劉曉晨，楊光*，楊波，周盛敏

1(上海理工大學 醫(yī)療器械與食品學院，上海，200093)2(豐益(上海)生物技術研發(fā)中心有限公司，上海，200137)

硒在自然界中有無機硒與有機硒2種存在形態(tài)。無機硒主要包括硒酸鹽、亞硒酸鹽、單質硒、硒化物等物質[1]，而在植物體內，硒會以硒氨基酸、甲基硒代半胱氨酸等有機硒化合物的形式存在。硒可以充當各種酶的輔助因子，例如，谷胱甘肽過氧化物酶，超氧化物歧化酶和過氧化氫酶，進而可以保護細胞免受自由基和脂過氧化物引發(fā)的損害[2]，所以，它可以通過減少H2O2和脂質氫過氧化物來對抗細胞內的氧化應激，從而保護人體免受有害自由基的傷害。硒還充當三碘甲腺氨酸脫碘酶的輔因子，三碘甲腺氨酸脫碘酶是一種參與甲狀腺激素代謝的重要酶，可以預防甲狀腺腫[3]。

目前，對植物富硒采用亞硒酸鈉的方法比較常見，植物吸收亞硒酸鈉后，通過與谷胱甘肽的反應，首先形成富硒氧化型谷光甘肽(GS-Se-SG)中間產物，再經過一系列的反應轉化為硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸[4]，這個過程是植物將無機硒轉化成有機硒的過程。在植物富硒的過程中，亞硒酸鈉與谷胱甘肽反應的同時伴隨著自由基的產生，這將對植物造成一定的氧化應激壓力，這時，植物也可能產生一些次生代謝產物，例如：多酚，來應對這種環(huán)境的變化，所以，無論是作為幾種關鍵抗氧化劑的組成成分來減少活性氧代謝物以抵抗氧化應激還是刺激機體的抗氧化系統和苯丙烷代謝等復雜的信號傳導途徑來增加次生代謝產物的含量，總之，硒具有抵御自由基的作用。此外，眾所周知，芽是所有食物中最有營養(yǎng)的食物之一，提供豐富的蛋白質、碳水化合物、纖維、礦物質和維生素，最重要的是，芽也是硒的蓄積劑[5]，可以從不同的無機來源積累硒。本文將亞麻籽在富集不同濃度的亞硒酸鈉溶液光照萌發(fā)3 d后，冷榨成亞麻籽油,探究硒元素對油中脂質伴隨物的含量及抗氧化活性變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

亞麻籽，產地哈薩克；石油醚(30～60 ℃)、異丙醇、冰醋酸、三氯甲烷、碘化鉀、福林酚試劑、二氯甲烷、無水甲醇、無水乙醇、正己烷、無水碳酸鈉、異辛烷、硫酸氫鈉、乙酸乙酯、無水乙醚、無水硫酸鈉、苯乙醇標品、沒食子酸標品(純度≥90 %)，上海國藥集團；DPPH、α-生育酚標品、γ-生育酚標品(純度≥99%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈(色譜純)、異丙醇(色譜純)、弗羅里土SPE小柱(1 g/6mL)、亞硒酸鈉(純度≥99%)，上海泰坦科技股份有限公司；硅烷化試劑(純度≥99%)，上海麥克林生化科技有限公司；β-膽甾烷醇(純度≥99 %)，西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；二醇基固相萃取柱(500 mg/3mL)，上海安譜實驗科技股份有限公司；環(huán)肽混標，暨南大學提供。

1.2 儀器與設備

FX7螺旋壓榨機，廣州旭眾食品機械有限公司；FD115烘箱，上海智鳶機電設備有限公司；1800紫外分光光度計，日本島津公司；臺式高速冷凍離心機，德國艾本德股份公司；全自動脂肪提取儀，美國ANKOM公司；Agilent 7890 配FID檢測器和自動進樣器、液相色譜儀1200，安捷倫科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 富硒萌發(fā)的亞麻籽油的制備

每盤取大約25 g亞麻籽(共20盤，每個濃度下萌發(fā)5盤)，挑揀出壞的、不完整的種子，用1%(體積分數)次氯酸鈉消毒5 min，沖洗干凈，在常溫下，分別用0、0.2、1、5 mmol/L的亞硒酸鈉溶液浸泡4 h后，在流動的水中反復沖洗3遍，在發(fā)芽盤中盛1 000 g水，網盤格上平鋪一層濕潤紗布，將亞麻籽平鋪在紗布上面薄薄的一層，水不沒過亞麻籽，放置在(23±3)℃的恒溫室內，種子需在植物生長燈(PHILIPS GreenPower TLED DR/W 紅光/白光，光照距離：50 cm，光照強度：24 μmol/s)下生長，光周期是黑暗8 h，光照16 h，1 d噴4～5次水，使種子保持濕潤，每天重新換水，以防止長菌，在第3天取樣，55 ℃烘干，冷壓榨出亞麻籽油，6 000 r/min離心6 min，濾紙過濾，貯藏在-18 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 理化指標的測定

含油率測定：參照GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》[6]；水分的測定：參照 GB 5009.3—2016《動植物油脂 水分及揮發(fā)物的測定》[7]；根長測定：隨機選取10根萌發(fā)亞麻籽用直尺測量根長；酸價的測定：參照 GB 5009.229—2016《食品中酸價的測定》[8]；過氧化值的測定：參照 GB 5009.227—2016《食品中過氧化值的測定》[9]；脂肪酸測定：參照 GB 5009.168—2016 《食品中脂肪酸的測定》[10]；反式脂肪酸測定：參照 GB 5009.257—2016 《食品中反式脂肪酸的測定》[11]。

1.3.3 典型脂質伴隨物含量的測定

生育酚的測定：參照 GB/T 26635—2011《動植物油脂生育酚及生育三烯酚含量測定高效液相色譜法》[12]；多酚的測定：參照 LST 6119—2017《植物油中多酚的測定》[13]；沒食子酸標準曲線：y=0.010 3x+0.021 9，R2=0.999 9。甾醇的測定：參照 NY/T 3111—2017《植物油中的甾醇測定》[14]。類胡蘿卜素的測定，參照易志[15]的方法進行測定。

1.3.4 油脂的體外抗氧化活性的測定

采用王屋梁等[16]的方法測定亞麻籽油中的全油DPPH自由基清除能力。

1.3.5 亞麻籽油中環(huán)肽的測定

配制溶液：上樣液：V(正已烷)∶V(乙醚)=85∶15；洗滌液：V(正已烷)∶V(乙醚)=70∶30；洗脫液：V(異丙醇)∶V(甲醇)=60∶40。

稱取1.0 g的毛亞麻籽油樣品，加入5 mL的上樣液溶解為樣品溶液。取一支弗羅里土SPE小柱(1 g/6mL)，先用上樣液洗滌2次并完全浸潤。在吸取全部樣品溶液后，注入硅膠SPE小柱，棄去流出液，重復2次，最后吸取8 mL的洗脫液洗脫SPE小柱，并收集流出液于10 mL的容量瓶內，吹干，用異丙醇定容，最后將樣品溶液用0.45 μm的尼龍濾膜過濾后，上液相色譜檢測。

色譜條件：Diamonsil C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm), 配置雙元泵和自動進樣器。兩通連接，柱溫35 ℃,柱壓：103 Pa,進樣體積為 20 μL，流動相分別為乙腈和水，梯度洗脫程序見表1。

表1 HPLC洗脫梯度Table 1 HPLC gradient elution

1.3.6 數據統計分析

本實驗所有指標均設3組重復，采用 SPSS 19.0 軟件進行統計學分析，用 Duncan 法對結果進行顯著性分析，P<0.05 時表示存在顯著性差異，運用 Origin 8.5 軟件作圖，數據結果均以平均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

2.1 亞麻籽中根長、含水率、含油率的變化

為研究不同濃度亞硒酸鈉溶液對萌發(fā)亞麻籽的根長、含油率，含水率的影響，進行光照萌發(fā)處理，由表2可以看出，低濃度的硒溶液會促進亞麻籽根長的伸長，而高濃度的硒溶液會抑制亞麻籽根長的伸長，推測原因是：在種子萌發(fā)初始階段——吸漲階段，硒酸鹽通過種皮和糊粉層進入種子內部，并通過種子間隙滲入胚乳和胚的細胞，被亞麻籽吸收利用，但過高濃度硒化合物有細胞毒性，并表現出劑量高度相關的生物毒性反應。所以，高濃度的硒溶液浸泡會抑制根的伸長[17]，適當的硒溶液會稍微促進亞麻籽的吸水，但對種子中的含油率沒有顯著性影響。

表2 亞麻籽中的根長、含水率、含油率Table 2 The moisture, crude fat and length of flaxseed

2.2 亞麻籽油中酸價、過氧化值的變化

酸價、過氧化值是評價油脂的重要指標。從表3中可以看出，隨著硒溶液濃度的增加，酸價呈現是先升高后降低的趨勢，與GUARDADO-FéLIX等[18]研究富硒鷹嘴豆油的趨勢一致，未富硒的亞麻籽油酸價為6.63 mg KOH/g，在0.2 mmol/L時，增加到7.75 mg KOH/g，該指標與游離脂肪酸含量有關，油中酸價的增加表明甘油三酯的水解，這是由于脂肪酶A1和A2活性的增加，這些酶的合成可為幼苗發(fā)育提供能量[19]，此外，油中的過氧化值則是呈現持續(xù)上升的趨勢。

表3 亞麻籽油中的酸價、過氧化值Table 3 The acid value、peroxide value of flaxseed oil

2.3 亞麻籽油中脂肪酸、反式脂肪酸的變化

為研究不同濃度的亞硒酸鈉溶液處理對萌發(fā)的亞麻籽油中的脂肪酸、反式脂肪酸變化的影響，進行氣相色譜分析，從表4中可以看出，脂肪酸譜顯示出大量的不飽和脂肪酸，主要是亞麻酸，其次是油酸和亞油酸，并且不同濃度的硒溶液不會對亞麻籽油中的脂肪酸的種類和含量、反式脂肪酸產生影響，該結果與BUSINELLI等[20]研究富硒初榨橄欖油的結果一致。

表4 亞麻籽油中脂肪酸、反式脂肪酸含量 單位：%

2.4 亞麻籽油中多酚含量的變化

植物酚類化合物在形成的過程中，赤鮮糖-4-磷酸與磷酸烯醇丙酮酸結合形成苯丙氨酸。苯丙氨酸解氨酶催化苯丙氨酸轉化為反式肉桂酸和其他一些酚類化合物，如黃酮類、香豆素類、可水解單寧、單甘醇和木脂素[21]。

從圖1中可以看出富硒萌發(fā)會促進亞麻籽油中多酚含量的增加，添加濃度為0.2 mmol/L時差異顯著，多酚含量增加了約為20.69 mg/kg，與未富硒的亞麻籽油相比增加了約為56.37%，但隨著硒溶液濃度的增大，多酚含量卻沒有明顯增加，可見0.2 mmol/L為最佳富硒濃度，GUARDADO-FéLIX等[18]在研究硒對發(fā)芽的鷹嘴豆影響時發(fā)現，與不含硒萌發(fā)的鷹嘴豆油相比，含硒萌發(fā)的鷹嘴豆油中的酚類物質增加了36%。BUSINELLI等[20]同樣也發(fā)現，用含硒肥料進行施肥要比不含硒的多酚含量更高一些，而且該研究也證實了硒在減輕干旱脅迫條件下的危害方面具有積極作用。

圖1 亞麻籽油中的多酚含量Fig.1 Polyphenol content of flaxseed oil注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.5 亞麻籽油中類胡蘿卜素含量的變化

類胡蘿卜素是四萜類化合物，其特征是具有離域π電子的雙鍵共軛系統。由于極度疏水，這些化合物通常存在于膜或其他疏水部位，在這些部位，其被認為起到抗氧化劑的作用，并在保護組織免受光和氧損傷等方面發(fā)揮特殊作用[24]。

種子中含有豐富的類胡蘿卜素，是良好的維生素A的來源，種子萌發(fā)可以很好的富集類胡蘿卜素，但類胡蘿卜素的攝入并不等于吸收。人體對蔬菜中的類胡蘿卜素的吸收率變化很大(2%～50%)[25]。當單純攝入蔬菜時，類胡蘿卜素的吸收率很差。因為類胡蘿卜素是脂溶性維生素，所以，食用油可對類胡蘿卜素的吸收起到顯著的協同促進作用。

從圖2中可以看出，富硒萌發(fā)的亞麻籽油可以顯著增加類胡蘿卜素含量，與未富硒的亞麻籽油相比，在濃度為0.2 mmol/L的富硒萌發(fā)亞麻籽油中，類胡蘿卜素含量達到了128.78 mg/kg，與未富硒相比，增加約36 mg/kg，但隨著硒濃度的增加，類胡蘿卜素的含量有所下降，說明，低濃度硒溶液會促進亞麻籽油中類胡蘿卜含量的升高?？傊庹彰劝l(fā)與富硒會共同促進亞麻油中類胡蘿卜素生成。BUSINELLI等[20]也發(fā)現，富硒橄欖油中的葉綠素、類胡蘿卜素含量都有所增加。原因可能為硒處理橄欖樹會增加橄欖樹的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性，進而有效清除ROS，避免類胡蘿卜素等色素被破壞[26]。

圖2 亞麻籽油中的類胡蘿卜素含量Fig.2 Carotenoids content of flaxseed oil

2.6 亞麻籽油中生育酚含量的變化

生育酚是天然抗氧化劑，生育酚在一定程度上可以使α-亞麻酸和亞麻籽油中的自由基轉變?yōu)榉腔钚曰蜉^為穩(wěn)定的化合物，終止自動氧化反應，使油脂的氧化減少，同時也是一種強有效的自由基清除劑，具有延緩衰老和抗氧化的作用[27]。此外，α-生育酚可以對植物中的抗氧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶起到促進作用。硒(作為谷胱甘肽過氧化物酶的輔助因子)和生育酚在功能上與其他營養(yǎng)抗氧化劑(如抗壞血酸、類胡蘿卜素和含硫氨基酸)相互促進，以保護細胞免受ROS的影響[28]。

從圖3中可以看出，隨著硒溶液濃度的增加，α-生育酚濃度、總生育酚含量呈現先上升后下降的趨勢，因為生育酚和硒都具有抗氧化作用，在一定條件下，生育酚可替代部分硒的作用，硒對植物體具有節(jié)省生育酚的效能，但不能完全替代生育酚。根據實驗結果得出，硒與生育酚只是在功能上協同促進，但硒并不能促進生育酚的合成[29]。PEDRERO等[30]也發(fā)現類似的現象，植物中的α-生育酚含量隨著硒添加量的增加而增加，并且當植物在富含鎘的培養(yǎng)基上生長時，葉片中的總生育酚含量會降低，但是在硒同時加入時，可以抵消40%生育酚含量的減少。

圖3 亞麻籽油中的α-生育酚、γ-生育酚及總生育酚Fig.3 Changes in tocopherol compositions (α-, γ- and total tocopherol) of flaxseed oil

2.7 亞麻籽油中環(huán)肽相對含量的變化

亞麻環(huán)肽含有8、9或10個氨基酸殘基，環(huán)肽是一類存在于多個植物家族中的環(huán)狀肽，具有缺乏二硫鍵交聯的N—C連接環(huán)狀結構[31]。亞麻環(huán)肽目前有20種，其有共同氨基酸序列，且會隨蛋氨酸殘基的氧化其而變化，因為蛋氨酸(Met)可以氧化為蛋氨酸S-氧化物(MetO)，而蛋氨酸S-氧化物可以進一步氧化為蛋氨酸S，S-二氧化物(MetO2)。

在新鮮的亞麻籽中，還原型Met亞麻環(huán)肽含量較高(環(huán)肽A)，這類環(huán)肽在貯藏和加工條件下很容易被氧化，比如，經過萌發(fā)后含量會急劇降低，環(huán)肽E則是Met的氧化產物MetO，含量會有所上升，環(huán)肽F、G、M則是MetO2，這些含MetO2的肽具有比Met和MetO親本更高的熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性[32]。

以0.01 μL/mL苯乙醇為內標物，為了顯示趨勢，同時擴大了100 000倍，進行相對定量分析，從圖4中可以看出，環(huán)肽E是隨著硒溶液濃度的增加而增加，環(huán)肽A隨著硒溶液濃度增加而降低，濃度為0.2、1 mmol/L的富硒亞麻籽油中環(huán)肽B含量稍有降低，5 mmol/L的富硒亞麻籽油環(huán)肽G、M含量稍有升高。說明，硒溶液處理可能會加速氧化亞麻籽油，形成更加穩(wěn)定的環(huán)肽MetO、MetO2。

圖4 亞麻籽油中的環(huán)肽相對含量Fig.4 Relative content of cyclic peptides in flaxseed oil

2.8 亞麻籽油中DPPH自由基清除率的變化

硒在飲食中是必需的微量元素，其與Cys和Met結合形成硒代半胱氨酸和硒蛋氨酸，硒代蛋氨酸與蛋白質結合形成硒蛋白。硒蛋白包括谷胱甘肽過氧化物酶和硫氧還蛋白還原酶等抗氧化酶，這些酶可以提高種子的抗氧化性[33]。此外，LI等[33]發(fā)現，與普通糙米相比，硒化糙米芽在不同溫度下貯藏9個月，可以保持較高的品質和氧化穩(wěn)定性,這種顯著差異歸因于硒的抗氧化活性及其對脂質過氧化的抑制作用。

從圖5中可以看出，富硒萌發(fā)的亞麻籽油能夠增加亞麻籽油的抗氧化性，而且在硒濃度為0.2、1 mmol/L時，抗氧化性優(yōu)于未富硒亞麻籽油，與未富硒的亞麻籽油相比，硒濃度為0.2 mmol/L時，抗氧化性增加15.44%，可見富集低濃度的硒可以提高亞麻籽油的抗氧化作用。GUARDADO-FéLIX等[34]發(fā)現，與不含亞硒酸鈉的鷹嘴豆芽菜相比，含硒的抗氧化能力提高了26%。

圖5 亞麻籽油的DPPH自由基清除率Fig.5 DPPH free radical scavenging rate of flaxseed oil

總體來說，富硒可以增加亞麻籽油中的有益脂質伴隨物含量，但同時也會導致亞麻籽油發(fā)生一定程度氧化酸敗，油脂后續(xù)步驟中的負壓精煉，不僅可以降低油中酸價，還可以進一步緩解有益脂質伴隨物在油中的損失，以及縮短精煉的時間等都具有一定緩解多酚等脂質伴隨物質的損失[35]?？傊?，整體來看，富硒處理亞麻籽油是利大于弊的。

3 結論

富硒對萌發(fā)亞麻籽油中脂質伴隨物的含量有一定影響，最佳的處理硒濃度為0.2 mmol/L，多酚含量增加20.69 mg/kg，相應的抗氧化活性增加15.44%，類胡蘿卜素含量大幅度增加，達到128.78 mg/kg，α-生育酚含量達到637.3 mg/kg，硒與生育酚在功能上具有協同促進作用。綜上，低濃度的硒溶液處理可以提高亞麻籽油中脂質伴隨物含量。