王君君，李建香，張子健，過偉峰*

（1. 南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210023；2. 南京中醫(yī)藥大學附屬南京中醫(yī)院，江蘇 南京 210023）

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是一種原發(fā)性非外傷性腦實質內出血，在我國約占全部卒中患者的20%～30%［1］，急性期病死率約30%～40%，預后不良，甚則致殘。腦出血后數(shù)分鐘即可產生血腫占位，顱內壓升高，繼而出現(xiàn)低灌注，浸潤組織產生炎性反應［2］。國醫(yī)大師周仲瑛創(chuàng)立的涼血通瘀方具有通腑泄熱、涼血化瘀之功效，筆者應用此方治療急性腦出血，前期臨床研究觀察證實其有助于改善神經系統(tǒng)癥狀體征，減輕病情，改善預后［3］，實驗研究有抗炎效應［4］。本研究采用涼血通瘀方干預腦出血大鼠模型，觀察其對腦組織TLR4 和NF-κB p65 的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

健康雄性成年SD大鼠24只，體質量220～300 g，購自江蘇省青龍山動物繁育中心，許可證號：SCXK（蘇）2017-0001。置于南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心飼養(yǎng)：5只大鼠為一籠，不限制飲水、攝食，給予恒溫恒濕、12 h光照與12 h黑暗交替環(huán)境。本實驗方案經由南京中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審核，批準號為：201905A041。

1.2 實驗藥物

涼血通瘀方藥組成：熟大黃10 g，水牛角（先煎）30 g，生地黃20 g，赤芍15 g，牡丹皮10 g和石菖蒲10 g，購自安徽滬春堂中藥飲片有限公司。制成每毫升含1.1 g鮮藥的水煎劑藥液，放置于冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實驗試劑

蛋白酶抑制劑混合物（貨號：P1005）、裂解液（貨號：P0013B）、PMSF（貨號：ST505）、蛋白Marker（貨號：P0075）、4 × 上樣緩沖液、BCA 蛋白濃度測定（貨號：P0010S）、β-巰基乙醇（上海碧云天生物技術有限公司）；過硫酸銨、Tween-20（北京索萊寶科技有限公司）；TLR4 抗體（貨號：ab217274）、羊抗兔IgG H&L 二抗（貨號：ab6721）、內參抗體（貨號：ab181602）［艾博抗（上海）貿易有限公司］；SYBR Premix Ex Taq，RT Master Mix（日本Takara 公司）；TLR4、GAPDH 引物（上海生工生物工程有限公司設計）。

1.4 實驗儀器

注射泵控制器（型號TJ-1A，保定蘭格恒流泵有限公司）；腦立體定位儀（型號990-685，加拿大David Kopf Instruments 公司）；多功能開顱鉆（型號Thakita 6222D，日本Makita 公司）；50 μL 微量進樣器（上海光正醫(yī)療儀器）；電子天平（型號：CPA1003P，德國Sartorius）；酶標儀（美國PerkinElmer，型號：PE）；球磨儀（Retsch，型號：MM400）；微型垂直電泳系統(tǒng)（Bio-Rad，型號Min i-Protoan T cua）；蛋白半干轉印儀（Bio-Rad，型號：170-3940）；離心機（Eppendorf，型號：5417R）；超靈敏發(fā)光成像儀（GE，型號：LAS4000）；振蕩器（海門其林貝爾，型號：vortex-5）；7500 Real Time PCR儀（ABI 公司）。

2 方法

2.1 動物造模及給藥

在動物中心適應性飼養(yǎng)1 周后，將24 只健康成年SD 大鼠隨機分成正常組、假手術組、模型組和涼血通瘀組，共4 組，每組6 只。模型組和涼血通瘀組采用注射泵控制器注血/二次退針法制作腦出血模型［5］：調整立體定向儀，使門齒鉤低于耳間線2.4 mm；麻醉仰臥固定，頭部正中切開，定位右側尾狀核（前囟點右側中線旁開3 mm、冠狀縫前0.2 mm），鉆孔；翻轉分離尾動脈，微量進樣器穿刺抽血50 μL，固定于立體定位儀，顱骨表面與進針相距6 mm，注射泵以10 min勻速注血50 μL，留針10 min，退針2 mm，再留針5 min，緩慢退針，無菌骨蠟封閉，縫合皮膚。

按照Longa五級評分法［6］進行行為學評分，1～3分表示造模成功。假手術組同樣定位后置入空針，不注血。涼血通瘀組按照實驗動物和人體臨床用藥劑量換算公式所得劑量，灌胃涼血通瘀方水劑（1.0 mL/100 g）。假手術組、模型組每日給予等劑量蒸餾水灌胃。各組大鼠均連續(xù)灌胃3 d后取材。

2.2 觀察指標及方法

2.2.1 行為學評分

按照Longa 五級評分法［6］測評大鼠神經功能缺損程度，再由2 名經過專業(yè)培訓的研究人員對大鼠評分，計算平均分［7］。

2.2.2 腦組織TLR4、NF-κB蛋白表達

采用Western Blot 法，加入RIPA 裂解液，使用球磨儀勻漿收集大腦總蛋白，采用BCA 試劑盒、酶標儀定量蛋白濃度，以GAPDH 為內參。室溫下配置10%SDS-PAGE，待膠凝固后加入樣本，進行電泳及半干轉。用脫脂奶粉配置濃度為5%的封閉液，4 ℃條件下孵育一抗過夜，室溫孵育二抗2 h，配置曝光反應液，運用超靈敏發(fā)光成像儀進行蛋白條帶成像及檢測，ImageJ軟件進行計算和分析相對蛋白灰度值。

2.2.3 腦組織TLR4 mRNA的表達

采用RT-PCR 法，取5 mm3左右大小的大鼠腦組織放置于研磨管中，加入研磨鋼珠，按50 mg 組織/mL加入Trizol 裂解細胞，提取總RNA，分光光度計檢測腦組織RNA 濃度及純度。以逆轉錄試劑說明書為標準配制反應體系，進行逆轉錄。處理逆轉錄后的產物，設定PCR 反應程序，使用7500 PCR 儀進行擴增，GAPDH作為內參，利用2-△△CT公式計算目的基因表達量。

2.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行所有數(shù)據(jù)分析，滿足正態(tài)分布，則以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用方差分析。P≤0.05即為具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠行為學評分比較

與正常組比較，模型組、涼血通瘀組大鼠行為學評分明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，涼血通瘀組大鼠行為學評分明顯降低（P＜0.01）。具體見表1。

表1 各組大鼠行為學評分比較（±s，分）

表1 各組大鼠行為學評分比較（±s，分）

注：與正常組比較，$$P ＜0.01；與假手術組比較，**P ＜0.01；與模型組比較，##P ＜0.01。

組別正常組假手術組模型組涼血通瘀組n6 6 6 6 Longa五級評分0 0 1.667±0.516$$**1.167±0.408$$**##

3.2 各組大鼠腦組織TLR4、NF-κB蛋白表達

與正常組和假手術組比較，模型組大鼠腦組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達皆明顯升高（P＜0.01），涼血通瘀組NF-κB p65蛋白表達升高（P＜0.05）；與模型組比較，涼血通瘀組大鼠腦組織TLR4蛋白表達明顯下降（P＜0.01），NF-κB p65 蛋白表達下降（P＜0.05）。具體見表2。各組大鼠腦組織TLR4、NF-κB p65電泳圖見圖1。

表2 各組大鼠腦組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達（±s，灰度值）

表2 各組大鼠腦組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達（±s，灰度值）

注：與正常組比較，$$P ＜0.01；與假手術組比較，**P ＜0.01，*P ＜0.05；與模型組比較，##P ＜0.01，#P ＜0.05。

組別正常組假手術組模型組涼血通瘀組n6 6 6 6 TLR4 0.174±0.928 0.278±0.202 0.633±0.147$$*0.259±0.025##NF-κB p65 0.472±0.712 0.572±0.186 1.106±0.212$$**0.762±0.210$#

圖1 各組大鼠腦組織中TLR4、NF-κB p65蛋白電泳圖

3.3 各組大鼠腦組織TLR4 mRNA的表達

引物設計見表3。與正常組、假手術組及涼血通瘀組比較，模型組大鼠腦組織TLR4 mRNA的表達明顯升高（P＜0.01），涼血通瘀組與正常組及假手術組未見明顯差異，見表4。

表3 引物設計

表4 各組大鼠腦組織TLR4 mRNA的表達（±s）

表4 各組大鼠腦組織TLR4 mRNA的表達（±s）

注：與正常組比較，$$P ＜0.01；與假手術組比較，**P ＜0.01；與模型組比較，##P ＜0.01。

組別正常組假手術組模型組涼血通瘀組n6 6 6 6 TLR4 mRNA 1.000±0.000 1.242±0.466 2.242±0.481$$**1.495±0.235##

4 討論

腦出血屬“中風”范疇。卒中后便秘發(fā)生率達29%～76%，腦出血更為常見［8-9］。大腸具傳導水谷糟粕之功，如果大腸傳導失司，陽明熱盛，導致熱邪與腸內燥屎相結，則濁氣上擾，引發(fā)神志癥狀。周老認為本病的主要病機系瘀熱，并據(jù)此創(chuàng)立涼血通瘀方，以涼血化瘀、通腑泄熱為效［10-11］。組方以大黃通腑瀉熱化瘀、水牛角涼血清熱，兩藥合用重在涼血通瘀；生地黃涼血清熱，佐以赤芍、牡丹皮，加強涼血活血散瘀之功效；石菖蒲豁痰開竅，引藥上行。本方重在瀉熱通瘀，順調氣血，給邪以出路，達到以腸治腦之功效。

TLR4/NF-κB 是腦出血損傷后重要的炎癥信號通路，NF-κB是炎癥信號通路的關鍵調控靶點，腦出血發(fā)生后迅即出現(xiàn)NF-κB活化［12］，誘導炎性細胞因子表達，參與炎癥反應；炎性細胞因子又是NF-κB的激活物，所以當NF-κB激活引起炎癥反應，則會產生級聯(lián)放大炎癥反應，加重腦損害［13］。TLR4是關鍵跨膜蛋白，將細胞外抗原識別系統(tǒng)向細胞內傳遞并引發(fā)炎癥反應［14］。PEREZPARDO P［15］提示TLR4介導的炎性損傷在神經系統(tǒng)疾病的腦腸炎癥反應中發(fā)揮重要作用。TLR4信號傳導可通過下游因子激活NF-κB信號通路，啟動與免疫和炎癥反應相關的基因轉錄，以誘導炎癥因子表達［16］，從而放大炎癥效應，參與腦出血引發(fā)的繼發(fā)性炎性損傷［17］。

TLR4的升高導致腦出血預后不容樂觀，下降則有助于改善腦出血的預后［18］。本研究結果顯示，涼血通瘀方干預后腦出血大鼠的TLR4、NF-κB蛋白表達及TLR4 mRNA表達降低，證實涼血通瘀方可抑制TLR4和NF-κB表達，從而證明涼血通瘀方有助于減輕腦炎癥損傷，使腦出血的預后得以改善。鑒于中藥復方的作用靶點多，本實驗研究僅在蛋白、基因水平證實涼血通瘀方抑制TLR4/NF-κB信號通路以減輕腦損害，尚有待進一步進行更深入的研究。