能的閾值繪制出靈敏度和1-特異度曲線，并通過ROC曲線下面積(AUC)來評估診斷效果[10]。當AUC＝0.5時，表示診斷結果與隨機猜測一樣，沒有價值；當0.50.9時，表示診斷效果極好。AUC面積衡量的是所有診斷閾值的靈敏度和特異度，但是無法提供診斷所需的最佳閾值，臨床上通常將約登指數(Youden’s Index，YI＝靈敏度＋特異性-1)最大值對應的點作為最佳診斷閾值，此處靈敏度與特異性之和最大[11]。

定義變量n和m，其中n表示感官評分值，m＝(2n＋1)/2。前面的分析已經表明二甲基硫不是導致口臭的關鍵因素，因此后面提到的VSCs僅代表硫化氫和甲硫醇的濃度和。使用ROC曲線分析方法確定感官評分n分和n＋1分間的VSCs濃度閾值時，將102個臨床樣本中感官評分值小于m的樣本定義為一類，大于m的定義為另一類。例如確定感官評分0分和1分間的VSCs濃度閾值時，將評分為0分的樣本定義為一類，感官評分為1~4分的樣本定義為另一類，在ROC曲線上通過尋找約登指數最大的點來確定最佳的濃度閾值。由圖3可知采用ROC曲線分析方法對GC-MS測量的VSCs濃度值進行閾值劃分時，ROC曲線均在參考線上方且AUC有意義(P<0.05)。除了在確定感官評分為2分和3分間的閾值時AUC小于0.8，在其余三個閾值處都表現出了較高的診斷價值，尤其是在確定3分和4分間的閾值時其AUC大于0.9，表現出了極好的診斷價值。表3列出了不同感官評分間的VSCs濃度閾值。

圖3 不同感官評分間VSCs濃度閾值的ROC曲線分析結果

由于感官評分的評價主體是人，即便辨嗅員經過嚴格訓練，在評價口臭的嚴重程度時仍存在一定主觀性，尤其是對0分和1分的評估容易互相交叉。從Rosenberg量表的描述來看，0分和1分給嗅覺系統帶來的感受幾乎沒有區(qū)別，因此臨床上通常將感官評分為0分和1分的患者定義為無口臭，感官評分大于1分的患者定義為有口臭。按照本文的分析結果(表3)，如果測量的VSCs濃度超過155×10-9時，那么可以認為該患者患有口臭，這一閾值非常接近Halimeter生產廠商提供的診斷口臭的閾值(110×10-9)。

表3 不同感官評分間VSCs濃度閾值的診斷效果

3 電子鼻系統

3.1 電子鼻系統的設計

由前面分析可知口臭患者呼出氣體中VSCs濃度在ppb級別，因此對傳感器的檢測下限、靈敏度、分辨率和特異性有極高的要求。導致口臭的關鍵惡臭氣體為硫化氫和甲硫醇，對二元混合氣體的定量分析，至少需要兩個氣敏特性不同的氣體傳感器[12]，因此本文選擇一個硫化氫和一個甲硫醇電化學傳感器組成傳感器陣列。電子鼻通過特氟龍接口與Tedlar采樣袋的進氣口連接，并通過電磁閥控制氣路的切換實現檢測和清洗。電子鼻系統功能實現流程如圖4所示。

圖4 電子鼻系統的軟硬件流程圖

恒電位電路使電化學傳感器的參比電極與對電極保持固定的壓差，以提高傳感器的選擇性及輸出信號的穩(wěn)定性。傳感器與痕量的硫化氫或甲硫醇發(fā)生反應產生氧化電流，經過I/V轉換電路后被轉換成電壓信號，進而通過放大和濾波電路實現信號調理。微處理器的ADC將經過調理的電壓信號轉換為數字信號并通過串口發(fā)送到PC端的數據采集軟件，至此便能獲取電子鼻的輸出響應譜圖。呼吸譜圖是一系列傳感器響應的結果，電子鼻經過訓練后可以通過模式識別算法對呼出氣體中的VSCs進行定性和定量分析。

由于本文對痕量物質的檢出能力和定量能力很重視，因此儀器檢出限是評價電子鼻性能的核心參數。電子鼻的檢出限是指目標氣體在給定的置信區(qū)間(可接受的精密度與正確水平)能區(qū)別于儀器噪聲被定性檢出的最低濃度或含量。由前面GC-MS測量的結果可知，口腔呼出氣體中VSCs濃度在ppb級別，因此電子鼻的檢出限對口氣中痕量VSCs的識別至關重要。

采用三倍噪音值法計算檢出限，即利用已知低濃度樣品與空白樣品的測量信號進行比較，當被測樣品的響應等于空白測量響應標準偏差的三倍時，此時被測樣品的濃度或含量便為儀器的檢出限，計算公式如下:

式中:DL表示儀器檢出限，N表示經過多次測量的空白響應標準偏差，k表示傳感器在低濃度范圍時標準曲線的斜率。

利用配氣儀將原始濃度的硫化氫(1.06×10-7mol/mol)和甲硫醇(1.04×10-7mol/mol)標準氣體稀釋成所需的濃度，分別測試電子鼻對這兩種氣體的檢出限。圖5(a)為通入10s濃度為50×10-9的硫化氫與空白響應的對比，可見當硫化氫濃度為50×10-9時，傳感器響應值明顯高于三倍空白響應的標準偏差。將標準曲線的斜率及經過多次測量的空白響應標準偏差代入上述計算式，可知電子鼻對硫化氫的檢出限為39×10-9；采取同樣的測試方法可知電子鼻對甲硫醇的檢出限為48×10-9。

呼出氣體中含有成分復雜的揮發(fā)性含氮化合物及揮發(fā)性有機化合物，本文所使用的電化學傳感器理論上只對含硫的還原性氣體交叉敏感，為了驗證所使用的電化學傳感器是否具有優(yōu)異的特異性，使用遠高于正常人呼吸背景濃度的氨氣和乙醇對電子鼻進行測試。測試時，硫化氫和甲硫醇的濃度為50×10-9，乙醇和氨氣的濃度為5 000×10-9，圖5(b)為甲硫醇傳感器在四種氣體下的響應電壓曲線，可知即便氨氣和乙醇等干擾氣體的濃度為目標氣體的100倍，但其響應仍遠小于接近檢出限濃度的目標氣體，表明所使用的電化學傳感器具有優(yōu)異的特異性。

圖5 電子鼻的性能測試

3.2 電子鼻系統的定量分析

常規(guī)的模式識別算法通常需要進行復雜的預處理以提取特征，而卷積神經網絡可以直接從輸入的原始數據中提取特征，不需要進行復雜的預處理[13]。一維卷積神經網絡能從較短的數據片段中提取有用的特征值[14]，很適合應用于一維傳感器信號的分析，因此本文采用一維卷積神經網絡實現氣體的定性和定量檢測。

在電子鼻的定量算法模型構建時，配制了7個濃度水平的VSCs(100×10-9、200×10-9、400×10-9、600×10-9、800×10-9、1 000×10-9、1 200×10-9)混合氣體樣本，每個VSCs濃度下甲硫醇和硫化氫設置9個不同的濃度比值(1∶0，4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，0∶1)，每個濃度比值重復測量三次，采集電子鼻的輸出響應譜圖，因此共有7×9×3＝189個用于訓練的樣本。

本文設計的一維卷積神經網絡的結構由輸入層、3個卷 積 模 塊(Conv1D＋Batch Normalization＋ReLU)、3個一維最大池化層(Maxpooling1D)、一個全局最大池化層(Global Max Pooling，GMP)和2個全連接層(Fully-Connected，FC)構成(如圖6所示)。對采集的響應譜圖去除基線后進行10倍降采樣，每個波形截取295個點，然后將每個比值下的一組波形拼接成一個1×590的一維數組作為神經網絡的輸入信號。將三種不同大小的卷積核應用于卷積層，三個卷積核的大小分別為1×7，1×5和1×3，步長為1，每個卷積層后連接一個一維最大池化層進行數據降維。全局最大池化層用來匯合卷積層提取的特征，其后與全連接層相接，對64個特征進行合適的變換并與標簽之間進行回歸計算。y為每個輸入信號的標簽，其中y1和y2分別表示甲硫醇和硫化氫濃度。

圖6 構建定量算法的一維卷積神經網絡結構示意圖

利用配氣系統配制300×10-9、500×10-9、700×10-9和900×10-9四個濃度水平的VSCs對電子鼻進行測試，每個VSCs濃度下甲硫醇和硫化氫設置3個濃度比值(1∶2，2∶1，1∶1)，每個比值測量三次并獲取電子鼻的輸出響應譜圖。將36個測試集的響應曲線譜圖輸入定量算法模型進行計算，利用式(2)計算預測值和實際值之間平均相對誤差，結果顯示模型計算出的VSCs(硫化氫和甲硫醇的濃度和)濃度和實際值之間的平均相對誤差為6.2%。

上式中AVE_E表示平均相對誤差，N表示測試樣本的個數，表示第i個樣本的預測結果，表示第i個樣本的實際濃度值。

進一步地，從臨床上采集20個口氣樣本同時進行GC-MS和電子鼻定量檢測，以GC-MS的測量結果作為金標準，將電子鼻的檢測結果與GC-MS的檢測結果進行比較，結果表明該電子鼻檢測實際臨床樣本中VSCs濃度的平均相對誤差為11.4%。本文第3.2節(jié)通過ROC曲線分析方法確定了不同感官評分間的VSCs濃度閾值，從而獲取每個感官評分的VSCs濃度范圍，當電子鼻完成實際樣本檢測后，可以根據其VSCs濃度所處的范圍確定該樣本的感官評分。每個采樣袋上事先標注了辨嗅員給出的感官評分，以該評分作為金標準時，將電子鼻的評分與辨嗅員的感官評分進行對比，結果顯示電子鼻對口臭等級判別的正確率為80%。由于實際樣本中VSCs濃度極低，且背景成分極其復雜。與此同時，硫化氫和甲硫醇極易吸附在電子鼻的氣路中，從而增大檢測值與實際值的偏差，但11.4%的平均相對誤差和80%的口臭等級判別正確率已經能足夠表明該電子鼻具有良好的定量及口臭分級作用，可以替代辨嗅員對口臭患者進行感官評分。

3 結論

本文利用GC-MS對呼出氣體中的VSCs進行了定性和定量檢測，通過相關性分析表明VSCs濃度值可以作為評估口臭等級的指標，結合ROC曲線分析方法確定了不同感官評分的VSCs濃度范圍。在GC-MS測量結果的基礎上，研制了一套基于電化學傳感器并結合卷積神經網絡模型的電子鼻，該電子鼻對硫化氫和甲硫醇的檢出限分別為39×10-9和48×10-9，并具有優(yōu)異的抗干擾性能。本電子鼻檢測已知濃度的標準品時候，測量結果和實際濃度之間的平均相對誤差為6.2%。實際口氣樣本檢測時，與GC-MS檢測結果比較，該電子鼻檢測實際臨床樣本中VSCs濃度的平均相對誤差為11.4%；以辨嗅員給出的感官評分作為金標準，該電子鼻對口臭等級判別的正確率為80%。

當前臨床上通過口臭檢查輔助診斷口源性與非口源性疾病的研究得到了越來越多的重視，但僅對口臭進行分級還不能有效地診斷疾病。進一步的研究將對口臭患者和健康人的唾液以及舌苔中微生物的代謝組學進行分析，篩選出潛在的口臭及口源性疾病的生物標志物，并結合電子舌技術，研制對這些潛在標志物具有特異性的傳感器。最終采用多傳感器融合算法對電子鼻與電子舌數據同時分析，建立更加準確的口臭及口源性疾病診斷模型。