梁嬋華，王可盈，曹文瀞，羅高，何雯，曾榛,3*，宋家樂,4*

（1.桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西桂林 541101）（2.桂林醫(yī)學(xué)院學(xué)生工作(部)處，廣西桂林 541101）（3.中南大學(xué)湘雅公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南長沙 410000）（4.桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院臨床營養(yǎng)科，廣西桂林 541109）

肥胖是由于機體長期處于能量攝入與消耗失衡狀態(tài)而引起的一種慢性代謝性疾病[1]，主要以體內(nèi)脂肪積聚過多所致脂肪層過厚和脂肪積蓄過剩為特征[2]。隨著我國經(jīng)濟發(fā)展和居民生活水平的不斷提高，西方飲食文化（高脂肪、高熱量飲食模式）對中國傳統(tǒng)飲食文化沖擊所造成的飲食行為改變和結(jié)構(gòu)不均衡，以及不良生活習(xí)慣、環(huán)境和遺傳等因素[3]，使得肥胖成為中國乃至全球日益矚目的公共健康問題之一。高脂飲食（High fat diet，HFD）誘導(dǎo)的肥胖不僅會引起機體氧化應(yīng)激、炎癥和腸道菌群失調(diào)[4]，從而導(dǎo)致代謝綜合征的發(fā)生，增加心血管疾病、胰島素抵抗、糖尿病、非酒精性脂肪肝病、癌癥，甚至哮喘的發(fā)病風(fēng)險[5-7]，而且還影響著社會與經(jīng)濟發(fā)展。目前，全球的成人肥胖發(fā)生率約為13%[8]。此外，兒童超重與肥胖的發(fā)生率也迅速增加，2016 年全球5～19 歲超重或肥胖的兒童已超過3.4 億人[9]。因此，尋找有效預(yù)防和治療肥胖的方法迫在眉睫。

芥子酸（Sinapic acid，SA）是廣泛分布于水果、蔬菜、油料作物和谷物中的一類具有較強生物活性的天然酚酸類化合物，屬于羥基肉桂酸的一種[10]。研究發(fā)現(xiàn)，其在菜籽、紫山藥、檸檬、柑橘類等蔬果植物中含量很高[11,12]。近年來的研究結(jié)果也提示，芥子酸具有抗結(jié)腸炎[13,14]、抗氧化[15]、抗癌[16]、促進脂肪分解[17]以及調(diào)控游離脂肪酸、磷脂、三酰甘油和氧磷脂等脂類間的轉(zhuǎn)化代謝[14]等生理作用。

敘利亞黃金倉鼠具有與人類相似的脂類代謝通路，是目前較為公認的用于代謝綜合征研究的動物模型之一[18]。目前，芥子酸對高脂肪膳食模式下倉鼠脂類代謝影響及其作用機制的報道較少。因此，本研究以膳食高脂肪飼料（60%脂肪供能）誘導(dǎo)的敘利亞黃金倉鼠建立肥胖模型，同時觀察實驗飼料（高脂飼料中添加0.03%芥子酸）對高脂膳食模式下倉鼠體重改善、脂質(zhì)代謝及氧化應(yīng)激發(fā)生的影響效果，從而探討芥子酸抗肥胖的作用機制，為進一步將芥子酸開發(fā)成為更安全、更有效的抗肥胖膳食補充劑提供一定的科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芥子酸（純度大于98%，S106903），購自上海阿拉丁生物科技有限公司；AIN-93G 普通飼料、對照組高脂飼料（60%脂肪供能）、實驗組高脂飼料（含60%脂肪，0.03%芥子酸），購于常州鼠一鼠二生物科技有限公司；總膽固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（High-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、游離脂肪酸（Nonesterified free fatty acid，NEFA）、丙二醛（Malonic dialdehyde，MDA）、總抗氧化能力（Total antioxidation capability，T-AOC）試劑盒，南京建成生物技術(shù)有限公司；BCA 蛋白濃度試劑盒，肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1（CPT-1）、過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）、膽固醇7α-羥化酶（CYP7A1）、羥甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶（HMGCR）、乙酰輔酶A 羧化酶1（ACC1）抗體，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；脂肪酸合成酶（FAS），武漢塞維爾生物科技有限公司；膽固醇合成轉(zhuǎn)錄因子SREBP2，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004 電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；Eppendorf 5424R 型冷凍離心機，德國Eppendorf公司；ELx808 酶標儀，美國BioTek 公司；FluorChem M 超靈敏全自動化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)，美國Protein Simple 公司；KZ-II 高速組織研磨儀，武漢塞維爾生物科技有限公司。

1.3 實驗動物

雄性敘利亞黃金倉鼠（共21 只，體重110～140 g）購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院SPF 級動物房（許可證號：SYXK(桂)2020-0005）。飼養(yǎng)環(huán)境為標準光照/黑暗（12 h/12 h）循環(huán)飼養(yǎng)，自由攝食及清潔飲水。

1.4 實驗方法

1.4.1 高脂模型建立及實驗分組方法

所有倉鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，依照完全隨機數(shù)字表法分為3 組（7 只/組）進行后續(xù)研究。倉鼠高脂肥胖模型以Dan 等[19]的文獻進行操作。其中，正常組飼喂標準飼料、模型組飼喂高脂飼料、芥子酸組飼喂實驗高脂飼料（含0.03%芥子酸）?？倢嶒炛芷跒?2 周，每3 d 進行體質(zhì)量監(jiān)測，每日進行飲水量和攝食量的監(jiān)測。本動物實驗方案已通過桂林醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會審查批準（GLMC-201806003）。

1.4.2 組織取材

實驗第12 周干預(yù)結(jié)束后，各組倉鼠禁食不禁水12 h，予腹腔注射1%戊巴比妥鈉（0.1 mL/10 g）麻醉，腹主動脈取血，常溫下分離血清后存放與-80℃冰箱。倉鼠置于冰上開腹后，快速分離倉鼠附睪、腎周、腹股溝等出脂肪組織及肝臟組織并迅速放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

或疑月中有兔形，……予以為月無光，而溯日為明，世所知也。天有十二辰，列于東方者。有神司其位。日出在東，其對在酉，酉為雞，日光含景，則雞在日中。及運而西。則對在卯，卯為兔，月光含景，則兔在月中。月有兔形，何足異哉？人知日中為烏，而不知為雞。知月中有兔，不知兔自日以傳形也?；蛟欢纬墒窖栽轮杏泄穑扇藚莿傢狡涓?。曰：不然，日行于西，與扶桑對，則陊景日中，月望之明，景亦隨之。[注](明)周嬰：《巵林》，新文豐出版社，1984年，第98-99頁。

1.4.3 血清生化指標檢測

按照各試劑盒檢測操作要求，分別檢測血清中TG、TC、LDL-c、HDL-c、NEFA 的濃度。

1.4.4 肝臟內(nèi)TC 與TG 水平分析

稱取一定質(zhì)量的肝臟組織，冰生理鹽水去除血污后，加入2 mL 的無水乙醇與丙酮（V/V，1:1）混合液，冰上制備10%的肝組織勻漿。經(jīng)3000 r/min 離心15 min 后，取上清液用試劑盒檢測TC、TG 的濃度。

1.4.5 血清和肝臟組織中T-AOC和MDA水平檢測

取凍存的血清和肝臟組織勻漿液，嚴格按照試劑盒說明操作，分別檢測血清中及肝臟中MDA 和T-AOC 的含量水平。

1.4.6 糞便中TC 的檢測

1.4.7 Western Bolt 法檢測肝臟組織中相關(guān)蛋白的表達水平

稱取一定質(zhì)量肝臟組織（20～35 mg），冰生理鹽水清洗血污，按比例加入蛋白裂解液（含PMSF）提取組織總蛋白，12000 r/min，4℃條件下離心10 min，收集上清采用BCA 法測定蛋白濃度。配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）膠，加樣后調(diào)整電壓，濃縮膠80 V，分離膠120 V，電泳120 min。濕法轉(zhuǎn)膜，條件為恒定電流240 mA。轉(zhuǎn)膜1 h 后，將NC 膜放于5%的脫脂奶粉中封閉4 h。孵育一抗過夜，TBST 洗膜后，孵育二抗1 h，TBST 洗膜3 次后，加入特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑，自動化學(xué)發(fā)光成像儀檢測相關(guān)蛋白的表達情況。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有實驗均重復(fù)3 次，結(jié)果以均值（means）±標準偏差(SD)表示。所得實驗數(shù)據(jù)運用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析與統(tǒng)計處理，p<0.05 為具有統(tǒng)計差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 芥子酸對高脂飲食誘導(dǎo)的倉鼠體質(zhì)量和器官質(zhì)量的影響

由表1 可知，正常組、高脂肪組及芥子酸組的初始體重均無顯著性差異（p>0.05）。喂養(yǎng)12 周后，與正常組相比，高脂肪組倉鼠最終體重增加1.77 倍（p<0.05）。芥子酸處理組倉鼠最終體重和體重增加量均顯著低于高脂肪組（p<0.05），分別減少了11.15%和23.86%。結(jié)果表明，芥子酸有顯著下調(diào)倉鼠體重的作用。但Chen 等[3]的研究結(jié)果也提示，給予芥子酸干預(yù)并不能夠改善高脂飼料（45%脂肪供能）喂養(yǎng)后大鼠體重的增加。

表1 芥子酸對飼喂高脂飲食后倉鼠體重的影響 Table 1 Effects of sinapic aicdon body weight in high fat diet fed hamsters

如圖1 所示，相比正常組，高脂肪組倉鼠的肝臟、附睪脂肪和腹股溝脂肪組織的重量極顯著增加（p<0.01）。而飼喂高脂肪飼料雖較正常組能夠促進倉鼠腎周脂肪的堆積（即腎周脂肪臟器指數(shù)增加趨勢），但兩者相比無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）。與高脂肪組相比，芥子酸干預(yù)對倉鼠肝臟、附睪脂肪、腎周脂肪和腹股溝脂肪的臟器指數(shù)分別減少13.05%、20.38%、27.91%和12.24%。這一結(jié)果提示，芥子酸可能通過緩解脂肪組織堆積抑制高脂飲食誘導(dǎo)的倉鼠體重的增加。另外，芥子酸組對正常組附睪脂肪和腎周脂肪組織的重量均無顯著性影響（p>0.05）。

圖1 芥子酸對飼喂高脂飲食后倉鼠肝臟與各脂肪的臟器指數(shù)的影響 Fig.1 Effects of sinapic aicdon liver and obesity tissue index in high fat diet fed hamsters

2.2 芥子酸對飼喂高脂飲食后倉鼠血清脂代謝水平的影響

從圖2 可知，與正常組相比，高脂肪組倉鼠血清中TG、TC、LDL-c 和NEFA 水平顯著增加（p<0.05），而HDL-c 水平降低，但無統(tǒng)計顯著差異（p>0.05）。與高脂模型組相比，芥子酸干預(yù)能夠顯著降低高脂肪膳食所引發(fā)的倉鼠血清中TC、TG、NEFA 和LDL-c的水平（p<0.05），分別減少了36.54%、26.54%、44.13%和72.40%，而HDL-c 水平則升高了1.25 倍。Chen 等[3]研究提示，芥子酸干預(yù)能夠有效降低肥胖大鼠血清TG 水平，同時提升HDL-c 水平。同時，Wu 等[13]的研究也提示芥子酸干預(yù)能夠減少高脂飲食下C57BL/6J 背景的ApoE?/?小鼠血清游離脂肪酸和總TG 水平。而相比正常組，芥子酸干預(yù)能夠顯著降低倉鼠血清LDL-c 的水平至48.74%（p<0.01），HDL-c增加1.17 倍（p<0.01），而對TG 和TC 的水平無明顯改變。

圖2 芥子酸對飼喂高脂飲食后倉鼠血清脂代謝水平的影響 Fig.2 Effects of sinapic aicdon serum lipid level in high fat diet fed hamsters

2.3 芥子酸對飼喂高脂飲食后倉鼠肝臟脂代謝水平的影響

如圖3 所示，高脂膳食能夠顯著誘發(fā)倉鼠肝臟TG和TC 水平升高。與正常組相比，高脂膳食組倉鼠肝臟中TG 和TC 水平分別升高了約1.90 和1.47 倍。而芥子酸干預(yù)卻能降低肝臟中TG 和TC 的水平。與高脂膳食組相比，芥子酸組的肝臟TC 水平降低了34.58%（p<0.05），TG 水平降低了28.19%，但無顯著性差異（p>0.05）。然而，肝臟TC 與TG 水平在正常組和芥子酸組之間沒有顯著差異。

圖3 芥子酸對飼喂高脂飲食后倉鼠肝臟中TG、TC 水平的影響 Fig.3 Effects of sinapic aicdon hepatic TG and TC level in high fat diet fed hamsters

2.4 芥子酸對飼喂高脂飲食后倉鼠糞便中TC水平的影響

糞便排出的膽固醇含量與血脂水平有密切關(guān)系，當機體脂代謝紊亂時其會大幅度下調(diào)[19]。由圖4 可知，芥子酸干預(yù)組糞便中TC 含量（1650.00 μmol/L）顯著高于正常組（1177.50 μmol/L）和高脂膳食組（920.00 μmol/L）（p<0.05），這可能是由于芥子酸干預(yù)后，降低機體對膽固醇的吸收，并加速膽固醇的代謝，從而促使膽固醇排出體外，該結(jié)果與芥子酸干預(yù)后的倉鼠外周血脂水平變化相一致。

圖4 芥子酸對飼喂高脂飲食后倉鼠糞便中TC 水平的影響 Fig.4 Effects of sinapic aicdon fecal TC level in high fat diet fed hamsters

2.5 芥子酸對飼喂高脂飲食后倉鼠血清和肝臟氧化應(yīng)激水平的影響

在脂肪堆積的同時氧化應(yīng)激反應(yīng)的升高是肥胖等相關(guān)代謝綜合征的重要致病機制[21]。MDA 是生物膜多不飽和脂肪酸過氧化過程中產(chǎn)生的一種主要反應(yīng)醛類物質(zhì)，其水平的高低通?？梢苑从硻C體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度的強弱[22,23]。由表2 可知，12 周的高脂飲食導(dǎo)致血清和肝臟中氧化應(yīng)激的發(fā)展，高脂膳食組倉鼠的MDA 水平顯著高于正常組（p<0.05）。芥子酸干預(yù)后，血清和肝臟組織中MDA 水平分別降低10.18%和16.23%，但均無顯著差異（p>0.05）。芥子酸對血清T-AOC 水平有改善作用，但對肝臟組織內(nèi)T-AOC 水平無明顯影響，這一實驗結(jié)果與Chen 等[3]的研究結(jié)果較為接近。上述結(jié)果提示芥子酸可能具有緩解脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的作用，從而糾正脂代謝紊亂。

表2 芥子酸對飼喂高脂飲食后倉鼠血清和肝臟氧化應(yīng)激水平的影響 Table 2 Effects of sinapic aicdon serum and liver oxidative stress level in high fat diet fed hamsters

2.5 芥子酸對飼喂高脂飲食后倉鼠肝臟脂肪酸合成的影響

FAS 和ACC1 是合成脂肪酸的關(guān)鍵酶，其蛋白水平的高低可間接反映肝臟組織脂肪的合成情況[24,25]。異常活化的FAS 和ACC1 可破壞脂代謝平衡，使得體內(nèi)脂肪合成速度快于脂肪分解，從而誘導(dǎo)脂肪的過度堆積，加速肥胖發(fā)生的進程[26,27]。高脂飲食喂養(yǎng)能夠顯著上調(diào)倉鼠肝臟組織中FAS和ACC1的蛋白表達水平（圖5）。與正常組相比，高脂膳食組倉鼠肝臟中FAS 表達水平上升約6.17 倍，ACC1 表達水平升高2.35 倍。而經(jīng)芥子酸干預(yù)后，相比高脂肪膳食組，倉鼠肝臟中FAS 和ACC1 的蛋白表達水平分別下降34.38%和52.72%（p<0.05）。

圖5 芥子酸對飼喂高脂飲食后倉鼠肝臟中FAS 和ACC1 的蛋白表達影響 Fig.5 Effects of sinapic aicd on hepatic protein expression of FAS and ACC1 in high fat diet fed hamsters

2.6 芥子酸對喂高脂飲食后倉鼠肝臟脂肪酸β氧化的影響

PPAR-γ是核受體超家族成員，主要參與肝臟脂類代謝和脂肪細胞的合成、分化過程[28]。PPAR-γ和CPT-1 是控制脂肪酸β氧化的關(guān)鍵蛋白，其中CPT-1是脂肪酸β氧化的限速酶[29,30]。在本研究中，12 周高脂膳食導(dǎo)致倉鼠肝臟組織中PPAR-γ和CPT-1 蛋白水平均顯著低于正常組倉鼠，且兩種蛋白的表達水平分別較正常組降低了41.60%和31.87%（圖6）。與高脂組相比，芥子酸干預(yù)能上調(diào)倉鼠肝臟組織中PPAR-γ和CPT-1 的蛋白表達水平，分別增加了2.00 倍和2.61倍。而文獻報道指出，激活PPAR-γ和CPT-1 能夠促進脂肪細胞分化，減少脂肪細胞數(shù)量，控制脂質(zhì)過氧化水平，并利于調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[31,32]。

圖6 芥子酸對飼喂高脂飲食后倉鼠肝臟中PPAR-γ 和CPT-1 的蛋白表達影響 Fig.6 Effects of sinapic aicdon hepatic protein expression of PPAR-γ and CPT-1 in high fat diet fed hamsters.

2.7 芥子酸對喂高脂飲食后倉鼠肝臟膽固醇代謝的影響

SREBP2 主要參與機體內(nèi)膽固醇代謝過程，通過激活膽固醇合成途徑中多個因子的表達（如HMGCR）來調(diào)節(jié)膽固醇的生成、吸收、排泄等生理進程，過度活化的SREBP2 和HMGCR 在代謝綜合征病理生理過程中發(fā)揮著重要作用[33]。如圖7 所示，芥子酸處理顯著抑制高脂膳食所造成倉鼠肝臟中SREBP2（53.49%）和HMGCR（32.68%）的表達（p<0.05）。而與正常組相比，芥子酸干預(yù)后的肥胖倉鼠肝臟內(nèi)SREBP2 和HMGCR 蛋白表達的水平降低64.69%和45.46%（p<0.05）。CYP7A1 是膽固醇從體內(nèi)排出的重要轉(zhuǎn)運蛋白，促進肝臟內(nèi)膽固醇代謝正常運行[34]。與高脂膳食組倉鼠相比，芥子酸干預(yù)對肥胖倉鼠肝臟中CYP7A1 的蛋白水平顯著升高1.65 倍（p<0.05）。以上結(jié)果提示芥子酸能夠抑制膽固醇的合成，并通過促進膽固醇從體內(nèi)排出達到改善膽固醇代謝異常的作用。

圖7 芥子酸對飼喂高脂飲食后倉鼠肝臟中SREBP2、HMGCR 和CYP7A1 的蛋白表達影響 Fig.7 Effects of sinapic aicdon hepatic protein expression of SREBP2,HMGCR and CYP7A1 in high fat diet fed hamsters

3 結(jié)論

連續(xù)12 周的芥子酸干預(yù)能有效抑制高脂飲食所造成的倉鼠體重增加，減少其體內(nèi)脂肪組織的質(zhì)量；下調(diào)TG、TC、NEFA 和LDL-c 水平，同時升高HDL-c水平和糞便中TC 含量。芥子酸還能同時增強肝臟組織中PPAR-γ、CPT-1 和CYP7A1 的蛋白表達，并通過下調(diào)ACC1、FAS、HMGCR 及SREBP2 等脂質(zhì)代謝相關(guān)因子來控制脂肪合成與膽固醇代謝來調(diào)控肥胖發(fā)生進程中的脂類代謝異常。此外，芥子酸還能增強血清和肝臟組織中T-AOC 水平，降低血清與肝臟組織中MDA 水平，從而減緩脂質(zhì)氧化應(yīng)激的發(fā)生。綜上所述，芥子酸對高脂飲食引起的倉鼠肥胖和脂代謝異常有明顯的改善作用，該作用可能與抑制脂質(zhì)過氧化、減少脂肪合成和促進膽固醇代謝有關(guān)。