張曉文 馬應(yīng)卓 朱佳麗 李娟芳 王濤

商洛學(xué)院健康管理學(xué)院護(hù)理系，陜西 商洛 726000

骨質(zhì)疏松癥是目前常見的一種全身性代謝性骨病，其病理特點(diǎn)是骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)退化從而促使骨脆性增加易發(fā)生病理性骨折[1]。造成骨質(zhì)疏松癥的原因主要有內(nèi)分泌或營養(yǎng)因素、年齡和大量的慢性系統(tǒng)性疾病。它可以發(fā)生在任何年齡，其中絕經(jīng)后的婦女是高發(fā)人群之一[2]。絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松主要是由于性腺功能下降，而性腺功能下降再加上年齡的增長，促進(jìn)了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMO)[3]。PMO引起的疼痛和骨骼變形均降低了女性患者的生活質(zhì)量，同時(shí)給社會和家庭造成一定的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，PMO仍然是首要解決的問題。橙皮苷是一種生物類黃酮苷，主要存在于橘子、檸檬和其他柑橘類水果中[4]。橙皮苷具有多種生物活性，包括抗氧化[5]、抗炎和鎮(zhèn)痛活性[6]。研究表明橙皮苷可以防止雄性小鼠雄激素不足引起的骨質(zhì)流失[7]。目前研究發(fā)現(xiàn)骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)/核因子kappa B配體的受體激活物(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL)/RANK信號通路是調(diào)節(jié)骨代謝的重要途徑，主要是通過影響破骨細(xì)胞的分化成熟，從而影響骨代謝過程[8]。綜上所述，本文主要探究橙皮苷是否緩解去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨質(zhì)流失并激活OPG/RANKL/RANK通路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

48只12周齡( 233.0 ± 28.3) g雌性 SD 大鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，在 25 ℃恒溫條件下 12 h晝夜交替的實(shí)驗(yàn)室中適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周后進(jìn)行試驗(yàn)。所有大鼠均自由飲水和飲食。將大鼠隨機(jī)分成6組(每組n = 8) ，分別為假手術(shù)組、去卵巢骨質(zhì)疏松組、橙皮苷低劑量組、橙皮苷中劑量、橙皮苷高劑量組和雌激素組。對各組大鼠均進(jìn)行腹腔注射麻醉 (3 %戊巴比妥鈉采用 1 mL/kg腹腔注射)，從雙側(cè)腰背部切口進(jìn)入腹腔，雙側(cè)卵巢摘除建立去卵巢大鼠模型，假手術(shù)組僅切除雙側(cè)卵巢周圍等量脂肪[9]。橙皮苷低劑量組、橙皮苷中劑量、橙皮苷高劑量組按照25、50 mg/(kg·d)和100 mg/(kg·d)的劑量灌胃[10]；雌激素組按照 0.1 mg/(kg·d)的劑量灌胃 17-β雌二醇[11]；假手術(shù)組灌胃同等體積的蒸餾水。藥物治療10周后，麻醉后通過頸脫位對所有大鼠進(jìn)行安樂死，收集股骨和血液樣本。

1.2 骨檢測指標(biāo)

骨密度和骨微觀結(jié)構(gòu)由微型計(jì)算機(jī)斷層掃描(Micro-CT)進(jìn)行分析，取出右股骨保存于10 %福爾馬林液體中，隨后采用Micro-CT 平掃。使用Micro-CT提供的3 D Creator 軟件(Sky Scan)，對二維圖像生成三維渲染。使用軟件自動(dòng)計(jì)算以下 3 D 參數(shù)，包括骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume fraction，BV/TV) 、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨密度(BONE MINERAL DENSity，BMD) 、骨小梁數(shù)量(trabecular number，Tb.N)、骨小梁分離度(trabecular separation，Tb.Sp)[12-13]。

1.3 總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和熒光定量

取骨組織 20 mg，液氮下充分研磨至粉末，使用TRIzol從骨組織提取總RNA，提取的總RNA首先去除基因組中的 DNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以上步驟根據(jù)產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。并按SYBR-Green PCR試劑盒說明擴(kuò)增cDNA。使用2-ΔΔct方法計(jì)算mRNA的相對表達(dá)量。

1.4 染色

采集骨組織，通過固定、脫鈣、包埋、切片和HE染色，用蘇木精伊紅染色，并在顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.5 蛋白免疫印跡(Western blot)

骨組織加入液氮研磨，并用裂解緩沖液裂解在4 ℃并以14 000 r/min離心15 min，形成濃縮蛋白質(zhì)。然后對蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行測量。取20 μg總蛋白在12 %十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。將膜在37 ℃下用5%的牛血清白蛋白1 h封閉，然后與抗OPG、RANKL和RANK在4 ℃過夜。用TTBS洗滌后緩沖液(含Tween-20的Tris緩沖鹽水)，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(二抗)37 ℃反應(yīng)1 h；洗膜后ECL曝光成像并應(yīng)用quantity one軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)

根據(jù)制造商的說明，直接測量血清中人Ⅰ型膠原C端肽( C-terminal peptide collagen type Ⅰ，CTX-I)和血清骨鈣素(bone glaprotein，BGP)的表達(dá)量。用BIO-RAD酶標(biāo)儀(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)測定光密度。使用ELISA試劑盒提供的細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品建立測量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。ELISA試劑盒購買于南京建成生物研究所。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 橙皮苷對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨微觀結(jié)構(gòu)變化的影響

如圖1結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，在去卵巢骨質(zhì)疏松組中骨質(zhì)疏松標(biāo)志物BV/TV、BMD、Tb.Th和Tb.N水平降低，Tb.Sp水平升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在橙皮苷或雌激素治療后，與去卵巢骨質(zhì)疏松組相比，骨質(zhì)疏松標(biāo)志物BV/TV、BMD、Tb.Th和Tb.N水平升高，Tb.Sp水平降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：與假手術(shù)組相比，**P< 0.01；與去卵巢骨質(zhì)疏松組相比，#P< 0.05，##P< 0.01。圖1 骨質(zhì)疏松標(biāo)記物的檢測Fig.1 Detection of osteoporosis markers

2.2 橙皮苷對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠組織學(xué)影響

如圖2 結(jié)果所示，與假手術(shù)組相比，去卵巢骨質(zhì)疏松組中骨小梁的數(shù)量明顯降低，骨小梁連接較為稀疏。在橙皮苷或雌激素治療后，與去卵巢骨質(zhì)疏松組相比，大鼠骨小梁數(shù)量明顯增加，且骨小梁連接更為緊密。

圖2 骨組織病理學(xué)檢測 (400×)Fig.2 Detection of bone histopathology (400×)

2.3 橙皮苷對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨吸收標(biāo)志物CTX-Ⅰ的影響

如圖3結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，在去卵巢骨質(zhì)疏松組中骨吸收標(biāo)志物CTX-Ⅰ水平升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在橙皮苷或雌激素治療后，與去卵巢骨質(zhì)疏松組相比，骨吸收標(biāo)志物CTX-Ⅰ水平降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：與假手術(shù)組相比，**P< 0.01；與去卵巢骨質(zhì)疏松組相比，#P< 0.05，##P< 0.01。圖3 骨吸收標(biāo)志物CTX-Ⅰ檢測Fig.3 Detection of bone resorption marker CTX-Ⅰ

2.4 橙皮苷對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨形成標(biāo)志物BGP的影響

如圖4結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，在去卵巢骨質(zhì)疏松組中骨形成標(biāo)志物BGP水平降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在橙皮苷或雌激素治療后，與去卵巢骨質(zhì)疏松組相比，骨形成標(biāo)志物BGP水平升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：與假手術(shù)組相比，**P< 0.01；與去卵巢骨質(zhì)疏松組相比，#P< 0.05，##P< 0.01。圖4 骨形成標(biāo)志物BGP檢測Fig.4 Detection of bone formation marker BGP

2.5 橙皮苷對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠OPG、RANKL和RANKmRNA表達(dá)的影響

如圖5結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，在去卵巢骨質(zhì)疏松組中 OPG mRNA相對表達(dá)量降低，RANKL和RANK mRNA相對表達(dá)量升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在橙皮苷或雌激素治療后，與去卵巢骨質(zhì)疏松組相比，OPG mRNA相對表達(dá)量升高，RANKL和RANK mRNA相對表達(dá)量降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：與假手術(shù)組相比，**P< 0.01；與去卵巢骨質(zhì)疏松組相比，#P< 0.05，##P< 0.01。圖5 OPG、RANKL和RANK mRNA相對表達(dá)量Fig.5 Relative mRNA expression levels of OPG, RANKL, and RANK

2.6 橙皮苷對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠OPG、RANKL和RANK蛋白表達(dá)的影響

如圖6結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，在去卵巢骨質(zhì)疏松組中 OPG 蛋白的表達(dá)量降低，RANKL和RANK蛋白的表達(dá)量升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在橙皮苷或雌激素治療后，與去卵巢骨質(zhì)疏松組相比，OPG蛋白的表達(dá)量升高，RANKL和RANK蛋白的表達(dá)量降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：與假手術(shù)組相比，**P< 0.01；與去卵巢骨質(zhì)疏松組相比，#P< 0.05，##P< 0.01。圖6 OPG、RANKL和RANK 蛋白表達(dá)量Fig.6 Protein expression levels of OPG, RANKL, and RANK

3 討論

卵巢功能障礙造成的雌激素(estrogen，E)缺乏是引起絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的主要因素，激素替代療法(hormone replacement therapy，HRT)在近幾十年來得到了廣泛的應(yīng)用[14-15]。然而子宮內(nèi)膜長期在雌激素的刺激下就會引起增生，而導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌。乳腺在雌激素的長期作用下，也會導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生。因此，對絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松患者來講首要任務(wù)尋找更有利的藥物是迫在眉睫的。

橙皮苷具有多效性作用，包括改善胰島素抵抗、改善脂質(zhì)、抑制巨噬細(xì)胞泡沫細(xì)胞的形成、抗氧化作用和抗炎作用，從而減少動(dòng)脈粥樣硬化[16]。研究[17]表明經(jīng)橙皮苷治療顯著降低腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α , TNF-α )和NF-κB，促進(jìn)血清骨代謝生化標(biāo)志物的增加包括骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、骨鈣素(osteocalcin，OC)和降低血清堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)，顯著緩解預(yù)防糖尿病骨質(zhì)疏松癥。研究[18]展示補(bǔ)充鈣并同時(shí)補(bǔ)充橙皮苷有效緩解絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松。研究表明橙皮苷治療組和雌二醇治療組中股骨Ca、P、Zn水平顯著高于去卵巢骨質(zhì)疏松組。此外，橙皮苷降低了去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠股骨干骺端破骨細(xì)胞的數(shù)量；橙皮苷還能降低去卵巢小鼠肝臟脂肪的沉積[19]。在本研究中在橙皮苷治療后，與去卵巢骨質(zhì)疏松組相比，骨質(zhì)疏松標(biāo)志物BV/TV、BMD、Tb.Th和Tb.N水平升高，Tb.Sp水平降低；大鼠骨小梁數(shù)量明顯增加，且骨小梁連接更為緊密；骨吸收標(biāo)志物CTX-Ⅰ水平降低；骨形成標(biāo)志物BGP水平升高。本研究表明橙皮苷能緩解去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨質(zhì)流失。

目前研究發(fā)現(xiàn)OPG/RANKL/RANK信號通路是調(diào)節(jié)骨代謝的重要途徑，主要是通過影響破骨細(xì)胞的分化成熟，從而影響骨代謝過程[8]。OPG是阻礙骨吸收的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素，通過競爭性與 RANKL 相結(jié)合，封閉 RANKL 與 RANK 的連接通路，從而阻礙后續(xù)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的發(fā)生，最終調(diào)節(jié)成熟破骨細(xì)胞的活性及凋亡速度，減弱骨吸收作用[11]。已經(jīng)有研究[20]表明OPG/RANKL/RANK信號通路是雌激素受體激活通路的下游信號通路。本試驗(yàn)中雌激素治療后，與去卵巢骨質(zhì)疏松組相比，OPG mRNA相對表達(dá)量和蛋白的表達(dá)量升高，RANKL和RANKmRNA相對表達(dá)量和蛋白的表達(dá)量降低。在橙皮苷治療后，與去卵巢骨質(zhì)疏松組相比，OPG mRNA相對表達(dá)量和蛋白的表達(dá)量升高，RANKL和RANK mRNA相對表達(dá)量和蛋白的表達(dá)量降低。這些結(jié)果表明橙皮苷通過調(diào)節(jié)OPG/RANKL/RANK信號通路緩解骨質(zhì)疏松。

綜上所述，橙皮苷能緩解去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨質(zhì)流失并調(diào)節(jié)OPG/RANKL/RANK信號通路，為今后治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者提供了藥物選項(xiàng)。