肖紅，王東春，舒琴，周莉娟

內(nèi)江市第二人民醫(yī)院 藥劑科，四川 內(nèi)江 641000

山茱萸具有澀精固脫、補益肝腎的功效，現(xiàn)代藥理研究表明，山茱萸具有抗氧化、降血糖、抗腫瘤、保護神經(jīng)、抗阿爾茨海默病等作用，主產(chǎn)于我國陜西、甘肅、浙江、山西、江西、安徽、山東等省，為我國傳統(tǒng)名貴中藥材[1]。山萸肉是山茱萸科山茱萸屬植物山茱萸Cornus officinalisSieb.et Zucc.的干燥成熟果肉[2]，具有補益肝腎、收澀固脫的功效?！吨腥A人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版記載，山茱萸的炮制品有山萸肉和酒萸肉，《河南省中藥飲片炮制規(guī)范》2005 年版記載，山茱萸炮制品有山萸肉、酒蒸山萸肉、蒸山萸肉和醋蒸山萸肉。文獻資料顯示，醋蒸山萸肉可增強收斂澀精作用，清蒸山萸肉、酒蒸山萸肉可增強補肝腎作用[3]。山萸肉生品活性成分主要包括環(huán)烯醚萜苷類（莫諾苷、馬錢苷、獐牙菜苷等）、有機酸（沒食子酸）及其酯類、五環(huán)三萜類（齊墩果酸、熊果酸等）、鞣質(zhì)、多糖等[4]，其中，莫諾苷、馬錢苷具有抗神經(jīng)退行性病變、抗血栓、抑制黑色素、抗糖尿病等作用[5]；5-羥甲基糠醛具有抗氧化、抗腫瘤、抗糖尿病及抗組織缺氧等藥理活性[6]；獐牙菜苷有保護肝細胞、促進細胞修復的作用；山茱萸新苷Ⅰ具有抗炎、保肝利膽、抗氧化、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)[7]及防治骨質(zhì)疏松[8]等功效；齊墩果酸與熊果酸為同分異構(gòu)體，均具有降血糖、調(diào)血脂[9]、保肺、保肝、抗腫瘤[10]的作用；沒食子酸具有抗氧化、抗癌、降血糖、調(diào)血脂等作用[11]?，F(xiàn)有文獻多集中在山萸肉和酒萸肉的含量測定，尚未有關(guān)于同時測定山萸肉、酒萸肉、醋萸肉和蒸萸肉中有效成分含量的文獻研究[12-15]。鑒于此，本研究利用高效液相色譜法（HPLC）對山萸肉、酒萸肉、醋萸肉和蒸萸肉中熊果酸、沒食子酸、齊墩果酸、獐牙菜苷、馬錢苷、莫諾苷、5-羥甲基糠醛、山茱萸新苷Ⅰ8 個成分含量進行比較，為提高山茱萸炮制品的質(zhì)量提供參考。

1 材料

U-3000 型高效液相色譜儀（UV2489PDA 檢測器，美國賽默飛世爾公司）；YF-111型高速中藥粉碎機（瑞安市永歷制藥機械有限公司）；ABS-135S型電子天平（d=0.01 mg，瑞士梅特勒公司）；KQ-3200B型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

3 批山茱萸藥材均購于禹州藥材市場，標示產(chǎn)地為河南西峽，經(jīng)內(nèi)江市第二人民醫(yī)院許瓊主任中藥師鑒定為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalisSieb.et Zucc.的干燥成熟果肉。山萸肉、酒萸肉、醋萸肉和蒸萸肉分別按照《中國藥典》2020 年版四部通則0213 炮制。對照品山茱萸新苷Ⅰ（批號：PS1022-0025）、獐牙菜苷（批號：PU0045-0025）均購于成都普思生物科技股份有限公司，純度均大于98%；對照品沒食子酸（批號：110831-201605，純度：90.8%）、熊果酸（批號：110742-201622，純度：94.7%）、莫諾苷（批號：111998-201602，純度：96.3%）、5-羥甲基糠醛（批號：111626-201711，純 度：99.4%）、齊墩果酸（批號：110709-201607，純度：91.7%）、馬錢苷（批號：111640-201707，純度：99.2%）購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Stamsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，10%A；5～10 min，10%～27%A；10～30 min，27%～40%A；30～50 min，40%～60%A；50～65 min，60%A；65～70 min，60%～10%A）；檢測波長[15]：218 nm（0～10 min，沒食子酸）、284 nm（10～15 min，5-羥甲基糠醛）、240 nm（15～50 min，莫諾苷、獐牙菜苷、馬錢苷和山茱萸新苷Ⅰ）、360 nm（50～70 min，齊墩果酸和熊果酸）；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL·min-1；進樣量為10 μL。在上述色譜條件下，供試品中各色譜峰與相鄰色譜峰分離良好，色譜峰對稱因子均在0.95～1.05，理論板數(shù)按莫諾苷計不低于5000。色譜圖見圖1。

圖1 山茱萸供試品溶液和混合對照品溶液高效液相色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 分別取8 個待測成分對照品適量，精密稱定，置同一100 mL 量瓶中，用甲醇超聲溶解并定容，搖勻，制成熊果酸、沒食子酸、齊墩果酸、獐牙菜苷、馬錢苷、莫諾苷、5-羥甲基糠醛、山茱萸新苷Ⅰ質(zhì)量濃度分別為0.287、0.080、0.659、0.051、1.247、2.691、0.002、0.429 mg·mL-1的混合對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 分別取山萸肉、酒萸肉、醋萸肉和蒸萸肉樣品各約20 g，粉碎過篩（二號篩），混勻，分別精密稱取細粉1.0 g，置100 mL具塞錐形瓶中，加入80%甲醇30 mL，閉塞，稱量，超聲提?。üβ剩?50 W，頻率：40 kHz）60 min，放冷至室溫，稱質(zhì)量，用80%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過（0.45 μm），即得[16]。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 取2.2.1 項下混合對照品溶液，分別量取0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL置10 mL 量瓶中，用甲醇定容并稀釋制成系列質(zhì)量濃度混合對照品溶液，按2.1 項下色譜條件測定，記錄色譜圖峰面積。以對照物質(zhì)量濃度為橫坐標（X），8 成分色譜峰峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。數(shù)據(jù)見表1。

表1 山茱萸8個成分的回歸方程及線性范圍

2.3.2 精密度試驗 取2.2.2 項下山萸肉供試品溶液，按2.1項下色譜條件，連續(xù)進樣6針，記錄色譜圖峰面積，計算峰面積RSD。結(jié)果熊果酸、沒食子酸、齊墩果酸、獐牙菜苷、馬錢苷、莫諾苷、5-羥甲基糠醛和山茱萸新苷Ⅰ峰面積RSD 分別為1.65%、1.22%、1.37%、0.64%、1.05%、1.27%、0.86%、1.41%，均符合要求，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取2.2.2 項下山萸肉供試品溶液，分別于0、3、6、9、12 h 后，按2.1 項下色譜條件測定，記錄色譜圖并計算8 個成分峰面積RSD。結(jié)果熊果酸、沒食子酸、齊墩果酸、獐牙菜苷、馬錢苷、莫諾苷、5-羥甲基糠醛和山茱萸新苷Ⅰ峰面積RSD 分別為0.88%、1.06%、1.34%、1.52%、1.35%、1.74%、1.64%、1.09%。表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.3.4 重復性試驗 精密取同一批山萸肉供試品粉末適量，按2.2.2 項下方法平行制備6 份，按2.1 項下色譜條件分析，記錄色譜圖并計算8 個化學成分的峰面積RSD 及含量。結(jié)果沒食子酸、齊墩果酸、熊果酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、獐牙菜苷、馬錢苷和山茱萸新苷Ⅰ含量RSD 分別為1.32%、1.68%、1.12%、0.96%、1.37%、1.11%、1.06%、0.89%，表明該方法重復性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 取同一批已知含量的山萸肉供試品，精密稱取0.5 g，平行9份，分別置100 mL具塞錐形瓶中，分成低、中、高3組，分別精密加入含沒食子酸0.097 mg·mL-1、齊墩果酸0.797 mg·mL-1、熊果酸0.347 mg·mL-1、5-羥甲基糠醛0.002 mg·mL-1、莫諾苷3.252 mg·mL-1、獐牙菜苷0.062 mg·mL-1、馬錢苷1.507 mg·mL-1、山茱萸新苷Ⅰ0.518 mg·mL-1的混合對照品溶液2.0、2.5、3.0 mL，按2.2.2項下方法制備，按2.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖峰面積，計算8 個化學成分的加樣回收率及相應(yīng)RSD，結(jié)果見表2。

表2 山茱萸8個化學成分加樣回收率試驗

續(xù)表2

2.4 樣品含量測定

取3 批山萸肉、酒萸肉、醋萸肉和蒸萸肉供試品，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，每批依法平行測定3 次，記錄色譜圖峰面積，計算各成分的含量，結(jié)果見表3。

表3 山茱萸樣品含量測定結(jié)果（n=3） mg·g-1

3 討論

3.1 待測成分的選擇

現(xiàn)代研究表明，山萸肉生品活性成分主要包括環(huán)烯醚萜苷類、有機酸及其酯類、五環(huán)三萜類、鞣質(zhì)、多糖等，其中以莫諾苷、馬錢苷為代表的環(huán)烯醚萜苷類及以齊墩果酸和熊果酸為主的五環(huán)三萜類化合物是山茱萸最具有生物活性的成分。5-羥甲基糠醛是一種重要的呋喃基化合物，是由單糖經(jīng)美拉德反應(yīng)或焦糖化反應(yīng)脫水生成，性質(zhì)不穩(wěn)定，其體內(nèi)代謝物在一定劑量下有明顯的刺激性、致敏性、腎毒性、致癌性等潛在毒性[17]，同時研究發(fā)現(xiàn)，5-羥甲基糠醛是山萸肉炮制后保肝護肝作用增強的原因之一[18]。因此，選擇熊果酸、沒食子酸、齊墩果酸、獐牙菜苷、馬錢苷、莫諾苷、5-羥甲基糠醛和山茱萸新苷Ⅰ作為山萸肉不同炮制品的待測成分。

3.2 供試品溶液提取方法選擇

本研究考察超聲和熱回流2 種提取方法，60%、70%、80%、90%、100%不同比例的甲醇和乙腈提取溶劑，30、40、60 min 不同超聲提取時間對實驗的影響。結(jié)果熱回流方法提取雜質(zhì)峰較多，莫諾苷色譜峰后有一相鄰色譜峰與其分離效果差，超聲提取法提取完全、操作簡便、干擾峰少；80%甲醇較其他比例提取溶劑，8 個化學成分提取率高；超聲提取時間達到40 min 時，8 個化學成分均可完全溶出，延長提取時間并不能提高提取效率，故選擇80%甲醇超聲提?。?50 W，40 kHz）40 min作為山茱萸不同炮制品供試品溶液的制備方法。

3.3 色譜條件選擇

參考相關(guān)文獻，本研究考察了不同梯度的乙腈-0.1%磷酸、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-水流動相體系對分析結(jié)果的影響[19]。結(jié)果表明，梯度洗脫較等度洗脫色譜柱壓力更平穩(wěn)，8 個化學成分的分離效果更好，有機相乙腈的洗脫能力優(yōu)于甲醇，0.1%磷酸溶液較水作為流動相無機相色譜峰峰形更好，有效改善了色譜峰拖尾問題。故確定采用乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫作為流動相系統(tǒng)。采用二極管子陣列檢測器，在190～400 nm 對對照品和供試品溶液進行掃描，結(jié)果顯示，莫諾苷等環(huán)烯醚萜苷類成分在240 nm處有最大吸收，沒食子酸在218 nm處有最大吸收，5-羥甲基糠醛最大吸收波長為284 nm，齊墩果酸和熊果酸最大吸收波長為360 nm，故本研究采用波長切換法［218 nm（0～10 min，沒食子酸）、284 nm（10～15 min，5-羥甲基糠醛）、240 nm（15～50 min，莫諾苷、獐牙菜苷、馬錢苷和山茱萸新苷Ⅰ）、360 nm（50～70 min，齊墩果酸和熊果酸）］研究山茱萸不同炮制品中8個化學成分的含量。

3.4 含量測定結(jié)果分析

山萸肉炮制品有效成分的含量變化與中醫(yī)理論的“生熟異用”觀點有較大關(guān)聯(lián)。由表3 可知，酒萸肉、醋萸肉和蒸萸肉相對于山萸肉，莫諾苷、獐牙菜苷、馬錢苷和山茱萸新苷Ⅰ的含量均降低；而沒食子酸、5-羥甲基糠醛、齊墩果酸和熊果酸的含量經(jīng)酒制和醋制后均增加。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，山萸肉經(jīng)酒蒸炮制后齊墩果烷系皂苷可水解為齊墩果酸和熊果酸，因此抗病毒、抗炎和抗氧化應(yīng)激作用增強；莫諾苷等環(huán)烯醚萜苷類成分經(jīng)炮制后降解；山萸肉經(jīng)蒸制后美拉德反應(yīng)或焦糖化反應(yīng)加強，5-羥甲基糠醛含量增加，以酒萸肉增加最為明顯；山萸肉炮制品較山萸肉生品中沒食子酸的含量增加，但炮制品間含量差異較小[20]。

4 結(jié)論

本研究建立了HPLC 同時測定山茱萸不同炮制品（山萸肉、酒萸肉、醋萸肉和蒸萸肉）中熊果酸、沒食子酸、齊墩果酸、獐牙菜苷、馬錢苷、莫諾苷、5-羥甲基糠醛、山茱萸新苷Ⅰ8 個活性成分的含量測定方法，經(jīng)方法學驗證，該方法準確、專屬、耐用性高、操作簡單、重復性好，可為山茱萸及其炮制品的臨床研究提供參考。