盧 海 李增強 唐美瓊 羅登杰 曹 珊 岳 嬌 胡亞麗 黃 震 陳 濤 陳 鵬,*

1 廣西大學農學院 / 廣西高校植物遺傳育種重點實驗室, 廣西南寧 530004; 2 廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所, 廣西南寧530004

鎘是植物生長發(fā)育過程中的非必需微量元素,不僅影響植物生長發(fā)育, 過量的鎘還會造成植物死亡, 并且通過在植物體內積累被食用后會威脅人類的生命健康。因此, 植物對重金屬鎘的吸收是環(huán)境污染研究領域的一個熱點問題[1]。紅麻(Hibiscus cannabinusL.)是世界上重要的韌皮纖維作物, 主要用于紡織、造紙、建材和飼料等方面, 是一種多用途作物[2]。紅麻生長速度快、生物量大、對重金屬具有極強的吸附力和耐受性, 是重金屬污染土壤良好的替代種植材料[3]。

DNA甲基化在維持基因組穩(wěn)定性、調控基因表達和響應生物及非生物脅迫等方面具有重要作用[4-5]。甲基化敏感擴增多態(tài)性(methylation sensitive amplified polymorphism, MSAP)技術是在擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)技術的基礎上發(fā)展而來的, 它與AFLP同樣基于PCR擴增多態(tài)性, 不同的是MSAP技術利用2種識別CCGG序列的同裂酶HpaII和MspI, 替換了AFLP分析中識別4堿基的內切酶MseI, 并且MSAP技術操作簡單、多態(tài)性高, 已成功應用于檢測多種植物基因組DNA甲基化水平變化中[6-7]。張凱凱等[8]利用MSAP技術檢測不同濃度鎘脅迫對孔雀草基因組DNA甲基化水平的變化發(fā)現, 其甲基化水平隨著鎘濃度的提高而上升, 甲基化模式變化主要以重新甲基化為主, 并推測孔雀草受到環(huán)境中重金屬脅迫時,植物體通過改變DNA甲基化來調控基因的表達, 以應對不良環(huán)境對自身的影響, 從而達到抵御重金屬脅迫的作用。李照令等[9]運用MSAP技術發(fā)現, 隨著鎘脅迫濃度的升高, 擬南芥基因組DNA甲基化水平逐漸降低, 但均高于對照, 且基因組去甲基化位點增多。有研究表明, 鎘脅迫能夠引起DNA總甲基化水平提高[10], 也有研究發(fā)現鎘脅迫處理后DNA甲基化水平降低[11]。上述研究結果表明DNA甲基化水平變化和響應非生物脅迫機制的復雜性。

紅麻響應鎘脅迫的相關研究報道主要集中在農藝性狀及多組學研究上, 但有關DNA甲基化響應紅麻鎘脅迫的研究尚未見報道。本試驗前期對紅麻幼苗P3A進行不同濃度(0、100、200、300、600 μmol L-1)的CdCl2脅迫表明, 幼苗在300 μmol L-1濃度下的株高和生物量顯著降低, 但其生長發(fā)育無顯著影響, 結合紅麻修復重金屬土壤的目的, 因此本研究選用300 μmol L-1的CdCl2對紅麻材料P3A幼苗進行脅迫處理并詳細分析, 測定幼苗的生理生化指標,利用MSAP技術分析鎘脅迫下基因組DNA甲基化水平變化, 對甲基化差異片段進行測序比對, 并對響應逆境的甲基化差異基因進行qRT-PCR分析, 系統分析鎘脅迫下紅麻幼苗的生理生化響應、基因組DNA甲基化水平變化以及響應鎘脅迫相關基因的DNA甲基化變化與表達量的關系, 旨在為進一步研究DNA甲基化響應紅麻鎘脅迫的潛在機制提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

紅麻材料P3A由廣西大學農學院周瑞陽教授提供。挑選籽粒飽滿且均勻一致的種子, 37℃蒸餾水浸泡1 h, 3%過氧化氫(成都金山化學試劑有限公司,20170616)消毒10 min, 蒸餾水沖洗3~5次, 之后將種子均勻地擺放在鋪有2層紙巾的保鮮盒(27 cm×18 cm×9 cm)中, 添加100 mL蒸餾水, 放置于恒溫光照培養(yǎng)箱(光/暗周期為10 h/14 h, 溫度為白天27℃/夜晚25℃, 下同)中培養(yǎng)(注意定期定量地添加蒸餾水, 始終保持紙巾濕潤)。培養(yǎng)4 d后, 挑選長勢一致的幼苗210株, 隨機分成6組, 每組35株, 即為2個處理, 每個處理3次生物學重復, 移栽于6個底部含有托盤的育苗盤(35孔花卉育苗盤)中。向托盤中分別添加含有不同CdCl2濃度(0、300 μmol L-1)的1/4 Hoagland處理液, 注意每天定時定量地更換處理液。

1.2 農藝性狀及相對抑制率的測定

脅迫處理7 d后, 使用直尺測量紅麻各單株的株高, 使用游標卡尺測量各單株的莖粗, 使用電子天平稱量各組全鮮重。將根部用蒸餾水清洗干凈并用吸水紙吸干水分, 利用根系掃描分析儀(EPSON EXPRESSION 11000XL)對根系進行掃描分析。之后將材料用液氮速凍后保存于-80℃冰箱, 用于后續(xù)試驗。采用相對抑制率表示紅麻耐鎘性的強弱, 相對抑制率的公式為; 相對抑制率(%) = (目標性狀對照值-目標性狀處理值)/目標性狀對照值×100[12]。

1.3 鎘含量的測定

將根系用20 mmol L-1EDTA-Na2浸泡1 h, 去除表面的鎘離子, 再用去離子水洗滌3次, 并將根、莖、葉置于烘箱150℃殺青30 min, 之后70℃烘干至恒重, 稱取各部分組織干重后再用粉碎機將其粉碎用于Cd2+含量測定。本次試驗采用微波消解法處理樣品, 使用PerkinElmer PinAAcle 900石墨爐原子吸收分光光度計測定Cd2+含量[13]。各部分組織粉碎成粉末后進行消解、趕酸、過濾、定容、制作標準曲線, 最后測定樣品的鎘含量。

1.4 甲基化敏感擴增多態(tài)性(MSAP)分析

首先采用改良的CTAB法[14]提取上述材料根系的基因組DNA, 之后進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量, 利用超微量紫外線分光光度計測定DNA的濃度, 保存于-20℃冰箱備用。參照李增強等[15]報道的方法并加以改良, 對2個處理的(0、300 μmol L-1)根系進行MSAP分析。選用EcoR I+HpaII和EcoR I+MspI兩種酶組合分別對基因組DNA進行雙酶切, 之后進行連接、預擴增、選擇性擴增。酶切體系為: CutSmart buffer 2 μL、HpaII或MspI (NEB公司) 0.5 μL、EcoR I 0.5 μL、模板DNA(100 ng μL-1) 5 μL、ddH2O 12 μL; 反應程序為:37℃ 6 h, 80℃ (EcoR I/HpaII)或65℃ (EcoR I/MspI)20 min。連接體系為: T4 DNA Ligase (350 U μL-1,TaKaRa公司) 2 μL、10×T4 DNA Ligase buffer 2 μL、正反向引物(10 μmol L-1)各1 μL、酶切產物14 μL;反應程序為: 16℃ 14 h, 65℃ 20 min。預擴增體系為:連接產物5 μL (將連接產物稀釋20倍)、正反向引物(10 μmol L-1)各1 μL、2×RapidTaqMaster Mix (南京諾唯贊生物科技有限公司, 下同) 10 μL、ddH2O 3 μL; 反應程序為: 94℃預變性3 min; 94℃ 15 s,58℃ 15 s, 72℃ 30 s, 32個循環(huán); 72℃延伸5 min,12℃保存。選擇性擴增體系為: 預擴增產物5 μL (預擴增產物稀釋25倍)、正反向引物(10 μmol L-1)各1 μL、2×RapidTaqMaster Mix 10 μL、ddH2O 3 μL;

反應程序同預擴增PCR。選擇性擴增產物經95℃變性10 min后, 進行6%聚丙烯酰胺凝膠電泳, 銀染、顯色, 照相保存并統計MSAP多態(tài)性片段。接頭序列、預擴增和選擇性擴增引物序列見表1。

表1 接頭和引物序列Table 1 Adapter and primers used in this study

1.5 差異片段的回收、克隆和測序分析

將6%聚丙烯酰胺凝膠中的差異性片段用刀片切下, 放入1.5 mL EP管中, 用吸頭搗碎, 加入25 μL無菌水, 95℃水浴10 min, 離心30 s后取5 μL上清用相應的選擇性擴增引物進行PCR擴增。擴增體系為DNA模板5 μL、正反向引物(10 μmol L-1) 2.5 μL、2×RapidTaqMaster Mix 25 μL、ddH2O 15 μL; 反應程序同選擇性擴增。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物, 并進行回收純化(南京諾唯贊生物科技有限公司)。將回收產物連入pEASY-T1載體(北京全式金生物技術有限公司), 之后轉入DH5α感受態(tài)細胞中, 挑選陽性單克隆, 進行菌液PCR檢測, 之后送廣州華大基因科技服務有限公司測序。測序所得序列在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)及紅麻基因組數據庫[16](https://bigd.big.ac.cn/gwh)中比對分析。

1.6 實時熒光定量 PCR (qRT-PCR)分析

使用異硫氰酸胍法[17]并稍作改良提取相應根系材料(0、300 μmol L-1)的RNA, 并檢測RNA的質量和濃度, 使用諾唯贊反轉錄試劑盒(貨號R223-01)逆轉錄成cDNA, 并以此為模板進行qRT-PCR分析。以組蛋白基因His3為內參基因, 采用2-ΔΔCT方法[2]計算基因的相對表達量。qRT-PCR引物序列見表2。

表2 實時熒光定量PCR引物序列Table 2 Primer sequences for qRT-PCR

2 結果與分析

2.1 鎘脅迫對紅麻幼苗農藝性狀的影響

由表3和表4可知, 300 μmol L-1的CdCl2脅迫顯著抑制紅麻幼苗的株高、莖粗、全鮮重、根鮮重、根長和根表面積, 抑制率分別為21.52%、21.07%、54.93%、40.67%、64.27%和49.66%。表明300 μmol L-1的CdCl2脅迫顯著抑制了紅麻幼苗的生長。

表3 CdCl2脅迫對紅麻幼苗農藝性狀的影響Table 3 Effects of CdCl2 stress on agronomic traits in kenaf seedlings

表4 CdCl2脅迫對紅麻幼苗農藝性狀的相對抑制率Table 4 Relative inhibition rate of agronomic traits under CdCl2 stress in kenaf seedlings (%)

2.2 紅麻幼苗不同部位鎘含量的比較

由圖1可知, 紅麻幼苗在300 μmol L-1的CdCl2脅迫下, 根系的鎘含量最高, 為2555.47 μg L-1; 莖部的鎘含量次之, 為1363.41 μg L-1; 葉片的鎘含量最低, 為963.06 μg L-1; 并且各部位的鎘含量均存在顯著性差異。結合對紅麻幼苗農藝性狀的測定結果得出, 300 μmol L-1的CdCl2脅迫顯著抑制了紅麻幼苗的生長, 且植株體內尤其是根系積累了大量的鎘元素。

2.3 鎘脅迫對紅麻幼苗根系DNA甲基化水平的影響

運用MSAP技術分析300 μmol L-1CdCl2脅迫下紅麻幼苗根系的DNA甲基化水平變化情況, 部分代表性聚丙烯酰胺凝膠電泳結果見圖2, 統計結果見表5。對照條件下, 幼苗根系的甲基化率、全甲基化率和半甲基化率分別為62.78%、37.5%和25.28%;300 μmol L-1的CdCl2脅迫下幼苗根系的甲基化率、全甲基化率和半甲基化率分別為68.19%、36.37%和31.82%, 即該濃度的CdCl2脅迫使幼苗根系的甲基化率和半甲基化率升高, 全甲基化率變化較小。表明在整體水平上, 300 μmol L-1的CdCl2脅迫提高了紅麻幼苗根系的DNA甲基化水平。

表5 DNA甲基化水平統計分析Table 5 Statistical analysis of DNA methylation level

2.4 甲基化差異片段的測序及功能注釋

本試驗回收到157條甲基化差異條帶, 測序比對到40條具有功能的DNA甲基化差異序列, 與植物抗逆性相關的甲基化差異序列見表6。其中16條DNA甲基化差異片段與響應植物抗逆性密切相關,例如GH3.1(Gretchen Hagen)基因通過調節(jié)植物體內激素的動態(tài)平衡, 參與調控植物的生長發(fā)育過程[18],NADP-ME(NADP-dependent malic enzyme)通過碳代謝來平衡細胞內的pH來防御生物和非生物脅迫[19],ABCG26(ABC transporter G family member26)基因在八仙花根尖發(fā)生鋁脅迫后, 參與響應鋁脅迫[20],L-AAOh(L-ascorbate oxidase homolog)基因在調節(jié)植物發(fā)育過程和應激反應方面發(fā)揮重要作用[21],LRR-RLK(leucine-rich repeat receptor-like kinases)家族基因、GaTPPD(trehalosephosphate phosphatase D)等在植物生長和脅迫反應中均起著重要作用[22]。

表6 甲基化差異片段比對分析Table 6 Comparisons of differentially methylated sequences

2.5 甲基化差異基因qRT-PCR分析

(續(xù)表6)

為分析DNA甲基化變化對基因表達的影響, 挑選9個響應植物非生物脅迫的甲基化差異基因進行qRT-PCR分析。由圖3可知, 7個基因在鎘脅迫下的表達量與對照呈顯著性差異, 其中基因GH3.1、GrKCS1、NADP-ME、L-AAOh、TPP-D、NPF2.7的表達量在CdCl2脅迫下分別顯著升高8.80、1.46、0.94、5.22、1.37、1.85倍,LRR-RLKs的表達量顯著降低0.59倍。說明DNA甲基化的變化與基因表達水平的改變密切相關。

3 討論

3.1 紅麻可以作為修復鎘污染土壤的潛在作物

本研究結果表明, 300 μmol L-1鎘脅迫雖然顯著抑制了紅麻幼苗的生長, 但是并不致死[32], 而且鎘積累能力遠超水稻、玉米、木薯[33-35]等其他作物。根據本試驗中測得的紅麻對鎘的吸附量, 以及本課題組之前對國內外眾多常規(guī)品種研究得出, 每公頃紅麻對鎘吸附量為102.9~125.8 g, 并且對其生長無顯著影響。Sarra等[36]在鎘和鋅含量高的淤泥里進行紅麻和玉米的修復試驗發(fā)現, 紅麻莖中鎘和鋅的含量分別2.49 mg kg-1和82.50 mg kg-1, 玉米莖中鎘和鋅的含量分別為2.10 mg kg-1和10.19 mg kg-1,兩者都積累了可觀的鎘和鋅, 紅麻中的鋅含量是玉米的8倍多, 并且對其產量影響更小, 說明紅麻具有更強的重金屬修復和安全利用價值。栗原宏幸等[37]發(fā)現, 紅麻對鎘污染土壤具有明顯的修復效果, 并且對紅麻的產量無顯著影響。因此可以在生產上利用紅麻極強的鎘耐性及吸附能力改良重金屬污染土壤。

3.2 300 μmol L-1的CdCl2脅迫使紅麻幼苗的DNA甲基化水平提高

植物遭受非生物脅迫后, 通過激活脅迫響應機制或終止某些轉錄因子的表達來調控植物的生長,DNA甲基化在植物的整個生命周期中起著非常重要的作用, 例如參與逆境脅迫的響應, 應對不良環(huán)境帶來的影響, 抵御非生物脅迫的毒害等[38]。在重金屬、高鹽和干旱等逆境脅迫中, 植物都能通過DNA甲基化的水平變化來參與調控相關基因的表達, 提高植物抗逆性, 維持植物的正常生長[39]。

本結果表明, 紅麻幼苗在300 μmol L-1的CdCl2脅迫下根系的DNA甲基化率、半甲基化率較對照分別提高8.68%和26.07%, 全甲基化率降低3.04%, 在整體水平上, 300 μmol L-1的CdCl2脅迫提高了紅麻幼苗根系的DNA甲基化水平, 這與何玲莉等[40]和王丙蓮等[41]研究結果一致。殷欣[42]研究發(fā)現, 大豆DNA甲基化水平變化在鎘脅迫下升高, 并且與鎘脅迫濃度正相關, 某些功能蛋白還廣泛參與大豆響應逆境脅迫的過程。

3.3 DNA甲基化參與響應逆境脅迫相關基因的表達

本研究對與植物抗逆性密切相關的基因進行qRT-PCR分析發(fā)現, 在鎘脅迫下有7個甲基化差異基因的表達水平存在顯著差異, 推測植物受到鎘脅迫后, DNA甲基化水平變化參與調控基因的表達,從而參與紅麻對逆境的響應。

NADP-ME酶通過蘋果酸代謝平衡細胞內的pH來防御生物和非生物脅迫[19]。Fu等[43]研究發(fā)現, 小麥植株中的NADP-ME酶在NaCl和PEG脅迫處理下的酶活性升高, 表達量下降, 并且該參與了對逆境脅迫的響應。本研究中NADP-ME酶在鎘脅迫下基因表達量升高了0.94倍, 并且甲基化水平發(fā)生了改變。推測甲基化水平的變化參與到了該基因的表達量變化中, 并最終在響應鎘脅迫中起到了重要的作用。吲哚-3醋酸-酰胺合成酶家族能夠維持植物內源激素的動態(tài)平衡, 參與調控植物的生長發(fā)育過程[18]。Park等[44]研究中發(fā)現,GH3基因在低溫脅迫中基因表達量降低, 但仍被強烈誘導, 抑制自由態(tài)的生長素含量增加, 提高擬南芥抗逆性。本研究中本吲哚-3醋酸-酰胺合成酶基因GH3.1在鎘脅迫下發(fā)生了去甲基化, 基因表達量顯著升高了8.8倍, 因此推測其通過甲基化模式的變化參與調控基因表達、維持激素動態(tài)平衡, 并最終在響應鎘脅迫中起到重要作用?？箟难嵫趸?L-ascorbate oxidase,L-AAO)在植物生長發(fā)育過程和調節(jié)應激反應方面具有重要作用[21]。Parihar等[45]研究發(fā)現, 在多種逆境脅迫下, 抗壞血酸含量升高, 可以提高抗逆性。本研究中抗壞血酸氧化酶家族L-AAOh基因在鎘脅迫下基因表達量顯著升高了5.2倍, 并且甲基化水平發(fā)生了變化。推測甲基化水平的變化參與到了該基因的表達量變化中, 并最終在響應鎘脅迫中起到了重要作用。

NRT1/PTR家族蛋白在植物轉運硝酸鹽、氨基酸和植物激素過程中起重要的作用[46]。在本研究中,甲基化差異NRT1/PTR家族基因NPF2.7的表達量在鎘脅迫下顯著升高了1.8倍, 推測該基因可能參與到了植物的逆境脅迫響應中。海藻糖(trehalosephosphate phosphatase)在逆境脅迫中可以起到抵抗保護作用, 提高植物的抗逆性[47]。丁澤紅等[48]研究發(fā)現, 木薯在干旱脅迫下,MeTPP6基因的表達量顯著上升, 并參與了對干旱脅迫的響應。本研究中GaTPPD基因在鎘脅迫下的表達量顯著升高了1.35倍, 并且其甲基化水平發(fā)生了變化, 推測DNA甲基化調控該基因表達水平, 并最終在響應鎘脅迫中起到了重要作用。

4 結論

紅麻對鎘脅迫具有較強的耐受性, 在300 μmol L-1的鎘脅迫下, 紅麻幼苗的長勢受到抑制, 但并沒有嚴重影響其生長, 并且鎘富集量大, 說明紅麻具有較強的土壤修復潛力, 因此可以利用紅麻來修復重金屬鎘污染農田。紅麻幼苗在300 μmol L-1CdCl2脅迫下, 根系DNA甲基化水平升高, 與響應逆境脅迫相關的GH3.1基因、ABC轉運蛋白家族基因、NADP-ME基因、結合轉運蛋白G家族基因、抗壞血酸氧化酶基因、LRR-RLKs家族基因、海藻糖磷酸磷酸酶基因、NRT1/PTR家族蛋白的DNA甲基化和基因表達水平都發(fā)生了顯著變化。DNA甲基化水平變化可能參與了響應逆境脅迫相關基因的表達調控, 并最終在紅麻響應鎘脅迫中起到了重要的作用。