高 輝，楊晶津，李思源，王玉真，劉 靜，汪顯國(guó)，劉繼輝，楊盼盼，邱昌桂*，高占勇*

1.云南同創(chuàng)檢測(cè)技術(shù)股份有限公司，昆明市高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)海源北路1699 號(hào) 650106

2.紅云紅河煙草（集團(tuán)）有限責(zé)任公司，昆明市五華區(qū)紅錦路367 號(hào) 650231

微觀結(jié)構(gòu)是指物質(zhì)、生物、細(xì)胞在顯微鏡下的結(jié)構(gòu)。其中，植物葉片表皮提供的微觀結(jié)構(gòu)特征，可用于植物系統(tǒng)發(fā)育和品質(zhì)形成的相關(guān)研究［1-4］?！犊緹煛窐?biāo)準(zhǔn)利用葉片表皮細(xì)胞排列的疏密程度來評(píng)價(jià)葉片結(jié)構(gòu)，利用細(xì)胞密度、煙葉厚度或單位面積質(zhì)量對(duì)其身份進(jìn)行定義［5］。朱尊權(quán)［6］、于華堂等［7］研究表明，葉片表皮細(xì)胞呈疏開狀態(tài)的煙葉成熟度較好。過偉民等［8-10］、高輝等［11］的研究認(rèn)為，煙葉表面微觀結(jié)構(gòu)指標(biāo)與其部分外觀品質(zhì)、色度和物理特性存在顯著相關(guān)性，在評(píng)價(jià)煙葉成熟度和葉片結(jié)構(gòu)等方面具有重要作用。可見，以細(xì)胞形態(tài)特征為代表的煙葉表面微觀結(jié)構(gòu)與外觀品質(zhì)指標(biāo)密切相關(guān)。此外，有關(guān)煙葉微觀形態(tài)特征的研究還包括不同土壤環(huán)境［12-13］、水分條件［14］、品種［15-17］和部位［10］煙葉微觀結(jié)構(gòu)的差異性分析，以及基于煙葉表面微觀結(jié)構(gòu)特征的變化來確定采收成熟度等［18-19］。由于煙葉葉片不同區(qū)段的生理特性和在生長(zhǎng)過程中接受的光照條件等生態(tài)因子不同，致使同一葉片不同區(qū)段的內(nèi)含物質(zhì)代謝狀況不同［20-21］，最終導(dǎo)致煙葉葉片不同區(qū)段的化學(xué)成分含量［22-25］和物理耐加工性能［26］等存在較大差異。在煙葉原料分段打葉復(fù)烤中較科學(xué)、合理的煙葉分切方法研究方面，祁林等［24］以石油醚提取物作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用傳統(tǒng)的聚類方法對(duì)煙葉不同區(qū)段進(jìn)行了劃分；龍明海等［27］以近紅外光譜信息的主成分綜合得分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)結(jié)合Fisher 最優(yōu)分割法對(duì)煙葉區(qū)段進(jìn)行了劃分；高輝等［28］基于初烤煙葉不同區(qū)段的色差參數(shù)變化，利用Fisher 最優(yōu)分割法對(duì)煙葉區(qū)段進(jìn)行了劃分。但基于煙葉表面微觀結(jié)構(gòu)特征差異對(duì)葉片區(qū)段進(jìn)行劃分的研究尚鮮見報(bào)道。為此，以掃描電鏡圖像的PHOTOSHOP 軟件量化處理為手段，分析云煙87 B2F、C3F 初烤煙葉不同區(qū)段表面微觀結(jié)構(gòu)特征指標(biāo)的變化，并基于不同區(qū)段表面微觀結(jié)構(gòu)特征的差異利用Fisher 最優(yōu)分割法對(duì)煙葉進(jìn)行劃分，最后通過感官評(píng)吸驗(yàn)證分切后各區(qū)段葉片之間感官品質(zhì)的差異性，旨在為煙葉合理分切和差異化打葉復(fù)烤提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、設(shè)備和儀器

以2019 年云南昆明產(chǎn)云煙87 B2F 和C3F 初烤煙葉作為試驗(yàn)材料，分別選取約5 kg 顏色均勻一致，無青雜色、病斑和破損的煙葉以供電鏡觀測(cè)和感官評(píng)吸。

G2 Pro 臺(tái)式掃描電子顯微鏡（荷蘭PHENOM公司）；QS-1 試樣切絲機(jī)（鄭州中煙科技開發(fā)有限公司）；AB204-S 型電子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo 公司）；KBF 540 恒溫恒濕箱（德國(guó)Binder 公司）。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)樣品制作

從2 個(gè)部位的煙葉樣品中各選取10 片置于（20±1）℃、相對(duì)濕度為65%±2%的恒溫恒濕箱中平衡48 h。先切除無葉片的葉柄部分，再利用刻度尺測(cè)量每片煙葉的長(zhǎng)度，并根據(jù)葉長(zhǎng)將其平均分成10 個(gè)區(qū)段（圖1），然后沿主脈測(cè)量并記錄每個(gè)區(qū)段中心點(diǎn)到葉基端的距離，最后再利用裁紙刀將其分切成10 段，B2F 和C3F 煙葉從葉基到葉尖的10 個(gè)區(qū)段依次標(biāo)記為B1～B10、C1～C10。

圖1 葉片分切方法示意圖Fig.1 Schematic diagram of 10 segmented leaf areas

1.2.2 煙葉表面掃描電鏡圖像采集

按照文獻(xiàn)［11］的方法和要求采集2 個(gè)部位煙葉不同區(qū)段葉片正面的掃描電鏡圖像。

1.2.3 煙葉表面掃描電鏡圖像處理

參照文獻(xiàn)［8］的方法利用PHOTOSHOP 16.0對(duì)掃描電鏡圖像中的細(xì)胞面積和周長(zhǎng)進(jìn)行量化處理，并計(jì)算細(xì)胞形態(tài)因子。

細(xì)胞形態(tài)因子是反映細(xì)胞形狀與圓形相差的程度及不規(guī)則程度，其數(shù)值越大，表示形狀偏離圓形越遠(yuǎn)，形狀越不規(guī)則［29］。

按照文獻(xiàn)［30］中的方法計(jì)算氣孔密度和氣孔指數(shù)。

1.2.4 分切煙葉感官品質(zhì)評(píng)價(jià)

2 個(gè)部位的煙葉經(jīng)Fisher 最優(yōu)分割法分析后，再各自選取若干片，根據(jù)最優(yōu)分割比例對(duì)煙葉進(jìn)行分切、去梗和切絲。按照文獻(xiàn)［31］中的方法制作感官評(píng)吸樣品，并采用三點(diǎn)檢驗(yàn)法［32］評(píng)價(jià)分切葉片間的感官品質(zhì)。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2010 對(duì)煙葉表面微觀結(jié)構(gòu)特征指標(biāo)隨區(qū)段位置的變化進(jìn)行回歸分析。利用R 語(yǔ)言中的scale 函數(shù)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。利用Fisher 最優(yōu)分割法對(duì)煙葉區(qū)段進(jìn)行劃分。

2 結(jié)果與討論

2.1 煙葉不同區(qū)段表面微觀結(jié)構(gòu)特征指標(biāo)的變化

云煙87 B2F 和C3F 煙葉10 個(gè)區(qū)段表面微觀結(jié)構(gòu)特征指標(biāo)的變化趨勢(shì)如圖2 所示，其中C3F煙葉不同區(qū)段表面細(xì)胞形態(tài)的部分掃描電鏡圖片見圖3。由圖2 可以看出，從葉基到葉尖，細(xì)胞面積、細(xì)胞周長(zhǎng)和細(xì)胞形態(tài)因子呈先增大后減小的拋物線形變化趨勢(shì)，細(xì)胞密度和氣孔密度呈先降低后升高的拋物線形變化趨勢(shì)，氣孔指數(shù)總體呈線性增加的趨勢(shì)?；貧w方程的擬合度均較高（R2≥0.878 0），且回歸方程經(jīng)方差分析檢驗(yàn)均達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。葉基部和葉尖部的細(xì)胞面積、周長(zhǎng)相對(duì)較小，形狀相對(duì)較規(guī)則，細(xì)胞密度和氣孔密度較高；葉中部的細(xì)胞面積、周長(zhǎng)較大，形狀較不規(guī)則，細(xì)胞密度和氣孔密度相對(duì)較低。煙葉不同區(qū)段表面微觀結(jié)構(gòu)特征存在差異的主要原因可能是由于不同區(qū)段的生理特性以及在生長(zhǎng)過程中所受的光照條件等生態(tài)因子不同，致使其內(nèi)含物質(zhì)積累量不同［20-21］，最終導(dǎo)致煙葉不同區(qū)段的品質(zhì)、物理特性和表面微觀結(jié)構(gòu)特征也存在差異。

圖2 云煙87 B2F 和C3F 煙葉不同區(qū)段表面微觀結(jié)構(gòu)指標(biāo)的變化Fig.2 Variation trends of surface microstructure indexes for different segments of B2F and C3F tobacco leaves of Yunyan 87

圖3 云煙87 C3F 煙葉10 個(gè)區(qū)段葉片表面的掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron microscopy pictures of 10 segments of C3F tobacco leaves of Yunyan 87

成熟度好的煙葉細(xì)胞形狀不規(guī)則程度較高，葉片結(jié)構(gòu)相對(duì)疏松的煙葉細(xì)胞密度較大，身份相對(duì)適中的煙葉氣孔密度較小［6-8］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，葉片中部的成熟度較好，身份適中，葉片結(jié)構(gòu)的疏松度相對(duì)較差；葉基部和葉尖部的成熟度相對(duì)較差，身份偏薄，而葉片結(jié)構(gòu)的疏松度較好。

此外，從云煙87 的B2F 和C3F 初烤煙葉相同區(qū)段表面微觀結(jié)構(gòu)指標(biāo)均值可以看出，細(xì)胞面積、細(xì)胞周長(zhǎng)、氣孔密度、氣孔指數(shù)總體存在B2F >C3F的趨勢(shì)，細(xì)胞形態(tài)因子、細(xì)胞密度總體存在C3F >B2F 的趨勢(shì)。由于不同部位煙葉自身生理特性、生長(zhǎng)狀況及光照條件的差異，導(dǎo)致部位間葉片的物理特性存在較大差異。中部葉的成熟度及疏松度高于上部葉，且身份適中，油潤(rùn)感較強(qiáng)，因此在表面微觀結(jié)構(gòu)上，中部葉的細(xì)胞面積、細(xì)胞周長(zhǎng)小于上部葉，而細(xì)胞密度、細(xì)胞形態(tài)因子則大于上部葉，部位間葉片表面微觀結(jié)構(gòu)的變化趨勢(shì)與過偉民等［10］的研究結(jié)果一致。

2.2 基于表面微觀結(jié)構(gòu)特征和Fisher 最優(yōu)分割法的煙葉區(qū)段劃分

2.2.1 表面微觀結(jié)構(gòu)指標(biāo)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理

云煙87 B2F 和C3F 煙葉不同區(qū)段表面微觀結(jié)構(gòu)指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果見表1。

2.2.2 煙葉區(qū)段直徑計(jì)算

Fisher 最優(yōu)分割法用“直徑”來表示段內(nèi)的差異程度，段內(nèi)差異越小，“直徑”就越小，一般采用離差平方和作為“直徑”［33］。根據(jù)表1 中的標(biāo)準(zhǔn)化指標(biāo)矩陣分別得到云煙87 B2F 和C3F 煙葉不同區(qū)段的“直徑”，結(jié)果見表2。

表1 云煙87 B2F 和C3F 煙葉不同區(qū)段表面微觀結(jié)構(gòu)指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化值Tab.1 Standardized values of surface microstructure indexes of different segments of B2F and C3F tobacco leaves of Yunyan 87

表2 云煙87 B2F 和C3F 煙葉不同區(qū)段“直徑”計(jì)算結(jié)果Tab.2 Diameters of different segments of B2F and C3F tobacco leaves of Yunyan 87

2.2.3 煙葉不同分類數(shù)最小目標(biāo)函數(shù)計(jì)算和分類

根據(jù)不同區(qū)段“直徑”的計(jì)算結(jié)果（表2），按照文獻(xiàn)［34］中的方法得到云煙87 B2F 和C3F 煙葉10 個(gè)區(qū)段不同分類數(shù)k的最小目標(biāo)函數(shù)值e［p（n，k）］和具體分類情況，結(jié)果見表3。

表3 云煙87 B2F 和C3F 煙葉不同分類數(shù)的最小目標(biāo)函數(shù)值及分類Tab.3 Minimum objective function and classification of different k values of B2F and C3F tobacco leaves of Yunyan 87

2.2.4 煙葉最優(yōu)分類數(shù)確定

根據(jù)表3 繪制出云煙87 B2F 和C3F 煙葉最小目標(biāo)函數(shù)值e［p（n，k）］與分類數(shù)k值的關(guān)系圖（圖4）。由圖4 可見，最小目標(biāo)函數(shù)值e［p（n，k）］隨k值單調(diào)遞減。

圖4 云煙87 B2F 和C3F 煙葉最小目標(biāo)函數(shù)e［p（n，k）］與k 值的關(guān)系Fig.4 Relationship between the minimum objective function e［p（n，k）］and k value of B2F and C3F tobacco leaves of Yunyan 87

B2F 煙葉在k值為3 和4 處出現(xiàn)明顯拐點(diǎn)，所以分3 類或4 類較好。根據(jù)文獻(xiàn)［33］通過計(jì)算最小目標(biāo)函數(shù)比值β（k）=e［p（n，k-1）］/e［p（n，k）］可知，β（3）=2.970，β（4）=2.461，β（3）>β（4）。因此，k=3時(shí)為最優(yōu)分類數(shù)，即B1～B2、B3～B7、B8～B10。此外，按照文獻(xiàn)［34］中的方法計(jì)算并比較Fα與F的大小，云煙87 B2F 煙葉分3 段時(shí)的F值為24.977，則F>F0.05（F0.05=4.737）。因此，云煙87 B2F 煙葉的最優(yōu)分割比例（葉基∶葉中∶葉尖）為20%∶50%∶30%。

C3F 煙葉在k值為3 時(shí)出現(xiàn)明顯拐點(diǎn)，因此分3 類較好，即C1～C3、C4～C8、C9～C10。經(jīng)計(jì)算云煙87 C3F 煙葉分3 段時(shí)的F值為22.717，則F>F0.05。因此，云煙87 C3F 煙葉的最優(yōu)分割比例（葉基∶葉中∶葉尖）為30%∶50%∶20%。

2.3 分割煙葉感官品質(zhì)的檢驗(yàn)

根據(jù)上述分析結(jié)果，按照分割比例要求對(duì)云煙87 B2F 和C3F 煙葉進(jìn)行分切，不同分切樣品間的感官品質(zhì)差異性檢驗(yàn)結(jié)果見表4。可以看出，對(duì)于云煙87 B2F 和C3F 初烤煙葉，分切后各區(qū)段煙葉間的感官品質(zhì)特征均存在顯著差異，說明葉片表面微觀結(jié)構(gòu)特征結(jié)合Fisher 最優(yōu)分割法能將一片煙葉中品質(zhì)差異較大的區(qū)段有效分開。

表4 云煙87 B2F 和C3F 分割煙葉的感官品質(zhì)差異性檢驗(yàn)Tab.4 Difference examination of sensory quality of segmented B2F and C3F tobacco leaves of Yunyan 87

3 結(jié)論

①煙葉不同區(qū)段的表面微觀結(jié)構(gòu)特征總體存在一定差異，從葉基到葉尖，細(xì)胞面積、細(xì)胞周長(zhǎng)和細(xì)胞形態(tài)因子量化值呈先增大后減小的拋物線形變化趨勢(shì)，細(xì)胞密度和氣孔密度呈先降低后升高的拋物線形變化趨勢(shì)，氣孔指數(shù)總體呈線性增加趨勢(shì)。②基于標(biāo)準(zhǔn)化的微觀結(jié)構(gòu)指標(biāo)數(shù)據(jù)，利用Fisher 最優(yōu)分割法確定了云煙87 的B2F、C3F 煙葉的最佳分割比例（葉基∶葉中∶葉尖），B2F 為20%∶50%∶30%，C3F為30%∶50%∶20%。③2個(gè)部位煙葉分切后各區(qū)段間的整體感官品質(zhì)特征均存在顯著差異，葉片表面微觀結(jié)構(gòu)特征結(jié)合Fisher 最優(yōu)分割法能將同一片煙葉品質(zhì)差異較大的區(qū)段有效分開。