李添，李肖，田俊生，高曉霞，秦雪梅，周玉枝

山西大學 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心/化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006

抑郁癥是一類情感性精神障礙，近年來，由于工作、生活壓力增大，加之各種社會因素的產(chǎn)生，使得抑郁癥越來越頻發(fā)[1]，近10 年，抑郁癥成為了精神殘疾的主要原因[2]。目前，關于抑郁癥的研究多數(shù)集中在海馬、額葉皮質和紋狀體等中樞神經(jīng)系統(tǒng)[3-4]，而肝臟作為機體物質代謝和能量代謝的中心，在抑郁癥研究中也有不可或缺的作用。根據(jù)中醫(yī)理論，抑郁是由“肝氣郁結”引起的，因此，緩解“肝氣郁結”被認為是治療抑郁的有效療法[5]。Jia 等[6-7]采用液相色譜-質譜法（LC-MS）代謝組學篩選出大鼠肝臟中18 種慢性不可預知溫和應激（CUMS）誘導產(chǎn)生的差異代謝物，通過分子生物學手段驗證了肝臟組織中與抑郁最相關的磷脂和膽汁酸代謝通路中關鍵酶（包括溶血磷脂酶I、溶血磷脂水解酶、氨基酸N-酰基轉移酶和谷氨酸脫氫酶）的表達水平。結果表明，CUMS 會導致肝組織代謝輪廓和基因表達發(fā)生一系列改變，明確了柴胡疏肝散對其有明顯的改善作用，因此闡明了CUMS 誘發(fā)的抑郁癥與肝損傷之間的關系。Chen 等[8]利用核磁共振氫譜（1H-NMR）和LC-MS代謝組學技術發(fā)現(xiàn)，逍遙散可以改善CUMS 誘導的肝損傷，調(diào)節(jié)了該模型誘導的35 個肝臟生物標志物中的23 個；肝臟中谷氨酰胺和谷氨酸水平及谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酰胺酶（GLS）活性的測定結果表明，谷氨酰胺和谷氨酸代謝通路可能是逍遙散抗抑郁和保肝作用的潛在靶標。因此，將肝臟作為研究對象來深入探索疏肝解郁方對抑郁癥的作用機制具有一定意義。

柴胡-白芍藥對作為疏肝解郁方的基礎藥對，兩者配伍最早見于漢代的《傷寒論》中。柴胡辛散，疏肝泄熱，其有效成分具有解熱、抗炎、抗肝損傷及促進免疫系統(tǒng)功能等藥理作用。白芍收斂，止痛柔肝，臨床研究表明，白芍可用于平抑肝陽導致的頭痛、眩暈、煩躁易怒等。二藥配伍使用，一散一斂[9]，符合中醫(yī)理論中肝臟用藥特性，故對于肝氣不舒引發(fā)的抑郁，恰當?shù)厥褂么怂帉?，將有助于臨床療效的提高。

代謝組學是可以在特定時間和條件下對生物系統(tǒng)中的小分子代謝物進行全面分析的一種組學技術[10]，通過考察生物機體受到疾病干擾后內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的整體變化，研究疾病及藥物的作用機制。抑郁癥與代謝紊亂密切相關，代謝組學研究為抑郁癥代謝靶標的尋找提供了新的思路，包括潛在診斷指標[11-12]、疾病可能的生物標志物[13]和藥物作用機制[14]研究等多個方面。本研究利用1H-NMR 代謝組學技術，考察柴胡-白芍藥對對CUMS誘導的抑郁模型大鼠肝臟中紊亂的內(nèi)源性代謝物的調(diào)節(jié)作用，分析柴胡-白芍藥對配伍后抗抑郁的代謝途徑，從而揭示該藥對的抗抑郁作用機制。

1 材料

1.1 試藥

柴胡（產(chǎn)地河北，批號：1708255131）、白芍（產(chǎn)地安徽，批號：1710436111）飲片購于山西省和仁堂中藥飲片有限公司，經(jīng)山西大學秦雪梅教授鑒定為傘形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.干燥根和毛莨科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根。鹽酸文拉法辛膠囊（批號：200101，成都倍特藥業(yè)股份有限公司）；蔗糖（天津市大茂化學試劑廠）；重水（美國Norell公司）。

1.2 儀器

AR2140型分析天平（上海奧豪斯國際貿(mào)易有限公司）；DHFSTPRP-24 型高通量組織研磨儀（寧波洛尚智能科技有限公司）；SCIENTZ-12N 型真空冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；TGL-16型離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）；600 MHz AVANCE Ⅲ型超導核磁共振波譜儀（瑞士Bruker公司）。

1.3 實驗動物

SPF 級健康雄性SD 大鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006，體質量（190±10）g，飼養(yǎng)于室內(nèi)溫度為20～24 ℃、相對濕度為45%～55%、明暗交替周期12 h 環(huán)境中。動物實驗獲得山西大學倫理委員會的批準（批準號：SXULL2016036）。

2 方法

2.1 柴胡白芍合并液制備

參考前期實驗提取過程[15]，稱取柴胡-白芍（1∶1）飲片，用8倍量70%乙醇浸泡1 h，加熱回流2 h，提取2 次，合并提取液，靜置濾過并進行濃縮，冷凍干燥成細粉，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，給藥前用蒸餾水超聲溶解。

2.2 動物分組與給藥

選擇體質量及行為學指標結果相近的大鼠45只，隨機分為5 組，每組9 只，分別為對照組、模型組、陽性藥文拉法辛（0.035 g·kg-1）組及柴胡-白芍藥對低、高劑量（CBL、CBH，以生藥量計分別為15、30 g·kg-1）組，給藥組按照10 mL·kg-1進行灌胃，從造模開始，每天給藥1 次，給藥28 d，對照組、模型組給予相同體積的蒸餾水。

2.3 CUMS抑郁模型的復制

大鼠適應7 d后，對照組大鼠正常飼養(yǎng)，不接受任何刺激，其余各組大鼠裝入單籠喂養(yǎng)，并按照前期實驗室建立的程序制備CUMS 模型（造模4 周，共28 d）。為了確保刺激因素的不可預測性，隨機安排了每日刺激，且每個刺激因素都不應連續(xù)出現(xiàn)，發(fā)生的總數(shù)不應超過4次，該過程持續(xù)28 d[16]，包括禁水、禁食（各24 h），熱刺激10 min，超聲刺激（60 W，3 h），足底電擊（持續(xù)2 s，間隔10 s，共10次），冰水游泳（4 ℃，高50 cm、半徑10 cm 玻璃容器），晝夜顛倒，束縛（3 h）[15]。

2.4 行為學測試

2.4.1 體質量檢測 在開始造模前1 周及造模后的4周均進行大鼠體質量稱量，共5次。

2.4.2 曠場實驗 測試時間與稱量大鼠體質量時間一致。實驗裝置由面積為100 cm2的黑色區(qū)域組成，四周是高40 cm 的黑色壁板。將大鼠置于區(qū)域中心，適應環(huán)境60 s，探索4 min，觀察測試期間每只大鼠的穿越格數(shù)及直立次數(shù)（前肢離開地面10 mm，后肢保持不動為準）。每次測試后，用10%乙醇清洗曠場設備，以消除殘留的氣味[17]。

2.4.3 糖水偏愛實驗 在造模開始前一天和造模的最后一天實行。在實驗前二天，將大鼠單獨飼養(yǎng)，提供2 瓶1%的蔗糖水使大鼠適應蔗糖溶液，第一天內(nèi)保持原狀，第二天用純凈水替換其中1 瓶蔗糖水。經(jīng)過上述蔗糖偏愛率訓練后，所有大鼠被剝奪食物和水12 h，然后自由選擇飲用蔗糖水或水12 h。根據(jù)消耗量，按照公式（1）計算結果[17]。

2.4.4 強迫游泳實驗 大鼠末次給藥后，進行強迫游泳實驗，測試前一天，將大鼠放入水深30 cm（25 ℃）的玻璃圓筒（直徑20 cm、高50 cm）中，進行15 min 的預測試以消除水引起的急性壓力。預測試24 h后，進行5 min的正式實驗。不動時間從大鼠僅進行幅度較小動作且其頭部保持水上時開始計算[17]。

2.5 肝組織樣本的收集

末次給藥結束后，麻醉大鼠，進行腹主動脈取血，快速收集肝組織暫存于液氮中，之后轉移至-80 ℃冰箱保存。

2.6 代謝組學樣品制備及測定

從每只大鼠的外側葉收集肝組織約200 mg，加入甲醇600 μL、超純水300 μL，在冰水浴中勻漿；15 000×g、4 ℃離心20 min，收集上清液，真空冷凍濃縮儀中吹干，復溶于D2O 磷酸鹽緩沖液600 μL[0.2 mol·L-1Na2HPO4/NaH2PO4，pH=7.4，含0.010%三甲基硅烷丙酸鈉鹽（TSP）]，渦旋混勻，15 000×g、4 ℃離心20 min后吸取上清液用于分析。

2.7 1H-NMR譜圖數(shù)據(jù)處理與分析

所有NMR 光譜在Bruker 600-MHz AVANCE ⅢNMR 光譜儀上記錄。1H-NMR 譜圖采用CarrPurcell-Meiboom-Gill 脈沖序列，由64 次掃描組成；采樣時間：2.654 2 s；弛豫延遲時間：1.0 s；采樣間隔：41.5 s；頻譜寬度：12 345.7 Hz；光譜數(shù)據(jù)點：65 536。

使用MestReNova 6.1.1 軟件進行1H-NMR 圖譜處理。對每張圖譜進行相位和基線手動校正，并以TSP 的化學位移δ0.00 為標準，切除δ4.62～5.17的水峰，對δ0.75～8.56 的核磁圖譜以0.01 為單位進行積分和總峰面積歸一化，導出數(shù)據(jù)用于多元統(tǒng)計分析。

2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SIMCA-P 13.0 進行主成分分析（PCA），觀察樣本整體分布，采用偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘法-判別分析（OPLSDA）進行各組樣本趨勢的比較，并對建立的模型進行排列檢驗，排列檢驗是對模型擬合度（R2）和預測能力（Q2）的計算。利用V-S-plot[變量重要性投影（VIP）＞1]及t檢驗（P＜0.05）篩選差異代謝物。HMDB 數(shù)據(jù)庫（http://www.hmdb.ca）、BMRB 數(shù)據(jù)庫（https://bmrb.io）等用于代謝物的鑒定，并使用MetaboAnalyst（https://www.metaboanalyst.ca）進行代謝通路分析。采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計分析，t檢驗比較兩組之間的統(tǒng)計學差異，one-way ANOVA 和Bonferroni 事后檢驗比較更多組之間的顯著差異。

3 結果

3.1 行為學測試

3.1.1 體質量 與對照組比較，模型組大鼠體質量明顯降低（P＜0.001），表明CUMS 抑郁模型造模成功；與模型組比較，文拉法辛組、CBL 組、CBH 組大鼠體質量均顯著升高（P＜0.01，P＜0.001，圖1）。結果顯示，柴胡-白芍藥對能有效逆轉CUMS引起的大鼠體質量減輕。

3.1.2 曠場實驗 與對照組比較，模型組大鼠穿越格數(shù)和直立次數(shù)都顯著減少（P＜0.001）；與模型組比較，文拉法辛組、CBL 組、CBH 組大鼠穿越格數(shù)均顯著增加（P＜0.001，圖1）；文拉法辛組、CBL組、CBH組大鼠直立次數(shù)均顯著增加（P＜0.01，P＜0.001，圖1）。結果表明，柴胡-白芍藥對能夠顯著改善抑郁大鼠的自主活動和探索能力。

圖1 柴胡-白芍藥對CUMS誘導的抑郁大鼠行為學的影響（,n=9）

3.1.3 糖水偏愛實驗 與對照組比較，模型組大鼠糖水偏愛率顯著降低（P＜0.001）。與模型組比較，文拉法辛組、CBL 組、CBH 組大鼠的糖水偏愛率均顯著升高（P＜0.001，圖2）。結果表明，柴胡-白芍藥對對于抑郁大鼠快感缺失的情況有顯著的改善作用。

圖2 柴胡-白芍藥對CUMS誘導的抑郁大鼠糖水偏愛率和強迫游泳不動時間的影響（,n=9）

3.1.4 強迫游泳實驗 與對照組比較，模型組大鼠強迫游泳不動時間顯著增加（P＜0.001）。與模型組比較，文拉法辛組、CBL 組、CBH 組大鼠的不動時間均顯著減少（P＜0.001，圖2）。結果表明，柴胡-白芍藥對能明顯緩解抑郁模型大鼠的行為絕望。

3.2 1H-NMR代謝組學分析

3.2.1 代謝物鑒定 參照文獻[15]報道和HMDB、BMRB 數(shù)據(jù)庫對核磁圖譜（圖3）進行分析，共指認出42種內(nèi)源性代謝物，結果見表1。

圖3 對照組大鼠肝臟樣本1H-NMR圖譜

表1 大鼠肝臟樣本1H-NMR數(shù)據(jù)歸屬

續(xù)表1

3.2.2 多元統(tǒng)計分析 無監(jiān)督的PCA 結果顯示，對照組和模型組能區(qū)分開（圖4A）；運用PLS-DA（圖4B）驗證CUMS 模型的可靠性，所有左側數(shù)據(jù)點均低于右側且相交于Y軸負半軸（R2X=0.741，R2Y=0.987，Q2=0.947），表明CUMS模型制備成功、可靠，不存在過度擬合現(xiàn)象。有監(jiān)督的OPLS-DA 結果顯示，對照組和模型組可明顯分開（圖4C），結合V-S-plot 圖中VIP 值＞1、P（corr）≥0.58 或≤-0.58及t檢驗（P＜0.05）篩選對照組與模型組顯著的差異變量。V-S-plot 圖（圖4D）中變量的重要程度由VIP 值的大小來衡量，變量離原點越遠則VIP 值越大，變量的重要性也越大[15]。對對照組、模型組、文拉法辛組、CBL、CBH組進行OPLS-DA后也可以看出，各組間能清楚地分離（圖4E），提示各給藥組對篩選出的肝臟差異代謝物的調(diào)節(jié)程度不同。

圖4 各組大鼠肝臟樣本代謝物多元統(tǒng)計分析

3.2.3 差異代謝物分析 OPLS-DA 篩選出對照組、模型組的24 個差異代謝物（圖5～6）。與對照組比較，模型組大鼠肝臟中尿囊素、α-葡萄糖、β-葡萄糖、膽堿、甜菜堿、二甲基甘氨酸、甘油和氧化型谷胱甘肽8 個代謝物水平升高；醋酸鹽、丙氨酸、肌酸、二甲胺、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、次黃嘌呤、異亮氨酸、亮氨酸、低密度脂蛋白、賴氨酸、丙酮酸、酪氨酸、鄰磷酸膽堿和纈氨酸16 個代謝物水平降低。與模型組比較，CBL 能顯著回調(diào)其中除谷氨酰胺、甘氨酸和鄰磷酸膽堿外的21個差異代謝物，而CBH能顯著回調(diào)9個代謝物，包括尿囊素、甜菜堿、膽堿、二甲基甘氨酸、甘油、氧化型谷胱甘肽、亮氨酸、賴氨酸和酪氨酸。

圖5 柴胡-白芍藥對對CUMS誘導的抑郁大鼠肝組織中代謝物的影響（,n=7）

圖6 各組大鼠肝組織差異代謝物聚類及熱圖分析

3.2.4 代謝通路分析 將1H-NMR 找到的與抑郁癥相關的24個差異代謝物及柴胡-白芍配伍藥對顯著回調(diào)的21 個差異代謝物輸入Metaboanalyst（https://www.metaboanalyst.ca）中進行代謝通路分析。根據(jù)代謝通路重要值（impact value）＞0.1 及代謝通路富集水平-lgP＞2 作為選擇標準，共篩選出10 條代謝通路（圖7A），在與抑郁相關的10條代謝通路中，柴胡-白芍藥對能影響其中的7 條（圖7B）。利用京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路關聯(lián)分析（圖8）探討生物標志物之間的相關性，可以更系統(tǒng)地體現(xiàn)柴胡-白芍藥對對代謝物的調(diào)節(jié)情況。

圖7 柴胡-白芍藥對對CUMS誘導的抑郁大鼠肝組織中代謝通路的影響

圖8 抑郁癥相關的10條代謝通路網(wǎng)絡

4 討論

柴胡-白芍藥對應用于多個抗抑郁經(jīng)典方劑中，最早可以追溯到東漢張仲景所著《傷寒論》中“四逆散”一方，方中以柴胡入肝膽經(jīng)、升發(fā)陽氣疏肝解郁為君藥，又以白芍斂陰養(yǎng)血柔肝為臣藥。二藥配伍具有調(diào)節(jié)肝郁的作用，在中醫(yī)臨床史上應用悠久。二藥前者功為解表退熱、疏肝解郁、升舉陽氣，后者長于養(yǎng)血斂陰、柔肝止痛、平抑肝陽[18]。

本研究通過CUMS 建立抑郁大鼠模型，探討柴胡-白芍藥對“疏肝解郁”的代謝調(diào)控途徑。利用大鼠體質量變化及其余4 種行為學指標評估柴胡-白芍藥對的藥效，同時通過核磁代謝組學找到抑郁模型大鼠體內(nèi)發(fā)生紊亂的代謝物，分析藥對對代謝輪廓的改善作用，闡述柴胡-白芍藥對發(fā)揮抗抑郁的機制。運用代謝組學技術篩選出對照組與模型組大鼠肝臟中24 個差異代謝物。多元統(tǒng)計分析結果表明，CBL 干預后對差異代謝物的回調(diào)效果更好，能顯著回調(diào)21個抑郁相關代謝物，因此，最終將CBL可回調(diào)的21 個代謝物用于進一步的通路分析。通過代謝通路富集分析，發(fā)現(xiàn)柴胡-白芍藥對主要通過改善7條代謝通路發(fā)揮抗抑郁作用，分別是D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，丙酮酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，酪氨酸代謝，糖酵解或糖異生，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝[19]。

研究表明，谷氨酸與很多精神類疾病的發(fā)生有一定關系，炎癥因子會促進神經(jīng)膠質細胞大量合成谷氨酸并向突觸間隙釋放，谷氨酸激活N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDA），破壞神經(jīng)突觸完整性，造成神經(jīng)細胞凋亡，最終導致抑郁[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，CUMS 會引起大鼠肝組織中谷氨酸含量降低，造成與其相關的2 條代謝通路紊亂，而此現(xiàn)象在柴胡-白芍藥對配伍給藥后都有所改善，表明柴胡-白芍藥對發(fā)揮抗抑郁作用可能與谷氨酸及其介導的通路有關。

芳香族氨基酸苯丙氨酸主要通過苯丙氨酸羥化酶轉化為酪氨酸。酪氨酸可以由酪氨酸羥化酶代謝為二羥苯丙氨酸，然后代謝為多巴胺（DA）等兒茶酚胺類神經(jīng)遞質的前體。DA與抑郁癥的發(fā)病機制密切相關，并且對認知過程具有調(diào)節(jié)作用[21]。因此，作為DA 的主要前體，酪氨酸和苯丙氨酸的中樞和外周濃度的變化也被認為與抑郁癥的發(fā)病有關。本研究發(fā)現(xiàn)，CUMS 抑郁模型大鼠肝組織中酪氨酸水平降低，可能影響神經(jīng)遞質DA 的合成，進而影響抑郁癥的發(fā)生。

糖酵解是將葡萄糖轉化為丙酮酸的代謝過程，糖異生主要發(fā)生在肝臟中，本質上是糖酵解的逆向代謝。糖原是動物體內(nèi)葡萄糖和主要碳水化合物儲存形式的聚合物，提供了葡萄糖的替代來源。與對照組比較，模型組大鼠肝臟中葡萄糖水平升高，表明糖異生使糖原持續(xù)降解為葡萄糖[22]。差異代謝物的回調(diào)效果及通路分析結果表明，柴胡-白芍藥對配伍后可改善CUMS 抑郁模型大鼠的丙酮酸代謝和糖酵解/糖異生。

綜上所述，柴胡-白芍藥對配伍后對CUMS 誘導的抑郁癥大鼠肝臟代謝紊亂有明顯的改善作用，其發(fā)揮抗抑郁作用的潛在機制涉及多條氨基酸代謝途徑和能量代謝。