陳 明 向 陽*

1.湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部，湖北 恩施 445000； 2.風(fēng)濕病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點實驗室(湖北民族大學(xué))，湖北 恩施 445000

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥及關(guān)節(jié)的進(jìn)行性破壞為主要特征，以對稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)，常見關(guān)節(jié)處疼痛、腫脹，呈持續(xù)性、反復(fù)性發(fā)作[1-4]。若不及時治療，最終可引起關(guān)節(jié)畸形，喪失關(guān)節(jié)功能。RA的發(fā)病機(jī)制并不十分明確，滑膜細(xì)胞增殖與凋亡失衡是目前研究的重要方向。RA滑膜細(xì)胞的增殖與炎性細(xì)胞浸潤、血管翳形成、侵蝕軟骨及骨組織損傷為主要病理特征，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞、畸形及功能喪失[5]。有研究[6]發(fā)現(xiàn)，RA患者滑膜細(xì)胞增生明顯，而細(xì)胞凋亡率顯著減少，卻并沒有因過度增生出現(xiàn)過多的細(xì)胞凋亡，提示滑膜細(xì)胞的凋亡障礙可能是導(dǎo)致滑膜增厚的原因之一。有研究[7-8]表明，湖北楓楊(Pterocarya Hupehensis Skan，PHS)通過影響線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)RA滑膜細(xì)胞凋亡，本實驗建立CIA模型大鼠，用湖北楓楊水煎液進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)一步探討楓楊對CIA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠60只(200±20)g，購于武漢劍悅生物科技有限公司，許可證號為SCXK(遼)2015-0001。

1.2 藥材與試劑 湖北楓楊樹皮，采自湖北省恩施市清江河灘，經(jīng)袁林副教授鑒定，為胡桃科Juglandaceae楓楊屬Pterocary Kunth植物。甲醇、異丙醇、冰醋酸(武漢市中天化工有限責(zé)任公司)；BCA試劑盒、HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(武漢科瑞生物技術(shù)有限公司)；雷公藤多苷片(浙江得恩德制藥股份有限公司)；牛Ⅱ型膠原、完全弗氏佐劑(美國Sigma公司)；大鼠IL-4、IFN-γ、TGF-β、IL-17AELISA試劑盒(酶聯(lián)生物)；β-Actin 抗體、HRP 羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司)；Bcl-xl、Caspase-8(abcam公司)；TNFRⅡ抗體(美國CST公司)；RIPA裂解液、彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(10-180kD)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、蛋白酶抑制劑(上海碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.3 設(shè)備和儀器 酶標(biāo)儀(Thermo公司)；電泳儀電源(北京六一生物科技有限公司)；包埋機(jī)(美國通用電氣醫(yī)療集團(tuán))；石蠟切片機(jī)(Leica公司)；化學(xué)發(fā)光成像分析儀(美國通用電氣醫(yī)療集團(tuán))。

2 實驗方法

2.1 模型建立 60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)選取10只作為正常組，其余50只制作CIA模型。

2.2 動物分組 將造模成功的50只大鼠，隨機(jī)分為5組，分別為模型組、雷公藤多苷組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10只，未造模的10只大鼠作為正常組。

2.3 給藥方案 雷公藤多苷組大鼠予以 6.25 mg/(kg·d) 的雷公藤多苷混懸液灌服，楓楊低、中、高劑量組分別給予2.0 g/(kg·d)、4.0 g/(kg·d)、8.0 g/(kg·d) 的水煎液灌服，正常組、模型組灌服等體積的生理鹽水，每組大鼠每天灌胃1次，連續(xù)灌胃28 d。

2.4 取材 灌胃28 d后，禁食禁水12 h，待麻醉成功，打開胸腔，用采血針于心尖搏動處取血，用于ELISA法檢測血清TGF-β、IFN-γ、IL-17A及IL-4水平。充分暴露大鼠雙膝關(guān)節(jié)腔，髕骨處可見一層淡黃色光滑組織，即為滑膜組織，利用手術(shù)刀及手術(shù)鑷小心對其進(jìn)行剝離并分離。

2.5 一般情況 每7天測量一次體重、膝關(guān)節(jié)直徑、并進(jìn)行關(guān)節(jié)炎評分，用以評價關(guān)節(jié)炎癥程度。關(guān)節(jié)炎評分按照以下標(biāo)準(zhǔn)：0分：無紅腫；1分：小趾關(guān)節(jié)紅腫；2分：趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹；3分：踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4分：包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。

2.6 HE染色 將組織從多聚甲醛固定液中取出，在通風(fēng)櫥內(nèi)用手術(shù)刀將目的部位組織修平整，經(jīng)酒精脫水、二甲苯透明，明膠浸蠟及石蠟樹脂等包埋成含有滑膜組織的石蠟塊。蠟?zāi)毯螅瑥陌窨蛑腥〕?，并進(jìn)行修整。將修整好的蠟塊置于切片機(jī)上切片，切片漂浮于攤片機(jī)溫水上將組織攤平，用載玻片將組織撈起，放入烘箱中烤片。取出切片，置于自動染色機(jī)脫蠟染色，再用中性樹膠封片。最后鏡下觀察，并進(jìn)行病理學(xué)評分。關(guān)節(jié)組織病理學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)為：組織無病理學(xué)改變，記作0分；輕微炎癥浸潤記為1分；中度記為2分；重度，但無血管翳生成記3分；嚴(yán)重的炎癥浸潤，形成血管翳或軟骨、骨侵蝕，記4分。

2.7 ELISA法 檢測血清細(xì)胞因子水平 按照ELISA試劑盒方法檢測血清TGF-β、IFN-γ、IL-17A及IL-4水平。

2.8 Western Blot法檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 提取滑膜蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，然后將各組蛋白煮沸，加入四分之一體積的蛋白上樣緩沖液(5×)。取適量的樣本，在凝膠中依次加入蛋白上樣緩沖液(1×)，Maker，各組蛋白樣本，蛋白上樣緩沖液(1×)進(jìn)行電泳。再將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用3%濃度的BSA封閉1h，加入不同的一抗進(jìn)行孵育：TNFRⅡ(1∶1000)，Caspase-8(1∶1200)，Bcl-xl(1∶1000)。過夜之后取出，TBST溶液洗膜3次，每次10 min，放入二抗(1∶12000)，孵育2 h，TBST溶液洗膜3次。最后進(jìn)行顯色，ImageJ軟件分析條帶的灰度值，以內(nèi)參β-acting作為對照，得到各目的蛋白的相對表達(dá)量。實驗獨立重復(fù)3次。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般情況 正常組大鼠精神狀態(tài)較好，體重明顯增加，皮毛順亮，飲食正常，足部皮膚無紅腫情況，活動自如。模型組大鼠體重增長較正常組緩慢，皮毛較為暗淡枯槁，活動量明顯減少，足部皮膚發(fā)紅腫起，關(guān)節(jié)活動受限。各治療組大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度均有所降低，飲食量略有增加，體重逐漸增長，足部皮膚情況也有所改善。

3.2 體重變化 與正常組比較，模型組大鼠體重增長緩慢。用藥后，各治療組大鼠體重均有所增加，楓楊中、高劑量組和雷公藤多苷組體重增長明顯(P<0.05)，楓楊低劑量組在用藥2周后體重明顯增加(P<0.05)。如圖1所示。

圖1 大鼠體重變化情況

3.3 楓楊水煎液對CIA模型大鼠膝關(guān)節(jié)直徑的影響 模型組與正常組相比，關(guān)節(jié)直徑明顯增大(P<0.05)，治療1周后，各用藥組與模型組比較，關(guān)節(jié)直徑有所減小(P<0.05)，到第4周發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)直徑明顯減小(P<0.05)。與雷公藤多苷組相比，楓楊高劑量組對大鼠關(guān)節(jié)腫脹的改善更為顯著(P<0.05)。如圖2所示。

圖2 大鼠膝關(guān)節(jié)直徑變化情況

3.4 楓楊水煎液對CIA模型大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響 模型組與正常組比較，有顯著性差異(P<0.01)，且模型組數(shù)據(jù)上升，提示造模成功。治療1周后，雷公藤多苷組和楓楊高劑量組與模型組比較，有顯著性差異(P<0.05)，治療2周以后，各治療組與模型組相比，有顯著性差異(P<0.05)。且與雷公藤多苷組相比，楓楊高劑量組對關(guān)節(jié)炎指數(shù)的改善有顯著效果(P<0.05)。如圖3所示。

圖3 大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)變化

3.5 楓楊水煎液對CIA模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜的影響 與正常組比較，模型組大鼠滑膜病理評分明顯升高(P<0.05)，與模型組比較，各用藥組病理評分明顯降低(P<0.05)，與雷公藤多苷組相比，楓楊高劑量組改善病理方面更為顯著(P<0.05)，如圖4所示。鏡下可見：正常組大鼠滑膜組織中無明顯病理變化，模型組出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤，滑膜細(xì)胞增多，且呈現(xiàn)多層，達(dá)到5～6層甚至更多。各用藥組與模型組相比，滑膜增生，炎性細(xì)胞浸潤有所緩解，層數(shù)也有所減少，而楓楊高劑量組效果最為明顯，如圖5所示。

圖4 滑膜組織病理評分注：模型組與正常組比較，*P<0.05；各用藥組與模型組比較，#P<0.05；楓楊高劑量組與雷公藤多苷組比較，☆P<0.05。

3.6 楓楊水煎液對CIA大鼠血清炎性因子水平的影響 與正常組相比，模型組大鼠血清中 TGF-β、IL-4含量明顯降低(P<0.05)，IFN-γ、IL-17A含量明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，各用藥組大鼠TGF-β、IL-4水平明顯提高(P<0.05)，IFN-γ、IL-17A顯著降低(P<0.05)；與雷公藤多苷組相比，低劑量組對TGF-β含量的升高和IFN-γ的降低更為明顯(P<0.05)，高劑量組對IL-17A水平的降低和IL-4的升高更為明顯(P<0.05)。如圖6所示。

A.正常組;B.模型組;C.雷公藤多苷組;D.低劑量組;E.中劑量組;F.高劑量組圖5 CIA 大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜 HE 染色切片(×20)

圖6 血清炎性因子含量變化注：與正常組相比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與雷公藤多苷組比較，☆P<0.05；與低劑量組比較，△P<0.05；與中劑量組比較，▲P<0.05。

3.7 楓楊水煎液對CIA模型大鼠凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與正常組相比，CIA大鼠TNFRⅡ、Bcl-xl的蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)，Caspase-8的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。與模型組比較：雷公藤多苷組和楓楊低劑量組大鼠的TNFRⅡ表達(dá)明顯降低(P<0.05)；楓楊中、高劑量組TNFRⅡ表達(dá)反而明顯升高(P<0.05)；楓楊低、中、高劑量組Caspase-8蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)，且均顯著高于雷公藤多苷組(P<0.05)；各用藥組Bcl-xl蛋白表達(dá)均降低，其中楓楊低劑量組差異有顯著性意義(P<0.05)；楓楊低劑量組Bcl-xl表達(dá)水平顯著低于雷公藤多苷組(P<0.05)。如圖7所示。

A.正常組;B.模型組;C.雷公藤多苷組;D.低劑量組;E.中劑量組;F.高劑量組

圖7 各組大鼠凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)灰度比值注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與雷公藤多苷組比較，☆P<0.05；與低劑量組比較，△P<0.05；與中劑量組比較，▲P<0.05。

4 討論

細(xì)胞凋亡有兩個途徑：內(nèi)源性途徑和外源性途徑[9]。線粒體是發(fā)生內(nèi)源性途徑的重要細(xì)胞器，而細(xì)胞表面死亡受體是介導(dǎo)含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶-8(Cysteinyl aspartate specific proteinase-8，caspase-8)激活的外源性途徑[10]。外源性途徑中，死亡受體激活的起始Caspase是Caspase-8，Caspase-8可通過激活Caspase-3執(zhí)行凋亡。另外，還能夠切割細(xì)胞基質(zhì)中的B細(xì)胞淋巴瘤(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)蛋白家族成員Bid前體[11]，形成截斷的Bid(tBid)，tBid可進(jìn)入線粒體中，并促使Bax等蛋白產(chǎn)生寡聚反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞色素C(Cytochrome C，Cyt-C)，同時使凋亡誘導(dǎo)因子AIF及其他相關(guān)凋亡信號從線粒體釋放，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。研究發(fā)現(xiàn)楓楊水煎液可使大鼠滑膜組織凋亡誘導(dǎo)蛋白Caspase-8表達(dá)增加，凋亡抑制蛋白Bcl-xl表達(dá)降低。結(jié)合前期研究結(jié)果，說明楓楊能夠通過上調(diào)Capase-8并作用于Caspase-3和B細(xì)胞淋巴瘤-xl(B-cell lymphoma-xl，Bcl-xl)蛋白，引起Cyt-C和其他凋亡信號的釋放增加，從而促進(jìn)滑膜細(xì)胞凋亡。

腫瘤壞死因子受體(Tumor necrosis factor receptor，TNFR)在免疫系統(tǒng)及相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用，包括Ι型(TNFRΙ)和Ⅱ型(TNFRⅡ)。腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)可分別與TNFRΙ和TNFRⅡ結(jié)合，介導(dǎo)不同的生物學(xué)活性[13]。在正常生理情況下，TNF-TNFRs系統(tǒng)保持凋亡與增殖兩方面功能的平衡，病理條件下，介導(dǎo)兩條相反的信號通路，會破壞這種平衡，導(dǎo)致機(jī)體免疫環(huán)境與功能紊亂，引起滑膜組織增生與炎癥，發(fā)生疾病。體外分別培養(yǎng)RA患者與正常人的成纖維滑膜細(xì)胞[14]，發(fā)現(xiàn)與健康人相比，RA患者的滑膜細(xì)胞增生是通過上調(diào)TNFRΙ，下調(diào)TNFRⅡ表達(dá)，來激活TNFR相關(guān)因子，導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Nuclear factor-kappaB，NF-κB)進(jìn)一步活化，阻礙細(xì)胞的正常凋亡，造成滑膜細(xì)胞過度增殖，組織增生。Blüml研究[15]發(fā)現(xiàn)，TNFRΙ是關(guān)節(jié)炎發(fā)生的主要原因，而同時存在的TNFRⅡ?qū)﹃P(guān)節(jié)炎有保護(hù)作用。TNFRⅡ胞內(nèi)不存在死亡結(jié)構(gòu)域[16]，但是能夠募集腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(TNF receeptor associated factor 2，TRAF2)，激活絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)和NF-κB信號通路，發(fā)揮抗炎作用。

實驗結(jié)果顯示，楓楊干預(yù)CIA大鼠后，低劑量組下調(diào)TNFRII，與雷公藤多苷作用相似；而中、高劑量則對TNFRⅡ有上調(diào)作用，與雷公藤多苷完全相反。楓楊對TNFRII明顯的雙向調(diào)節(jié)現(xiàn)象的機(jī)制與意義尚不清楚，但值得進(jìn)一步研究。考慮到TNFRII對關(guān)節(jié)炎癥的保護(hù)作用，推測中、高劑量楓楊通過上調(diào)TNFRⅡ表達(dá)，與TNFRΙ競爭TRAF2，從而促進(jìn)滑膜細(xì)胞凋亡，同時抑制NF-κB信號通路上的炎癥因子的釋放，參與抗炎通路中的炎癥反應(yīng)過程。這一發(fā)現(xiàn)對選擇楓楊治療劑量具有重要參考價值。前期細(xì)胞實驗結(jié)果顯示，湖北楓楊可通過調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響線粒體凋亡途徑，從而誘導(dǎo)MH7A細(xì)胞凋亡。本研究對前期實驗進(jìn)行了延伸，在動物水平進(jìn)行研究，證實在湖北楓楊對CIA大鼠滑膜細(xì)胞的凋亡具有促進(jìn)作用，其機(jī)理可能是通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白TNFRⅡ、Bcl-xl和Caspase-8的表達(dá)實現(xiàn)的。