張 歡 羅懷勇 李威濤 郭建斌 陳偉剛 周小靜 黃 莉 劉 念 晏立英 雷 永 廖伯壽 姜慧芳

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北武漢 430062

植物抵抗外界微生物刺激而形成的系統(tǒng)稱為植物固有免疫系統(tǒng), 可分為2個(gè)層次。第1個(gè)層次是植物模式識(shí)別受體(pattern-recognition receptors,P R R S)識(shí)別病原相關(guān)的分子模式(p a t h o g e nassociated molecular patterns, PAMPs)觸發(fā)免疫反應(yīng)(PAMP-triggered immunity, PTI); 第2個(gè)層次是病原菌產(chǎn)生效應(yīng)物抑制對(duì)PTI的基本免疫反應(yīng), 而植物抗病基因(resistance gene,Rgene)通過編碼靶向抗性蛋白直接或間接識(shí)別病原菌, 進(jìn)而誘導(dǎo)效應(yīng)器觸發(fā)免疫(effector-triggered immunity, ETI)重建植物的抗性[1-2]。

目前植物中已經(jīng)克隆了150多個(gè)抗病基因[3], 編碼的蛋白質(zhì)具有共同的結(jié)構(gòu)域, 如卷曲螺旋(coiled coil, CC)、核苷酸結(jié)合區(qū)(nucleotide binding site,NBS)、Toll-白細(xì)胞介素區(qū)(toll-interleukin-1 receptor,TIR)、富含亮氨酸重復(fù)區(qū)(leucine-rich repeat, LRR)、激酶結(jié)構(gòu)域(kinase, KIN) 和跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane domain, TM)。胞質(zhì)NBS-LRR基因分為2類:TNL (TIR-NBS-LRR)和CNL (CC-NBS-LRR), 分別擁有TIR或CC結(jié)構(gòu)域[4]。如過表達(dá)TNL型抗病基因GmKR3增強(qiáng)大豆對(duì)多種病毒的抗性[5], 棉花GhTNL1抗病基因的表達(dá)減緩植物葉片黃化、萎蔫現(xiàn)象[6], 番茄CNL型抗細(xì)菌性斑點(diǎn)病基因SlNBRP1過表達(dá)增加其植株抗病性[7], 水稻中NL型Pi9抗病基因組成型表達(dá)抗稻瘟病[8]。包含Kinase和LRR結(jié)構(gòu)域的跨膜受體蛋白, 如受體樣蛋白(RLP)和受體樣激酶(RLK)也參與其中。RLK型基因SlDALR1正調(diào)控番茄對(duì)Pst DC3000的抗性[9], RLP型基因TaRLP1.1參與小麥對(duì)小麥銹病的防御反應(yīng)[10]。

花生是世界上重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物, 廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)。中國(guó)是世界最大的花生生產(chǎn)國(guó), 也是最大的花生消費(fèi)國(guó)。據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局統(tǒng)計(jì),2019年中國(guó)花生產(chǎn)量1751.96萬噸, 占世界產(chǎn)量近40%。青枯病是我國(guó)花生的主要病害之一, 是由茄科雷爾式菌侵染引起的一種細(xì)菌性土傳病害, 由于防治困難, 嚴(yán)重影響我國(guó)花生的品質(zhì)和產(chǎn)量[11]。培育和種植抗青枯病花生品種是防治青枯病危害最為經(jīng)濟(jì)有效的途徑。目前, 已獲得的抗青枯病基因有: 擬南芥抗青枯病基因RRS1和ERECTA[12-13], 辣椒抗青枯病基因CaLRR-RLK1和CaLRR51[14-15], 花生中參與青枯病響應(yīng)的基因AhRLK1和AhRRS5[16-17], 對(duì)于花生抗病基因的獲得還需要開展更多的研究。

四倍體花生全基因組測(cè)序已在2019年完成[18-19],為在全基因組水平研究花生抗病基因提供便利。目前尚沒有關(guān)于花生全基因組抗病基因鑒定的相關(guān)研究, 本研究利用生物信息學(xué)分析鑒定了花生全基因組抗病基因數(shù)量及染色體分布, 結(jié)合抗、感病品種接種青枯病菌后轉(zhuǎn)錄組分析, 鑒定了與青枯病抗性有關(guān)的差異表達(dá)抗病基因, 旨在為克隆花生抗病基因以及抗病分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 花生材料和青枯病菌株

花生抗病品種遠(yuǎn)雜9102和感病品種徐州68-4由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所花生遺傳育種團(tuán)隊(duì)提供。青枯病菌為茄科雷爾式菌(Ralstonia solanacearum)生理小種1, 生化型III, 分離自紅安病害苗圃試驗(yàn)基地[20]。

1.2 R基因的篩選和分類

根據(jù)植物抗病基因數(shù)據(jù)庫(PRGdb; http://prgdb.org/), 利用基因所包含的保守結(jié)構(gòu)域CC、TIR、NBS、LRR、TM和Kinase對(duì)花生全基因組進(jìn)行抗病基因的篩選和分類, 將抗病候選基因分為CK、CT、CL、CLK、CN、CNL、CNT、CTNL、T、TN、TNL、TRAN、L、N、NL、KIN、RLK、RLP共18個(gè)類別。

1.3 染色體分布

從花生數(shù)據(jù)庫(https://www.peanutbase.org/)下載花生品種Tifrunner基因組1.0版本, 利用軟件TBtools提取抗病候選基因的染色體位置信息,MapChart軟件繪制出抗病候選基因在染色體上的分布圖。

1.4 花生材料接種青枯病菌和取樣

參照Chen等[21]使用的方法進(jìn)行青枯菌培養(yǎng)、花生幼苗培養(yǎng)及接種。接種后12、24、48、72、96 h分別對(duì)花生主根部位取樣, 處理組標(biāo)記為RT12/ST12、RT24/ST24、RT48/ST48、RT72/ST72和RT96/ST96, 對(duì)照組標(biāo)記為RC12/SC12、RC24/SC24、RC48/SC48、RC72/SC72和RC96/SC96。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù), 樣品立即冷凍于液氮中, 并在–80℃下保存。由武漢菲沙基因信息有限公司完成轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

利用RSEM[22], 調(diào)用Bowtie2軟件的比對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 得到每個(gè)樣品比對(duì)到每個(gè)轉(zhuǎn)錄本上的Reads數(shù)目, 并對(duì)其進(jìn)行FPKM[23](Fragments Per Kilobase per Million bases)轉(zhuǎn)換。根據(jù)抗感材料對(duì)照組和處理組(RC/RT/SC/ST)各時(shí)間點(diǎn)的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)FPKM均值大于1, 將抗病基因的表達(dá)情況分為抗感病材料中均表達(dá)、僅在抗病材料中表達(dá)、僅在感病材料中表達(dá)、抗感病材料中均不表達(dá)4類。使用DESeq2[24]對(duì)5個(gè)時(shí)間點(diǎn)RT-vs-RC、RT-vs-ST和RT-vs-SC三個(gè)組分別進(jìn)行差異表達(dá)分析, 篩選閾值為FDR (false discovery rate) < 0.05, log2FC (fold change (condition 2/condition 1) for a gene) >1或log2FC < –1。使用TBtools對(duì)RT-vs-RC、RT-vs-ST和RT-vs-SC 3個(gè)組差異表達(dá)上調(diào)的R基因各個(gè)時(shí)間點(diǎn)作韋恩分析, 篩選出的差異表達(dá)基因使用Microsoft Excel作折線圖和RStudio[25]制作熱圖。

1.5 抗病基因qRT-PCR分析

以RNA-seq測(cè)序的根組織RNA為模板, 采用諾唯贊HiScript II Q RT SuperMix for qPCR試劑盒, 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物, 采用諾唯贊ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn), 反應(yīng)體系(20 μL)包含2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL、上下游引物(10 μmol L–1) 各0.4 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性30 s, 95℃變性10 s, 60℃退火30 s, 72°C延伸20 s, 40個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)進(jìn)行3次重復(fù), 花生內(nèi)參基因Actin的引物為actin-F: 5′-TAAGAACAATGTTGCCATACAGA-3′,actin-R: 5′-GTTGCCTTGGATTATGAGC-3′。按 照2?ΔΔCT計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生R基因的鑒定和染色體分布

在花生Tifrunner參考基因組[18]中共篩選得到4156個(gè)抗病候選基因, 分為TNL、CNL、RLK、RLP等18個(gè)類別(表1)。在典型的5類抗病基因中, 基因數(shù)目較多的是RLK型(536個(gè))和RLP型(490個(gè)), 占總抗病候選基因數(shù)目的12.90%和11.79%, 其次是NL型(232個(gè))和CNL類抗病基因(182個(gè)), 占抗病候選基因總數(shù)的5.58%和4.38%, TNL型抗病基因(149個(gè))占抗病候選基因總數(shù)的3.59%。非典型的13個(gè)抗病類型中, 僅含Kinase保守結(jié)構(gòu)域的KIN型抗病候選基因數(shù)目為1714個(gè), 占總抗病候選基因數(shù)目的41.24%; 其余12個(gè)類別候選基因含有NBS/CC/TIR/TM/LRR/Kinase等保守結(jié)構(gòu)域的不同組合形式, 占比0.05%~5.32%,共853個(gè)。抗病候選基因分布于花生20條染色體上(圖1), 在染色體B02上的抗病基因數(shù)量最多, 為334個(gè), A01和A06上抗病基因數(shù)量最少, 為137個(gè)。

表1 花生R基因的數(shù)量和分類Table 1 Number and type of R genes in peanut

2.2 抗病候選基因?qū)η嗫莶∏秩镜捻憫?yīng)

在接種青枯菌后5個(gè)時(shí)間點(diǎn)中, 抗病材料遠(yuǎn)雜9102對(duì)照組(RC)共2383個(gè)抗病候選基因表達(dá), 處理組(RT)有2337個(gè)表達(dá); 在感病材料徐州68-4對(duì)照組(SC)共2304個(gè)候選基因表達(dá), 處理組(ST)有2325個(gè)表達(dá)。抗感材料中表達(dá)的抗病候選基因數(shù)目基本一致。抗病材料(RC+RT)中特異表達(dá)的基因有111個(gè),感病材料(SC+ST)中特異表達(dá)的有104個(gè), 抗病、感病材料均有表達(dá)的基因2216個(gè), 抗、感病材料中均不表達(dá)的有1725個(gè)。根據(jù)FPKM值將所有抗病基因分為5組(圖2), 從圖2可看出, FPKM值在1~5的抗病候選基因數(shù)量最多, 占總表達(dá)基因數(shù)目的42.6%~46.8%; FPKM值在50以上最少, 基因數(shù)量在1.8%~2.3%, 植物體內(nèi)大部分的抗病基因轉(zhuǎn)錄水平較低。

2.3 差異表達(dá)R基因的鑒定

在接種青枯菌12 h的樣品中, 通過對(duì)RT12-vs-RC12、RT12-vs-ST12和RT12-vs-SC12 3個(gè)組差異表達(dá)基因的分析, 鑒定出2類差異表達(dá)R基因: 第1類是3個(gè)在抗病材料接種青枯菌后誘導(dǎo)表達(dá)的基因,在RT12的表達(dá)量顯著高于RC12、ST12和SC12, 推測(cè)其受到青枯菌侵染的誘導(dǎo)表達(dá)(圖3-a~c); 第2類是33個(gè)在抗病材料中持續(xù)上調(diào)表達(dá)的差異基因, 在RT12和RC12中的表達(dá)量差異不顯著, 但是顯著高于ST12和SC12 (圖3-f)。通過類似的方法, 在接種青枯菌24、48、72和96 h后, 鑒定到第1類差異表達(dá)R基因分別有1、0、1和0個(gè)(圖3-d, e); 第2類差異表達(dá)R基因有42、41、39和28個(gè), 在抗病材料中差異不顯著, 但顯著高于感病材料(圖3-g~j)。

綜合所有時(shí)間點(diǎn), 第1類差異表達(dá)R基因只在對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)特異上調(diào)表達(dá)。但是在第2類差異上調(diào)的65個(gè)抗病候選基因中, 有27個(gè)R基因在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)及以上差異表達(dá), 在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)連續(xù)差異上調(diào)表達(dá)的R基因11個(gè), 有9個(gè)R基因在12~72 h連續(xù)差異上調(diào)表達(dá), 3個(gè)R基因在24~96 h連續(xù)差異上調(diào)表達(dá), 在12、24、72、96 h差異上調(diào)表達(dá)的R基因2個(gè), 在12、24、48、96 h差異上調(diào)表達(dá)1個(gè), 12、48、72、96 h差異上調(diào)表達(dá)1個(gè)(圖3-k)。

2.4 抗青枯病QTL區(qū)間候選基因表達(dá)差異分析及qRT-PCR驗(yàn)證

前期在遠(yuǎn)雜9102和徐州68-4構(gòu)建的RIL群體中, 通過QTL分析鑒定到1個(gè)主效抗青枯病QTLqBWRB02.1[26]。通過對(duì)其候選區(qū)間分子標(biāo)記的比對(duì)發(fā)現(xiàn), 該QTL位于Tifrunner B02染色體4.05~6.12 Mb區(qū)間內(nèi), 該區(qū)間包含13個(gè)抗病候選基因, 其中6個(gè)候選基因在接種青枯菌后表達(dá), 7個(gè)不表達(dá)。在表達(dá)的6個(gè)基因中, 有3個(gè)包含在上述鑒定到的第2類差異表達(dá)基因中, 其表達(dá)情況如圖4-a所示。針對(duì)Arahy.5D95TJ設(shè)計(jì)了特異熒光定量引物, F:5′-TGCAAGGTACAATAAGGAGACAGG-3′, R: 5′-AATACTAGCCTCCAATAAGCATCC-3′。qRT-PCR結(jié)果顯示該基因的表達(dá)趨勢(shì)(圖4-b)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果(圖4-c)基本一致。

3 討論

抗病基因在植物抵抗細(xì)菌、真菌、病毒等病原體過程具有非常重要的作用[27]。本研究根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域在花生參考基因組中鑒定出4156個(gè)抗病候選基因, 將其分為18類抗病分型。豆科植物木豆、菜豆、大豆中分別鑒定到289、337和465個(gè)NBS-LRR類抗病基因[28], 各占全基因組基因數(shù)目的0.5%、1.1%和1.9%[29-31]。本研究發(fā)現(xiàn), 典型抗病基因NBS-LRR類641個(gè), 占花生全基因組數(shù)目的0.8%, 推測(cè)抗病基因數(shù)目與基因組大小沒有直接的聯(lián)系。

單子葉植物谷子、玉米、水稻各有NBS-LRR類家族基因數(shù)目為411、21和545個(gè), 但是沒有發(fā)現(xiàn)TNL型抗病基因[32-34]。在雙子葉植物三裂葉薯、黑籽南瓜、番茄、葡萄、鷹嘴豆中CNL型抗病基因數(shù)目大于TNL型[35-39], 而向日葵、大豆、擬南芥等植物中TNL型抗病基因數(shù)目大于CNL型[40-42], 本研究鑒定出花生抗病基因CNL型182個(gè), TNL型149個(gè)(CNL/TNL約1.2倍), 這說明雙子葉植物中CNL型和TNL型抗病基因可能有不同的進(jìn)化模式。

在植物中, RLK和RLP富含植物激素信號(hào)和植物病原菌互作途徑[43], RLK類抗病基因作為脅迫表達(dá)相關(guān)基因的一部分參與植物體應(yīng)答逆境和與防御相關(guān)的過程[44], 在4種棉屬植物中鑒定出1641個(gè)RLK基因[45], 在馬鈴薯、蘿卜、苜蓿和二穗短柄草中分別鑒定出479個(gè)[46]、292個(gè)[47]、329個(gè)[48]和268個(gè)[49]PLK基因, 本研究在花生全基因組中篩選鑒定得到RLK型抗病基因536個(gè)。總共有82個(gè)RLP基因在楊樹基因組中被鑒別出來[50], 在普通煙草中共鑒定出70個(gè)RLP基因[51], 本研究在花生全基因組中篩選鑒定得到RLP型490個(gè), 這些基因可能參與應(yīng)答青枯菌誘導(dǎo)的防御反應(yīng)。

抗病基因在染色體上的分布不均勻。如NBS-LRR類抗病基因在甘薯13號(hào)染色體有54個(gè)而11號(hào)染色體僅有3個(gè)[52]; 同樣的, 番茄中NBS類抗病基因在4號(hào)染色體所含數(shù)目最多[37]?；ㄉ鸀殡s交起源的異源四倍體作物, 包含來自2個(gè)祖先物種的全部染色體組, 抗病基因在B組染色體上數(shù)目大于A組染色體, 并且花生染色體B02上抗病基因數(shù)目最多。

已有研究表明, 花生中AhRRS5[16]和AhRLK1[17]基因在煙草中過表達(dá)顯著增加了對(duì)青枯菌的抗性, 分別下載CDS序列并比對(duì)到花生Tifrunner參考基因組[18], 結(jié)果顯示最高同源序列為染色體B05上Arahy.WIN0ZV基因和A03上Arahy.8BA7G9基因,將其鑒定為CNL型和RLK型抗病基因。本研究篩選到2類差異表達(dá)的抗病候選基因, 第1類是5個(gè)在抗病材料接種青枯菌后差異表達(dá)高于抗病對(duì)照以及感病材料, 推測(cè)這些基因是受到青枯菌誘導(dǎo)后上調(diào)表達(dá), 初步判定與花生的抗青枯病特性相關(guān); 第2類, 有65個(gè)在抗病材料中持續(xù)上調(diào)表達(dá)的差異基因,這一類基因在接種青枯菌前后, 抗病材料遠(yuǎn)雜9102中的表達(dá)量始終高于感病材料徐州68-4, 其中有27個(gè)抗病候選基因在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)以上連續(xù)差異上調(diào)表達(dá)。這2類差異表達(dá)基因含11種抗病類別, 基因數(shù)目從多到少為NL (14)、N (9)、KIN (8)、RLP (7)、CN (7)、CTNL (6)、RLK (4)、CNL (4)、CK (4)、TNL (2)和TN (2)。本研究還驗(yàn)證了花生青枯病QTL區(qū)間的抗病候選基因Arahy.5D95TJ屬于第2類持續(xù)上調(diào)表達(dá)抗病基因N型, 在抗病材料遠(yuǎn)雜9102中4個(gè)時(shí)間點(diǎn)連續(xù)表達(dá)。通過Interproscan分析發(fā)現(xiàn), 該基因可能包含與已克隆抗病基因不同的CC和LRR結(jié)構(gòu)域,推測(cè)Arahy.5D95TJ可能與AhRRS5具有相同的靶向位點(diǎn), 通過相同或相似的信號(hào)通路來參與對(duì)青枯菌的防御反應(yīng)。本研究結(jié)果可為開展花生青枯病抗病基因的克隆和功能驗(yàn)證, 以及解析花生響應(yīng)青枯菌脅迫的抗性應(yīng)答機(jī)制提供參考。

4 結(jié)論

發(fā)掘候選抗病基因4156個(gè), 在染色體上呈不均勻分布; 得到差異表達(dá)的5個(gè)響應(yīng)青枯菌誘導(dǎo)型和65個(gè)持續(xù)上調(diào)表達(dá)抗病候選基因, 驗(yàn)證了一個(gè)持續(xù)上調(diào)表達(dá)抗病候選基因Arahy.5D95TJ。研究結(jié)果可為花生抗病基因的克隆、鑒定及其抗病育種奠定基礎(chǔ)。