萬(wàn)恒東 岳文濤 趙鋒 商憲富 陳道文 王思文 孫明超 劉權(quán)
摘 要:AMEP蛋白是從枯草芽孢桿菌中分離鑒定出來(lái)的一種新型蛋白激發(fā)子,能夠誘導(dǎo)植物防衛(wèi)反應(yīng)并提高植物的抗病性,是生物農(nóng)藥的理想候選。在前期的研究中發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽對(duì)AMEP蛋白表達(dá)水平有很大影響。為了最大限度地提高AMEP蛋白的產(chǎn)量,通過(guò)在AMEP蛋白的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加多種無(wú)機(jī)鹽,研究不同種類的無(wú)機(jī)鹽對(duì)AMEP蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果表明,磷酸鈣和磷酸氫二鈉能顯著提高AMEP蛋白的表達(dá)水平,而氯化鈉、氯化鈣、硫酸鋅則顯著降低了AMEP蛋白的表達(dá)水平。當(dāng)磷酸鈣用量為2g/L時(shí),AMEP蛋白表達(dá)產(chǎn)量最高。
關(guān)鍵詞:AMEP;無(wú)機(jī)鹽;蛋白產(chǎn)量;磷酸鈣;氯化鈉
中圖分類號(hào) Q936? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731(2021)18-0024-03
Effects of Inorganic Salts on the Expression of AMEP Protein
WAN Hendong1 et al.
(1Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing163300, China)
Abstract: AMEP protein is a new Protein Elicitor isolated from Bacillus subtilis. It can induce plant defense response and improve plant disease resistance. It is an ideal candidate for new biological pesticides. In the previous study, it was found that the inorganic salts in the medium had a great influence on the expression level of AMEP protein. In order to maximize the production of AMEP protein, the effects of different inorganic salts on the expression of AMEP protein were determined by adding a variety of inorganic salts to the culture medium of AMEP protein. The results showed that calcium phosphate and disodium hydrogen phosphate significantly increased the expression level of AMEP protein, while sodium chloride, calcium chloride and zinc sulfate significantly decreased the expression level of AMEP protein. It was found that the expression yield of AMEP protein was the highest when the dosage of calcium phosphate was 2g/L.
Key words: AMEP; Inorganic salt; Protein yield; Calcium phosphate; Sodium chloride
在我國(guó),常采用施用化學(xué)農(nóng)藥的方式來(lái)防治農(nóng)作物病害,以保障農(nóng)作物的產(chǎn)量與質(zhì)量。然而,大量施用化學(xué)農(nóng)藥不僅會(huì)破壞耕種土地的土壤生態(tài)環(huán)境,而且有害生物的抗藥性也會(huì)因此而增強(qiáng)[1-2],因此近年來(lái)生物農(nóng)藥的研究逐漸成為熱點(diǎn)。蛋白激發(fā)子是來(lái)自于微生物的一類蛋白質(zhì),可與植物細(xì)胞表面相應(yīng)的受體特異性結(jié)合,誘導(dǎo)植物發(fā)生防衛(wèi)反應(yīng)[3],提高植物的抗病能力,被視為生物農(nóng)藥的理想候選。
AMEP蛋白是從芽孢桿菌中分離出來(lái)的一種新型蛋白激發(fā)子,包含76個(gè)氨基酸殘基,其相對(duì)分子質(zhì)量為8.36kDa[4]?,F(xiàn)有研究表明,AMEP蛋白可以與植物相互作用并引起一系列的防衛(wèi)反應(yīng),該蛋白兼具拮抗植物病原菌和殺傷有害昆蟲的功能[5-6],可將其用于生物防治來(lái)保障植物的健康生長(zhǎng),是蛋白類生物農(nóng)藥的理想材料[7]。
在AMEP蛋白的前期鑒定過(guò)程中,研究者分別使用LB培養(yǎng)基和YME培養(yǎng)基對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行培養(yǎng),結(jié)果顯示,使用LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)無(wú)法檢測(cè)到AMEP的表達(dá),而使用YME培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)AMEP蛋白表達(dá)水平顯著提升。經(jīng)過(guò)比較,2個(gè)培養(yǎng)基的主要差別為YME培養(yǎng)基中不含有氯化鈉,說(shuō)明氯化鈉抑制了蛋白表達(dá)。已有研究表明,培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽的種類與用量會(huì)影響到微生物的發(fā)酵產(chǎn)量[8],因而需要對(duì)培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽的種類和用量進(jìn)行深入,以提高AMEP蛋白的表達(dá)水平。
本研究以YME培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加不同種類的無(wú)機(jī)鹽,探討其對(duì)AMEP蛋白表達(dá)水平的影響,以確定最適無(wú)機(jī)鹽的種類;并對(duì)最適無(wú)機(jī)鹽的用量進(jìn)行梯度優(yōu)化,確定最適無(wú)機(jī)鹽用量,旨在為提高AMEP蛋白的產(chǎn)量提供科學(xué)依據(jù)。
1 實(shí)驗(yàn)材料
本實(shí)驗(yàn)所用菌株為枯草芽孢桿菌BU412,由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存于中國(guó)模式菌種收集中心(CCTCC M2016142),用于AMEP蛋白的表達(dá)。
YME培養(yǎng)基:麥芽糖10g/L、酵母提取物4g/L、葡萄糖4g/L、pH7.2,用于枯草芽孢桿菌BU412的菌株培養(yǎng)。低鹽緩沖液:20mM Tris–HCl(PH7.5),高鹽緩沖液:20mM Tris–HCl 1M NaCl(PH7.5),用于AMEP蛋白的純化。
本次試驗(yàn)所用到的無(wú)機(jī)鹽為氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、氯化鈣、磷酸鈣、硫酸鋅、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉,均為分析純?cè)噭?/p>
2 實(shí)驗(yàn)方法
2.1 無(wú)機(jī)鹽種類的篩選 挑取枯草芽孢桿菌BU412的單菌落進(jìn)行接種至100mL的YME液體培養(yǎng)基中,在32°C、160r培養(yǎng)12h。按1∶100的比例,分別將3mL的種子液接入300mL的YME液體培養(yǎng)基中,共8瓶。這8瓶培養(yǎng)基中分別含有不同種類的無(wú)機(jī)鹽,分別為氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、氯化鈣、磷酸鈣、硫酸鋅、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉,各無(wú)機(jī)鹽的用量均為1g/L。隨后對(duì)上述培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),在32°C、160r條件下培養(yǎng)22h。
將培養(yǎng)完成的枯草芽孢桿菌BU412于4℃條件下16000g離心15min,獲得培養(yǎng)液上清。將上清液通過(guò)0.22μM的濾膜過(guò)濾,用于蛋白質(zhì)純化。蛋白質(zhì)純化采用的是AKTA Purifier蛋白純化儀,先用低鹽緩沖液預(yù)平衡5ML的Hitrap Q hp的陰離子交換柱,之后將上清液上樣加入陰離子交換柱上,流速為1mL/min。上樣完成后,使用3倍柱體積的低鹽緩沖液進(jìn)行平衡,使用40%的高鹽緩沖液進(jìn)行洗脫,并收集蛋白樣品。離子交換純化后的蛋白經(jīng)過(guò)截留體積為30kDa的超濾管進(jìn)行進(jìn)一步除雜,除去小分子量的雜蛋白,截留的蛋白樣品即為AMEP蛋白。
使用紫外微量分光光度計(jì)Nanodrop對(duì)純化后的AMEP蛋白進(jìn)行濃度測(cè)定,經(jīng)換算得到AMEP蛋白的表達(dá)產(chǎn)量。以AMEP蛋白的表達(dá)量為參考指標(biāo),篩選出最適無(wú)機(jī)鹽的種類。
2.2 無(wú)機(jī)鹽濃度的篩選 在確定最適的無(wú)機(jī)鹽后,按2.1中所述的方法條件培養(yǎng)枯草芽孢桿菌,改變YME培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽的濃度(0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L),在32°C、160rpm條件下培養(yǎng)22h,收集菌體。參照2.1所述方法分離純化AMEP蛋白并檢測(cè)蛋白濃度,得到AMEP蛋白的表達(dá)產(chǎn)量。以AMEP蛋白的表達(dá)量為參考指標(biāo),篩選出無(wú)機(jī)鹽的最佳濃度。
3 結(jié)果與分析
3.1 無(wú)機(jī)鹽種類對(duì)AMEP蛋白產(chǎn)量的影響 利用Origin 8.5對(duì)通過(guò)紫外微量分光光度計(jì)檢測(cè)得到的AMEP蛋白表達(dá)產(chǎn)量進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并繪制方差柱形圖。在使用不同的無(wú)機(jī)鹽對(duì)BU412菌株培養(yǎng)的條件下,菌株發(fā)酵生產(chǎn)AMEP蛋白的表達(dá)水平如圖1所示,磷酸鈣和磷酸氫二鈉能顯著提高AMEP蛋白的表達(dá)水平;磷酸二氫鈉和氯化鉀的AMEP蛋白表達(dá)水平與空白對(duì)照組無(wú)顯著差異;氯化鈉、氯化鈣、硫酸鋅和氯化鎂則顯著降低AMEP蛋白表達(dá)水平。以上結(jié)果說(shuō)明無(wú)機(jī)鹽種類對(duì)AMEP蛋白產(chǎn)量影響較大,尤其是一些無(wú)機(jī)鹽的存在會(huì)極大地限制AMEP蛋白的表達(dá),今后在AMEP蛋白的表達(dá)過(guò)程中要注意避免使用此類無(wú)機(jī)鹽。由于磷酸鈣和磷酸氫二鈉都會(huì)顯著提高AMEP蛋白的表達(dá)水平,但由于兩者相比,磷酸鈣效果更加顯著,因此確定最適無(wú)機(jī)鹽為磷酸鈣,后續(xù)的最適無(wú)機(jī)鹽用量也在此基礎(chǔ)上進(jìn)行。
3.2 最適磷酸鈣的用量 在確定磷酸鈣為最適無(wú)機(jī)鹽后,本文對(duì)培養(yǎng)基中磷酸鈣的最適用量進(jìn)行了篩選。經(jīng)過(guò)蛋白純化和濃度測(cè)定,制作柱形圖,得到AMEP蛋白的表達(dá)水平如圖2所示。由圖2可知,磷酸鈣的用量小于2g/L時(shí),AMEP蛋白的表達(dá)量會(huì)隨著磷酸鈣用量的增加而升高;當(dāng)磷酸鈣的用量為2g/L時(shí),AMEP蛋白表達(dá)量達(dá)到最大;而當(dāng)磷酸鈣的用量大于2g/L時(shí),AMEP蛋白表達(dá)量會(huì)逐漸下降。由此確定,AMEP蛋白表達(dá)培養(yǎng)基中的磷酸鈣最適用量為2g/L。
4 討論
已有研究表明,菌株發(fā)酵除受到發(fā)酵條件的限制外,培養(yǎng)基的組成也是一個(gè)至關(guān)重要的影響因素[10]。無(wú)機(jī)鹽是微生物生長(zhǎng)和代謝不可或缺的重要營(yíng)養(yǎng)成分[11],其具有構(gòu)成菌體細(xì)胞成分,作為酶的組成部分、酶的激活劑或抑制劑,調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓、pH,氧化還原電位等作用。盡管微生物對(duì)于無(wú)機(jī)鹽的需求量很少,但是在發(fā)酵過(guò)程中有可能會(huì)因?yàn)闊o(wú)機(jī)鹽的種類以及無(wú)機(jī)鹽的用量而不能滿足菌體的生長(zhǎng)以及代謝產(chǎn)物的要求,從而影響到微生物的發(fā)酵產(chǎn)量[12]。本次實(shí)驗(yàn)的目的是探究培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽的種類及用量對(duì)AMEP蛋白表達(dá)產(chǎn)量的影響。
在添加的無(wú)機(jī)鹽為磷酸鈣時(shí),AMEP蛋白的表達(dá)產(chǎn)量表現(xiàn)為最高;在添加的無(wú)機(jī)鹽為氯化鉀、磷酸氫二鈉時(shí),AMEP蛋白的表達(dá)產(chǎn)量與空白對(duì)照組相似;在添加的無(wú)機(jī)鹽為氯化鈉、硫酸鋅、氯化鈣和氯化鎂時(shí),AMEP蛋白的表達(dá)產(chǎn)量均顯著低于空白對(duì)照組。值得注意的是,在培養(yǎng)基中加入氯化鈉時(shí),AMEP蛋白的表達(dá)量最低,解釋了之前的研究中使用LB作為培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵無(wú)法得到AMEP蛋白。這些結(jié)果說(shuō)明不同種類的無(wú)機(jī)鹽對(duì)AMEP蛋白表達(dá)產(chǎn)量的影響各不相同[13],且用于發(fā)酵生產(chǎn)AMEP蛋白的最適無(wú)機(jī)鹽為磷酸鈣。
由相關(guān)研究可知,磷是微生物生長(zhǎng)代謝活動(dòng)中的重要元素,既參與了磷脂、核酸以及多種輔酶的構(gòu)成,也在代謝調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要作用。而在微生物發(fā)酵中鈣離子主要參與細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理狀態(tài),具有降低細(xì)胞膜的通透性、維持細(xì)胞的膠體狀態(tài)的作用[14]。磷酸鈣可能在AMEP蛋白外分泌表達(dá)過(guò)程中的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)信號(hào)通路和細(xì)胞膜通透方面起到了促進(jìn)作用,在一定程度上解釋了為何磷酸鈣可以顯著提高AMEP蛋白表達(dá)產(chǎn)量。
據(jù)相關(guān)研究表明,無(wú)機(jī)鹽的用量表現(xiàn)為在適當(dāng)濃度范圍時(shí),會(huì)提高蛋白的表達(dá)水平;當(dāng)使用的無(wú)機(jī)鹽用量不在此類無(wú)機(jī)鹽用量的最適濃度范圍內(nèi)時(shí),仍會(huì)對(duì)蛋白的表達(dá)水平產(chǎn)生影響,但影響的程度均會(huì)小于此類無(wú)機(jī)鹽最適用量對(duì)蛋白表達(dá)水平的影響[15]。雖然磷酸鈣對(duì)AMEP蛋白的表達(dá)具有促進(jìn)作用,但其用量也不是越大越好,經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定最適用量為2g/L。此研究結(jié)果可為今后提高AMEP蛋白的表達(dá)水平提供參考。
5 結(jié)論
本研究通過(guò)探討培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽的種類及用量對(duì)AMEP蛋白表達(dá)水平的影響,最終確定了發(fā)酵生產(chǎn)AMEP蛋白的最適無(wú)機(jī)鹽為磷酸鈣,其最適用量為2g/L。這一結(jié)果將為最大限度地提高AMEP蛋白的表達(dá)水平以及將AMEP蛋白相關(guān)產(chǎn)品應(yīng)用于植物病蟲害防治提供了科學(xué)依據(jù)。
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(責(zé)編:張宏民)