陳錦成 朱國濤 秦曉飛 陳彥丞 羅駿 劉洪文 余博飛 徐杰*

1.福建中醫(yī)藥大學中醫(yī)骨傷及運動康復教育部重點實驗室，福建 福州 350122 2.福建醫(yī)科大學省立臨床醫(yī)學院(福建省立醫(yī)院)骨科，福建 福州 350001

肌少癥是指與自然增齡相關的，其特征是肌肉強度的下降和(或)全身肌量的減少或人體肌肉的生理活動功能衰退狀況呈進行性發(fā)展[1-2]。骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)屬于全身性骨病范疇，其特征是骨量逐步減少、骨的微觀結構退化及脆性增加，其系統(tǒng)性退化伴隨骨折發(fā)生率的增加[2-3]。肌少-骨質(zhì)疏松癥(sarco-osteoporosis，SO)的概念是由Binkley 等[4]提出的，目前臨床上尚未有行業(yè)專家一致公認的診治標準，本課題組前期的臨床實驗研究規(guī)定的SO患者納入標準是合并骨質(zhì)疏松(腰椎BMD T評分<-2.5)及肌肉功能異常(肌力0～3 級或出現(xiàn)明顯肌肉萎縮)的全髖關節(jié)置換患者；OP患者納入標準是合并骨質(zhì)疏松但不伴肌肉功能異常的全髖關節(jié)置換患者。排除標準：已知體內(nèi)存在影響骨代謝的疾病，包括但不限于：糖尿病、甲狀腺疾病、腫瘤性疾病患者、免疫系統(tǒng)疾病等；近12個月內(nèi)服用影響骨代謝的藥物，包括但不限于：雙膦酸鹽制劑、利尿劑、腎上腺和甲狀旁腺藥物、糖皮質(zhì)激素、維生素D和鈣劑。符合以上任1條件可排除試驗病例。根據(jù)前期課題組研究了SO與OP的肌肉組織與骨組織差異蛋白質(zhì)譜分析結果[5]，證實了SO組與OP組存在相互作用的顯著差異蛋白，那么SO與OP在miRNA水平是否也同樣存在差異基因調(diào)控其mRNA及下游靶基因。目前研究miRNA調(diào)控下游靶基因以揭示其潛在的調(diào)控關系，可以通過單純的生物信息學多網(wǎng)站和數(shù)據(jù)庫進行預測分析靶基因[6]，但往往會得到龐大的靶向調(diào)控關系結果的籠統(tǒng)數(shù)據(jù)，其中不可避免存在大量的假陽性結果[7]。因此，本課題組從臨床收集病例，術中分別取SO組與OP組的骨組織樣品，并運用Illumina高通量測序技術鑒定、篩選肌少-骨質(zhì)疏松癥與骨質(zhì)疏松癥患者骨組織microRNAs的差異表達譜[8]，以期篩查出在肌少-骨質(zhì)疏松癥疾病演變過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用的候選miRNA。

1 材料和方法

1.1 一般資料與取材

選取2017年至2019年期間在福建省老年醫(yī)院和福建省立醫(yī)院骨二科行手術治療的股骨頸骨折患者中，隨機選擇并自愿參與本臨床研究6例患者的股骨頭組織(2～5 g)，SO組與OP組各選取3例；術中取一側(cè)開路器切除的粗隆部位松質(zhì)骨組織并置于液氮保存。兩個組別的納入對象均為漢族女性。本課題已通過福建省立醫(yī)院的倫理委員會批準，明確患者及其近親家屬知情同意且簽署了知情同意書，倫理審批號為K2019-03-034。

1.2 Illumina高通量測序建庫

首先提取SO組與OP組骨組織樣品的total RNA，利用small RNA的3'及5’端特殊結構直接在small RNA兩端加上接頭，然后反轉(zhuǎn)錄為c-DNA并進行PCR擴增，再通過凝膠電泳分離目的片段，驗證此次實驗樣品RNA完整性后構建small RNA文庫，隨后可進行二代Illumina高通量測序。根據(jù)諾禾致源SE50測序策略進行，使用TruSeq SR Cluster Kit v3-cBot-HS(Illumia)在cBot群集生成系統(tǒng)上對索引編碼的樣本進行群集，產(chǎn)生簇后將文庫制備物在Illumina Hiseq 2500平臺和50 bp上測序。進行已知的miRNA比對檢測，使用miRBase 20.0作為參考，使用改良軟件mirdeep2和srna-tools-cli獲取潛在的miRNA并繪制二級結構；并運用miRNA前體發(fā)夾結構的特征來預測新型miRNA，將軟件miREvo和mirdeep2集成在一起，通過探索二級結構、Dicer切割位點和未注釋的小RNA標簽的最小自由能來預測新型miRNA。預測miRNA的靶基因是在miRanda軟件中進行。對于SO組與OP組具有生物學重復的骨組織樣品進行篩選miRNA的差異表達譜，使用DESeq R軟件(1.8.3)對這兩組進行差異表達分析，并使用Benjamini&Hochberg方法將校正的P值0.05設置為顯著差異表達的閾值。對差異表達的miRNA的目標基因候選物進行基因本體論(GO)富集分析，并對目標基因候選物進行KEGG富集分析(http:// www. genome. jp/kegg/)，旨在從分子水平理解生物系統(tǒng)的高級功能和信號通路信息[9]。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 SO組與OP組比較組合的miRNA差異基因表達水平分析

利用DESeq軟件對差異表達基因進行篩選，統(tǒng)計SO組與OP組各樣本中已知的和新篩選得到miRNA的表達量，并對兩組的骨組織樣本間表達量相關性進行分析。SO組與OP組比較組合的差異基因統(tǒng)計結果顯示，共篩選到3 064(包括上調(diào)和下調(diào))個差異基因，其中上調(diào)的有1 432個，下調(diào)的有1 632，設置Pvalue <0.05且 ∣log2 Fold Change∣>0.0。①火山圖(volcano plot)分析結果：通過火山圖的分析可以更直觀的觀察到SO組與OP組之間的差異基因分布情況，橫坐標X軸表示log2 Fold Change值，縱坐標Y軸則表示為-log10(Pvalue)，綠色點表示有差異且下調(diào)miRNA，紅色的點則表示為有差異且上調(diào)miRNA。差異基因火山圖結果提示，肌少-骨質(zhì)疏松癥骨組織存在差異顯著表達的miRNA(圖1)。②差異miRNA層次聚類分析分析結果：通過聚類分析將表達模式相近的miRNA聚集成類，進而可以識別未知miRNA的功能或已知miRNA的未知功能；此外，通過聚類分析還可以更好的認識這些同類的miRNA共同參與同一代謝過程或細胞信號通路。層次聚類分析橫坐標為樣品名，縱坐標為差異miRNA的每百萬個映射讀取的每千克堿基中的碎片歸一化后的數(shù)值，分析結果為SO組與OP組組間的層次聚類分析(圖2)。③GO富集結果分析：對兩組差異表達 miRNA的集合進行gene ontology富集分析。其中對差異顯著的miRNA進行GO富集分析，分析結果提示差異miRNA不僅在參與生物學過程(biological process，BP)、還參與了細胞組分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)調(diào)控機體生命功能的過程。研究miRNA差異基因在 gene ontology 中的分布狀況將闡明實驗中SO組與OP組骨組織樣本差異在基因功能上的體現(xiàn)。在GO富集分析結果中，將選取最顯著的30個Term(keg-20)繪制柱狀圖(圖3)、散點圖(圖4)。根據(jù)分析結果得到差異表達miRNA，預測其靶向的mRNA，并對差異表達miRNA的靶基因進行KEGG富集功能分析(圖5)，有助于構建mRNA與miRNA調(diào)控網(wǎng)絡，為深入研究miRNA對肌少-骨質(zhì)疏松癥的調(diào)控機制以及后續(xù)研究何種治療方案對肌少-骨質(zhì)疏松癥患者機體細胞生物功能產(chǎn)生何種影響提供更多研究思路。

圖1 橫坐標為log2 Fold Change值，縱坐標為-log10(P value)Fig.1 The abscissa is log2FoldChange value, the ordinate is -log10 (P value)

圖3 橫坐標是GO Term，縱坐標則是GO Term富集的顯著性水平Fig.3 The abscissa is GO Term, and the ordinate is the significance level of GO Term enrichment

圖4 橫坐標為注釋到GO Term上的差異基因數(shù)與差異基因總數(shù)的比值，縱坐標為GO TermFig.4 The abscissa is the ratio of the number of differential genes annotated to GO Term to the total number of differential genes, and the ordinate is GO Term

圖5 KEGG富集散點圖Fig.5 KEGG enrichment scatter plot注：Gene Ratio 這一列表示是差異基因集；Padj 多重假設檢驗校正后的P值；Count注釋到KEGG通路編號上的差異基因數(shù)。

2.2 qRT-PCR驗證結果

內(nèi)參基因U6和目的基因miR-382-3p溶解曲線呈單峰狀曲線，表明樣品無污染并且設計的引物特異性足夠穩(wěn)定，實驗數(shù)據(jù)與預期結果較為吻合，miR-382-3p的實驗組與對照組相對表達量見圖6所示。

圖6 qRT-PCR驗證miR-382-3p 的表達情況與測序結果一致Fig.6 qRT-PCR verifies that the expression of miR-382-3p is consistent with the sequencing results

3 討論

隨著全球老齡化進程的加速，世界各國面臨老年人群的健康問題所帶來的壓力越來越大，其中SO的發(fā)病率逐年增加，引起了各國醫(yī)療衛(wèi)生工作者的廣泛關注，SO隨著年齡的增加，患者往往出現(xiàn)全身肌肉的減少和骨密度的下降，并且伴隨而來的跌倒和骨折風險顯著增加。

近年來，隨著轉(zhuǎn)錄調(diào)控測序技術的發(fā)展與廣泛運用，特別是small RNA測序技術在采用先進的Illumina測序平臺后，可針對各種疾病的樣本中的miRNA、siRNA、piRNA展開全面分析，既能鑒定已知sRNA、也能預測新的sRNA并預測sRNA的靶基因，為深入研究miRNA在SO疾病過程中的功能及調(diào)控機制提供有力手段[10]。

miRNAs屬于一類內(nèi)源性的small RNA，其可以通過降解mRNA或者抑制翻譯過程來抑制靶基因的表達[11]。在肌少-骨質(zhì)疏松癥的研究中miRNA發(fā)揮的作用在很大程度上還是未知的。本課題組利用高通量測序手段研究SO中起關鍵調(diào)節(jié)作用的 miRNA及其靶基因，有望從表觀遺傳學層面揭示肌肉減少癥患者容易罹患OP的新機制。miRNA在骨病、骨性關節(jié)炎、肌少癥和OP等老年性疾病的組織樣品中存在差異表達，并且miRNA在老年性疾病中的調(diào)控作用已有廣泛研究[12]。根據(jù)Illumina高通量測序結果篩選出可能參與調(diào)節(jié)SO疾病發(fā)生演變過程的候選miRNA，并充分利用GO和KEGG數(shù)據(jù)庫的生物信息可以評估顯著差異的miRNA在SO發(fā)生、發(fā)展中所發(fā)揮的調(diào)控作用。

本課題組在研究中利用Illumina高通量測序技術對SO組與對照組OP進行對比，差異表達顯著的miRNA有22個，其中15個發(fā)生了上調(diào)(表1)，7個(表2)發(fā)生下調(diào)；與OP對照組相比，在SO組骨組織中存在顯著高表達的miRNA，其中hsa-miR-382-3p、hsa-miR-27a-5p、hsa-miR-1226-5p和hsa-miR-3934-5p是發(fā)生上調(diào)較顯著的miRNA，顯著低表達的是hsa-miR-451a。研究結果提示在SO患者骨組織中存在部分差異表達的miRNA，其可能參與調(diào)控肌少癥罹患OP的疾病過程發(fā)生發(fā)展過程。

表1 顯著上調(diào)的miRNATable 1 Significantly up-regulated miRNAs

表2 顯著下調(diào)的miRNATable 2 Significantly down-regulated miRNAs

本研究中發(fā)現(xiàn)的特征性候選基因hsa-miR-382-3p在膝骨性關節(jié)炎存在差異表達，目前國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)miR-382-3p可能通過直接靶向CX43通過TLR4/MyD88/NF-κB信號通路參與OA[13]；Heilmeier等[14]在糖尿病性骨病和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥研究中發(fā)現(xiàn)miR-382-3p的差異表達對機體成骨、脂肪形成和細胞增殖的存在調(diào)控作用。本研究中，肌少-骨質(zhì)疏松癥患者的miR-27a-5p表達水平較顯著上調(diào)，有研究表明miR-27a-5p通過抑制Atg7可減輕缺氧誘導的大鼠心肌細胞損傷[15]，其也可能在肌少-骨質(zhì)疏松癥的病理生理過程中發(fā)揮重要作用。hsa-miR-451a在肌少-骨質(zhì)疏松癥組中表達顯著下調(diào)，Lu等[16]研究發(fā)現(xiàn)miR-451a在骨質(zhì)疏松癥中存在差異表達，其可能通過BMP6信號傳導促進成骨分化并抑制骨量丟失進程；Karvande等[17]研究報道甲狀旁腺素促進葡萄糖依賴性miR-451a表達，刺激成骨細胞分化，其機制是甲狀旁腺素可以通過PI3K-mTOR-AKT軸抑制AMPK磷酸化，從而防止作用于miR-451a啟動子區(qū)域的八聚體結合轉(zhuǎn)錄因子1(OCT-1)的磷酸化和失活，AMPK活性的調(diào)節(jié)會影響成骨細胞中miR-451a的水平。

本課題組在后續(xù)基礎研究中將篩選出可能調(diào)控肌少-骨質(zhì)疏松癥的候選miRNA，并通過預測分析以確定候選miRNA所作用的靶基因，在細胞與動物水平上深入研究候選的miRNA與靶基因的表達水平及其調(diào)控機制。