楊晉青，俞所銀，葛宇

（上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院，上海 200233）

噻蟲胺和氟啶蟲胺腈是新型煙堿類廣譜殺蟲劑，主要通過激活煙堿型乙酰膽堿受體，作用于昆蟲的神經(jīng)系統(tǒng)而表現(xiàn)出殺蟲活性[1,2]。由于作用機制新穎、應(yīng)用方式多樣化、防效優(yōu)良，高效、快速并且殘效期長，能有效防治對煙堿類、菊酯類，有機磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的吸汁類害蟲，故常被用于瓜果類蔬菜的害蟲防治，是害蟲綜合防治優(yōu)選藥劑。但不科學(xué)合理使用的現(xiàn)象比比皆是，如為達到短期防效盲目加大施藥量，施藥后沒有達到安全采收間隔期采收上市等，因此，農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留含量超標現(xiàn)象時有發(fā)生。GB 2763-2019《食品安全國家標準食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定了氟啶蟲胺腈在瓜類蔬菜中的最大殘留限量（MRLs）為0.5 mg/kg、尚未制定噻蟲胺在瓜類蔬菜中的最大殘留限量[3]。

目前噻蟲胺和氟啶蟲胺腈的檢測技術(shù)方面主要集中在液相色譜、氣相色譜和液質(zhì)聯(lián)用方面[4-7]。前處理技術(shù)主要包括乙腈勻漿提取-固相萃取柱凈化和乙腈勻漿提取-基質(zhì)分散萃取?，F(xiàn)行國家標準GB/T 20769-2008《水果和蔬菜中450 種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》包括了噻蟲胺，但不包括氟啶蟲胺腈；而且前處理方法需要勻漿提取、旋轉(zhuǎn)濃縮、固相萃取柱凈化、再次旋轉(zhuǎn)濃縮和氮氣吹干等多個步驟，存在過程復(fù)雜且耗時較長、結(jié)果重現(xiàn)性差和方法回收率低等問題，不利于大批量樣品的高效檢測。利用簡單的樣品前處理方法和成本較低的檢測手段獲得結(jié)果準確度高、數(shù)據(jù)重現(xiàn)性好和靈敏度高的檢測結(jié)果是目前農(nóng)藥殘留研究者的共同追求。“QuEChERS”方法作為一種基質(zhì)分散固相萃取凈化技術(shù)，由于具有快速，簡單，經(jīng)濟，有效，穩(wěn)定，安全的特點，正越來越普遍用于食品和農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥多殘留分析[8,9]。

南瓜含有大量的糖類物質(zhì)，另外還含有豐富的甾類及酚類化合物，樣品組成較為復(fù)雜?，F(xiàn)尚未見同時檢測南瓜中噻蟲嗪和氟啶蟲胺腈的方法報道。為了有效監(jiān)控南瓜中噻蟲胺和氟啶蟲胺腈兩種農(nóng)藥殘留的情況，研究建立高效準確、同時測定噻蟲嗪和氟啶蟲胺腈農(nóng)藥殘留的檢測方法，對于保障食品安全、進行農(nóng)藥安全性評價具有重要意義。本研究采用“QuEChERS”前處理技術(shù)，乙腈作為提取試劑，結(jié)合靈敏度高、分析時間短的LC-MS/MS 分析檢測手段，在選擇比較不同“QuEChERS”凈化包的基礎(chǔ)上，優(yōu)化并建立了噻蟲胺和氟啶蟲胺腈在南瓜中的殘留分析方法，為噻蟲胺和氟啶蟲胺腈在南瓜上的殘留檢測提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

乙腈，甲酸均為色譜純；氯化鈉（分析純），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；水為符合GB/T 6682 規(guī)定的一級水，Milli-Q Synthesis 超純水系統(tǒng)（密理博公司）制備。cleanert 萃取鹽包（內(nèi)含6 g 無水硫酸鎂（MgSO4）、1.5 g 醋酸鈉（NaAc）），天津博納艾杰爾有限公司；QuEChERS 分散固相萃取管A（15 mL 離心管中裝150 mg 乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）、900 mg MgSO4）、QuEChERS分散固相萃取管B（15 mL 離心管中裝400 mg PSA、400 mg 十八烷基鍵合相硅膠（C18）、1200 mg MgSO4），美國Agilent 公司；QuEChERS 分散固相萃取管C（2 mL 離心管中裝50 mg PSA、100 mg C18、100 mg MgSO4），天津博納艾杰爾有限公司；Carbon/NH2固相萃取小柱D（500 mg，6 mL），美國Agilent 公司。

標準儲備溶液噻蟲胺（純度≥98.0%，100 μg/mL）、氟啶蟲胺腈（純度≥98.0%，100 μg/mL），天津阿爾塔科技有限公司。

混合標準溶液的配制取適量100 μg/mL 噻蟲胺儲備液和100 μg/mL 氟啶蟲胺腈儲備液，用乙腈配制成質(zhì)量濃度為0.2 μg/mL 氟啶蟲胺腈和1 μg/mL 噻蟲胺的混合標準溶液。

標準工作曲線溶液的配制精確吸取一定量的混合標準溶液，用乙腈稀釋成標準工作曲線溶液，使噻蟲胺的濃度2.5、5、10、20、50、100 μg/L；氟啶蟲胺腈的濃度為0.5、1、2、5、10、20 μg/L。

基質(zhì)匹配工作曲線溶液的配制：取空白樣品按樣品前處理過程進行處理，得到空白基質(zhì)提取凈化液，用該基質(zhì)溶液稀釋混合標準溶液，配制成適當質(zhì)量濃度的標準工作液，用于LC-MS/MS 定量分析。

1.1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀，日本島津公司LC-20AD；三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國AB SCIEX 4000；其他設(shè)備包括超聲儀，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；多樣品氮吹濃縮儀，美國ATR 公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國Heidolph公司；Vortex-Genie 2 渦旋振蕩器，美國Scientific Industries 公司；離心機，德國Heidolph 公司；0.22 μm有機相濾膜，Dikma 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱Waters ACQUITY UPLC○R BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱溫：35℃；進樣體積：2 μL；流動相為0.1%甲酸水溶液和乙腈，梯度淋洗條件列于表1。

表1 梯度洗脫表 Table 1 Gradient profile

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：ESI；電噴霧電壓：+4000 V；霧化氣壓力：60 psi；輔助加熱氣壓力：60 psi；氣簾氣壓力：20 psi；離子源溫度：400℃；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；噻蟲胺和氟啶蟲胺腈的定性定量離子對、碰撞能量等質(zhì)譜分析參數(shù)見表2，MRM 色譜圖見圖1。

表2 噻蟲胺和氟啶蟲胺腈的質(zhì)譜分析參數(shù) Table 2 Parameters of mass spectra of clothianidin and sulfoxaflor

1.2.3 樣品處理方法

將農(nóng)場生產(chǎn)的南瓜，去柄粉碎并混合均勻，準確稱取15 g（精確至0.01 g），置于50 mL 離心管中，準確加入15 mL 乙腈，以10000 r/min 均質(zhì)提取1 min，加入6 g 無水MgSO4、1.5 g NaAc，立即渦旋混勻后，以9000 r/min 離心1 min。吸取5.0 mL 上層有機相轉(zhuǎn)移至裝有150 mg PSA 和900 mg 無水MgSO4粉末的離心管中，加入后立即將其渦旋混勻2 min，9 000 r/min 離心1 min，取上清液過0.22 μm 濾膜于進樣小瓶中，待LC-MS/MS 測定。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用AB Sciex 公司的Analyst 1.5.2 軟件進行數(shù)據(jù)采集；采用Excel 和Origin 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的確立

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本方法采用ESI 源和多反應(yīng)監(jiān)測模式對噻蟲胺和氟啶蟲胺腈目標化合物進行分析。采用1 mg/L 的待測化合物的標準溶液以流動注射的方式分別注入離子源，分別用ESI 正離子和負離子模式進行全掃描模式，掃描后發(fā)現(xiàn)噻蟲胺和氟啶蟲胺腈在ESI 正離子模式下響應(yīng)更高，因此選擇采用正離子掃描在此模式下確定了噻蟲胺和氟啶蟲胺腈母離子分別為m/z278.1 和250.0。通過優(yōu)化離子化電壓、霧化氣壓力、輔助氣壓力和去簇電壓使母離子豐度及穩(wěn)定性最佳，從中選出豐度最高的去簇電壓作為最佳去簇電壓；然后在Product 模式下，掃描確定母離子產(chǎn)生的響應(yīng)最高的2個子離子作為定量離子和定性離子。然后在MRM 模式下，分別對不同母離子產(chǎn)生的子離子的碰撞能量進行優(yōu)化，從中選出豐度最高的碰撞能量作為最佳碰撞能量，建立MRM 采集模式。圖1 和圖2 分別為噻蟲胺和氟啶蟲胺腈MRM 色譜圖和碰撞誘導(dǎo)解離質(zhì)譜圖。

圖1 噻蟲胺和氟啶蟲胺腈標準溶液的MRM 圖 Fig.1 MRM of clothianidin and sulfoxaflor standard solutions

圖2 噻蟲胺和氟啶蟲胺腈標準溶液的碰撞誘導(dǎo)解離質(zhì)譜圖 Fig.2 CID of clothianidin and sulfoxaflor standard solutions

2.1.2 色譜柱和流動相選擇

試驗發(fā)現(xiàn)，采用Waters ACQUITY UPLC○R BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱，比較了乙腈和甲醇作為有機流動相的色譜分離情況，當甲醇作為有機流動相時，氟啶蟲胺腈響應(yīng)值會大大降低。水相流動相中加入了0.1%甲酸溶液后，改善了質(zhì)譜的離子化效果，從而大大提高了質(zhì)譜檢測的靈敏度，因此最終選擇乙腈和含0.1%甲酸水溶液為流動相按照2.2.1色譜條件進行梯度洗脫試驗。在柱溫為35℃，流動相流速為0.3 mL/min，進樣量為2 μL 的條件下，可獲得南瓜樣品基質(zhì)中噻蟲胺和氟啶蟲胺腈穩(wěn)定、良好的分離效果。并且比較了幾個公司生產(chǎn)的色譜柱，結(jié)果顯示，采用Waters ACQUITY UPLC○R BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱分析時，待測農(nóng)藥保留時間以及峰形均比較理想。因此，選擇該柱作為液相色譜分離柱。圖l 為采用上述色譜檢測條件對樣品的檢測結(jié)果。由圖1 可以看出：噻蟲胺和氟啶蟲胺腈標準樣品的出峰時間分別為4.07 min 和5.45 min，峰形良好，且與南瓜樣品基質(zhì)無干擾。

2.2 樣品前處理條件的確定

2.2.1 提取溶劑的選擇

本研究采用QuEChERS 技術(shù)進行了樣品的提取，為了促使加入的乙腈提取液和水相分層，加入1.5 g 無水醋酸鈉和6 g 無水硫酸鈉粉末包除去提取液中的水分含量，保證提取充分，提高提取效率。分別比較了乙腈和1%乙酸乙腈溶液作為提取試劑時對含有噻蟲胺和氟啶蟲胺腈的加標樣品的提取實驗，結(jié)果如圖3所示。實驗結(jié)果表明，噻蟲胺的平均回收率分別為87.1%和85.7%，氟啶蟲胺腈的平均回收率分別為95.2%和93.0%。乙腈的提取效率相對較高，可能由于乙腈提取時干擾雜質(zhì)較少而回收率偏高，故選用乙腈作為提取溶劑。

圖3 不同提取試劑的回收率 Fig.3 Recoveries of clothianidin and sulfoxaflor by different extraction reagents

2.2.2 提取時間的確定

本實驗比較了超聲輔助提取對噻蟲胺和氟啶蟲胺腈回收率的影響。以南瓜空白樣品為基質(zhì)，噻蟲胺和氟啶蟲胺腈加標濃度分別為10 μg/kg 和2 μg/kg。固定其它前處理條件，比較樣品超聲時間分別為5、10、15、20 min 的回收率，結(jié)果見圖4。實驗結(jié)果表明，超聲提取10 min 時回收率最高，且隨超聲時間增加回收率反而降低，可能是因為隨著提取時間的延長，雜質(zhì)成分也被進一步提取出來，影響目標物的離子化效率導(dǎo)致回收率反而降低。所以，綜合以上因素考慮，本方法采用超聲10 min 作為輔助提取方法。

圖4 不同超聲提取時間的回收率 Fig.4 Recoveries of clothianidin and sulfoxaflor by different extraction times

2.2.3 基質(zhì)分散凈化劑的選擇

表3 經(jīng)不同種類凈化劑處理后的回收率 Table 3 Recoveries of clothianidin and sulfoxaflor by different types of purifiers

本實驗比較了QuEChERS 不同種類凈化劑對噻蟲胺和氟啶蟲胺腈回收率的影響。將噻蟲胺（濃度為10 μg/L）和氟啶蟲胺腈（濃度為2 μg/L）南瓜基質(zhì)混合標準溶液，經(jīng)裝有不同種類凈化劑的3 種QuEChERS 分散固相萃取管和1 種固相萃取小柱（具體成分見1.1 節(jié)）進行凈化處理，處理后的回收率結(jié)果見表2。實驗結(jié)果表明，不同凈化劑對噻蟲胺的回收率分別為89.4%、83.7%、68.8%和22.5%，對氟啶蟲胺腈的回收率分別為98.0%、86.3%、60.2%和39.4%。萃取管A 的提取回收率最高；萃取管B、C 和萃取小柱D 提取回收率相對較低。由于萃取管B 和C 中均含有C18 吸附劑，在除去雜質(zhì)的同時可能對目標物有不同程度的吸附導(dǎo)致回收率偏低；萃取小柱D 由于操作相對復(fù)雜，并且受到洗脫次數(shù)的限制導(dǎo)致回收率較低；最終采用移取5 mL 提取液到含有150 mg PSA 和900 mg MgSO4的固相萃取管A 來去除提取液中的雜質(zhì)成分，從而起到凈化除雜降低基質(zhì)干擾的效果。

2.3 線性范圍和基質(zhì)效應(yīng)

將2.2 節(jié)中配制的系列標準工作溶液，在優(yōu)化的色譜條件和質(zhì)譜條件下進行測定，以峰面積為縱坐標（y），質(zhì)量濃度為橫坐標（x）繪制校準曲線，按公式(1)計算基質(zhì)效應(yīng)(ME)，噻蟲胺和氟啶蟲胺腈的溶劑標準工作曲線溶液（2.1.1）和南瓜基質(zhì)匹配工作曲線溶液（2.1.1）的線性方程見表4。噻蟲胺在2.5～100 μg/L之間，氟啶蟲胺腈在0.5～20 μg/L 之間的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.995。并且均存在明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)。

表4 噻蟲胺和氟啶蟲胺腈的線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限和定量限 Table 4 Linear ranges,linear regression equations,correlation coefficients,matrix effect,limits of detection (LODs) and limit of quantitation (LOQs) for clothianidin and sulfoxaflor

其中，Sm 和Ss 分別表示基質(zhì)匹配標準曲線和溶劑標準曲線的斜率。當ME>0 時，說明為基質(zhì)增強效應(yīng)；ME<0，說明為基質(zhì)抑制效應(yīng)[10]。

2.4 方法的檢出限和定量限

取一定濃度的空白樣品基質(zhì)加標溶液在優(yōu)化的色譜條件和質(zhì)譜條件下進行測定，按信噪比為3 計算方法檢出限，按信噪比為10 計算方法定量限，結(jié)果見表4。噻蟲胺和氟啶蟲胺腈在南瓜基質(zhì)中的檢出限分別為2.5 和0.5 μg/kg，定量限分別為5.0 和1.0 μg/kg。

2.5 方法的回收率和精密度

在不含噻蟲胺和氟啶蟲胺腈的陰性南瓜樣品中添加3 個水平（定量限的1 倍、2 倍和10 倍）的混合標準溶液，添加30 min 后按上述樣品處理步驟進行殘留量測定，將測定質(zhì)量濃度與理論添加質(zhì)量濃度進行比較，得到添加回收率，每個添加水平平行測定6 次，得其相對標準偏差（RSD），測定結(jié)果見表5。由表5可以看出，噻蟲胺和氟啶蟲胺腈在南瓜中添加平均回收率在88.5%～111.2%之間，相對標準偏差在1.12%～ 6.92%之間，說明本方法的回收率較高、重復(fù)性好。

表5 噻蟲胺和氟啶蟲胺腈在三個添加水平下的平均回收率及其RSD 值 Table 5 Average recoveries and RSDs of clothianidin and sulfoxaflor under three addition levels (n=6)

2.6 實際樣品檢測結(jié)果

按照本方法對農(nóng)場生產(chǎn)的50 批次南瓜樣品進行噻蟲胺和氟啶蟲胺腈檢測，均未檢出噻蟲胺和氟啶蟲胺腈。

3 結(jié)論

本實驗在優(yōu)化樣品前處理條件和儀器條件的基礎(chǔ)上，建立了QuEChERS 結(jié)合LC-MS/MS 測定南瓜中噻蟲胺和氟啶蟲胺腈殘留量的檢測方法。樣品經(jīng)乙腈均質(zhì)提取和基質(zhì)分散萃取法凈化后，凈化后的樣液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定。采用Waters ACQUITY UPLC○R BEH C18（2.1 mm×100 mm,1.7 μm）色譜柱分離，電噴霧離子化、正離子掃描方式和動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測，基質(zhì)匹配標準溶液外標法定量。噻蟲胺在2.5～100 μg/L（氟啶蟲胺腈在0.5～20 μg/L）的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)分別為0.9994和0.9988。噻蟲胺在5、10 和50 μg/kg（氟啶蟲胺腈在1、2 和10 μg/kg）的3 個添加水平的平均回收率在88.5%～111.2%之間，相對標準偏差在1.12%～6.92%。噻蟲胺和氟啶蟲胺腈的方法定量限分別為1.0 μg/kg 和5.0 μg/kg。該方法快速簡便、靈敏度高、重現(xiàn)性好，符合GB/T 27404-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》的方法技術(shù)要求，可應(yīng)用于實際南瓜樣品中噻蟲胺和氟啶蟲胺腈殘留量的檢測分析。