李珂，劉欣超，趙津，嚴(yán)紅亞，趙蓉，常志順，王傳禹，信愛國(guó)*，李祥瑞*

(1. 云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院養(yǎng)禽與禽病研究所，云南 昆明 650224；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095；3. 玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 玉溪 653106)

弓形蟲病(Toxoplasmosis)是一種由剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)引起的寄生于人和動(dòng)物體內(nèi)呈世界性分布的人畜共患寄生蟲病，給世界各國(guó)的畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并危害人類健康，對(duì)孕婦和免疫缺陷、免疫抑制者損害尤其嚴(yán)重[1-2]。家禽主要通過食入或飲入含有弓形蟲卵囊的食物和水而感染，且多呈隱性感染，人類通過接觸病禽或食用未煮熟的禽制品可感染弓形蟲，因此加強(qiáng)對(duì)家禽弓形蟲感染的檢測(cè)，對(duì)防控弓形蟲病及人類健康有著重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。近年來，國(guó)外報(bào)道了全球多個(gè)地區(qū)和國(guó)家散養(yǎng)雞群弓形蟲病流行情況，部分地區(qū)感染率達(dá)到80%以上[3-4]，國(guó)內(nèi)散養(yǎng)雞弓形蟲病的感染情況各地存在一定的差異，但同樣不容忽視[5-6]。云南省家禽遺傳資源豐富，優(yōu)質(zhì)地方品種眾多，而在云南部分地區(qū)仍保有生食的習(xí)慣，這就大大增加了人類感染弓形蟲的風(fēng)險(xiǎn)。通過對(duì)云南省人弓形蟲感染情況的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，從事畜禽養(yǎng)殖相關(guān)的職業(yè)人群弓形蟲陽性率明顯高于非職業(yè)人群[7-8]。玉溪地區(qū)也報(bào)道了鴿子弓形蟲感染情況[9]，但關(guān)于云南家禽弓形蟲感染情況的報(bào)道和基因型研究尚十分欠缺。為了解云南省家禽弓形蟲的感染情況，采用間接血凝(IHA)和套式PCR兩種方法對(duì)云南省5個(gè)區(qū)域的8個(gè)規(guī)?；仪蒺B(yǎng)殖場(chǎng)、10個(gè)地方雞養(yǎng)殖場(chǎng)及部分散養(yǎng)戶進(jìn)行了弓形蟲檢測(cè)，并對(duì)核酸檢測(cè)為陽性的樣品進(jìn)行了PCR-RFLP基因分型研究，以期為云南省家禽弓形蟲病的防控提供數(shù)據(jù)支持和參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源及抽樣方法

2018年3月至2020年12月，從云南省昆明、玉溪、楚雄、昭通、文山、開遠(yuǎn)、建水、綠春、西雙版納、普洱、大理、麗江、迪慶等地區(qū)的8個(gè)規(guī)模化家禽養(yǎng)殖場(chǎng)(4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋雞場(chǎng)、3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)肉雞場(chǎng)和1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)種鴨場(chǎng))、10個(gè)地方品種雞(南澗烏骨雞、尼西雞、云龍矮腳雞、綠春黃連雞、寧蒗高原雞、武定雞、文山土雞、鹽津?yàn)豕请u、茶花雞、瓢雞)養(yǎng)殖場(chǎng)和部分散養(yǎng)戶(土雜雞、散養(yǎng)鴨、鵝、鴿子)，翅靜脈采集各種家禽血樣，并采集養(yǎng)殖場(chǎng)土壤樣品。

按照估計(jì)流行率方法進(jìn)行抽樣。參考國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道結(jié)果，設(shè)置信水平95%，可接受誤差10%，預(yù)期流行率10%，綜合考慮各養(yǎng)殖場(chǎng)(戶)飼養(yǎng)規(guī)模，在各場(chǎng)(戶)采取隨機(jī)抽樣的方式，共采集樣品2 802份，其中血液樣品2 145份，土壤樣品657份，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。各地區(qū)及養(yǎng)殖場(chǎng)(戶)樣品采集情況見表1。

表1 各地區(qū)及養(yǎng)殖場(chǎng)(戶)樣品采集數(shù)

1.2 主要試劑

弓形蟲間接血凝抗體檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所；國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株RH株速殖子DNA，為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院寄生蟲組李祥瑞教授惠贈(zèng)；土壤DNA提取試劑盒，購(gòu)自O(shè)mega 公司；血液/組織DNA提取試劑盒及DNA切膠回收試劑盒，購(gòu)自天根公司；Taq酶、dNTP Mixture等PCR所需試劑，購(gòu)自TaKaRa公司；內(nèi)切酶，購(gòu)自NEB公司。

1.3 方法

1.3.1 抗體檢測(cè)

參照弓形蟲間接血凝抗體檢測(cè)試劑盒的說明書進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)陽性對(duì)照血清、陰性血清對(duì)照和稀釋液對(duì)照成立的前提下，以待檢血清抗體滴度等于或高過1∶64為判斷陽性標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2 核酸檢測(cè)

使用DNA提取試劑盒提取樣品(包括采集的土壤樣品，以及抗體檢測(cè)結(jié)果為陽性的血液樣品)DNA后，根據(jù)楊振[10]設(shè)計(jì)的弓形蟲ITS-1序列特異性引物對(duì)所有樣品進(jìn)行檢測(cè)。引物序列：ITSa：5′-TGAATCCCAAGCAAAACAT-3′，ITSb：5′-GGAAGCAATCTGAAAGCAC-3′。引物由廣州擎科生物科技有限公司合成，目的片段大小為341 bp。

PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中10× buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，MgCl21.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板3 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O 13.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min。擴(kuò)增結(jié)束后，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.3 PCR-RFLP基因分型

將核酸檢測(cè)結(jié)果為陽性的樣品DNA與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株RH株速殖子DNA一起，使用表面抗原SAG3基因的PCR-RFLP[11](表2)進(jìn)行分型分析，反應(yīng)體系為25 μL，其中10× buffer(Mg2+)2.5 μL，dNTP 2 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，Taq酶0.2 μL，ddH2O 16.3 μL。第一輪反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；第二輪反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增結(jié)束后，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表2 多位點(diǎn)基因分型 PCR-RFLP 所用引物序列及內(nèi)切酶

將SAG3基因擴(kuò)增結(jié)果為陽性的PCR產(chǎn)物切膠回收后，用相應(yīng)的內(nèi)切酶37 ℃金屬浴30 min，酶切體系為：內(nèi)切酶0.5 μL，10× buffer 2 μL，產(chǎn)物10 μL，ddH2O 7.5 μL，共計(jì)20 μL。酶切結(jié)束后，3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

將檢測(cè)結(jié)果錄入Excel，按家禽種類、品種和區(qū)域分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和描述，分析不同養(yǎng)殖類型、不同種類、不同品種和不同區(qū)域的家禽弓形蟲感染情況，并對(duì)多位點(diǎn)基因分型 PCR-RFLP結(jié)果進(jìn)行綜合分析，從而系統(tǒng)了解云南省家禽弓形蟲病的流行狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同養(yǎng)殖類型家禽及環(huán)境中弓形蟲感染的檢測(cè)

將采集的規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)、地方品種雞養(yǎng)殖場(chǎng)和家禽散養(yǎng)戶的2 145份血樣通過弓形蟲間接血凝抗體試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，并將抗體檢測(cè)為陽性的血樣和657份土壤樣品，通過PCR方法進(jìn)行了弓形蟲ITS-1檢測(cè)，并以已知的無弓形蟲感染樣品和RH株樣品為陰、陽性對(duì)照，部分樣品PCR產(chǎn)物電泳見圖1。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量DL2000；1.陽性對(duì)照(RH株)；2.陰性對(duì)照；3～24.部分樣品

按照不同養(yǎng)殖類型對(duì)弓形蟲檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表3。不同養(yǎng)殖類型弓形蟲陽性率差異明顯，規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)抗體、核酸檢測(cè)均為陰性；散養(yǎng)場(chǎng)(戶)平均抗體陽性率為6.98%，血樣、土壤的核酸平均陽性率分別為2.18%和3.42%，其中，散養(yǎng)雞最高，抗體陽性率達(dá)到9.30%，血樣、土壤核酸陽性率達(dá)到4.32%和6.96%，地方雞和其他家禽陽性率差異不大。

表3 不同養(yǎng)殖類型場(chǎng)(戶)弓形蟲檢測(cè)結(jié)果

2.2 不同品種家禽及環(huán)境中弓形蟲感染的檢測(cè)

此次弓形蟲流行病學(xué)調(diào)查涵蓋了云南省主要家禽(雞、鴨、鵝、鴿)和10個(gè)云南地方品種雞，不同家禽和不同地方品種雞之間的陽性率存在差異，結(jié)果見表4、表5。不同家禽中鴿子平均抗體陽性率最高為6.41%，鴨最低為4.10%。各家禽血樣的核酸平均陽性率差異不大，土壤除鵝未檢出外，從高到低依次為鴿子(3.70%)、雞(3.04%)和鴨(1.56%)；不同地方品種雞中武定雞和文山土雞較高，分別為8.43%、8.25%，綠春黃連雞最低為3.85%，其余雞種均高于5%。不同品種的核酸平均陽性率，南澗烏骨雞、尼西雞、云龍矮腳雞和綠春黃連雞均為血樣、土壤檢測(cè)陰性，瓢雞為土壤檢測(cè)陰性。血樣中文山土雞最高(4.12%)，茶花雞和武定雞次之(2.56%、2.41%)，瓢雞、鹽津?yàn)豕请u、寧蒗高原雞相近(1.96%、1.12%、1.69%)；土壤中茶花雞最高(4.17%)，文山土雞、鹽津?yàn)豕请u、寧蒗高原雞、武定雞相近(3.85%、3.70%、3.57%、3.03%)。

表4 不同種類家禽弓形蟲檢測(cè)結(jié)果

表5 不同地方品種雞弓形蟲檢測(cè)結(jié)果

2.3 不同地區(qū)家禽及環(huán)境中弓形蟲感染的檢測(cè)

將所檢測(cè)樣品按照所屬地區(qū)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表6、表7?？傮w來看，滇東南平均抗體陽性率(6.60%)和血樣核酸平均陽性率(3.55%、5.38%)均為最高，滇西南(6.02%、2.78%、3.37%)僅次于滇東南，而滇中地區(qū)血樣的抗體陽性率(3.34%)和核酸陽性率(0.61%)均為最低，土壤的核酸陽性率，則是滇東北(1.30%)和滇西北(1.52%)較低；將各地區(qū)的散養(yǎng)家禽進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，平均抗體陽性率滇中(12.22%)、滇南(9.87%)地區(qū)遠(yuǎn)高于其他地區(qū)，血樣、土壤的核酸平均陽性率，滇東南(3.55%、5.38%)、滇南(3.29%、5.77%)和滇西南(2.78%、3.37%)地區(qū)較高。

表6 不同地區(qū)家禽弓形蟲檢測(cè)結(jié)果

表7 不同地區(qū)散養(yǎng)家禽弓形蟲檢測(cè)結(jié)果

2.4 PCR-RFLP基因分型分析

48份(30份血清樣品、18份土壤樣品)經(jīng)過ITS-1序列特異性檢測(cè)為陽性的樣品，進(jìn)一步與RH株速殖子進(jìn)行表面抗原SAG3基因的PCR-RFLP，結(jié)果顯示：除1份土壤樣品的基因型為非典型以外，其余核酸陽性樣品的基因型均為Ⅰ型，占97.92%(47/48)，部分樣品的PCR產(chǎn)物電泳見圖2，酶切圖見圖3。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量DL2000；1.陽性對(duì)照(RH株)第一輪擴(kuò)增；2.陽性對(duì)照(RH株)第二輪擴(kuò)增；3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23.樣品第一輪擴(kuò)增；4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24.樣品第二輪擴(kuò)增

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量DL500；1.陽性對(duì)照(RH株)；2～10.樣品

3 討論

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)持續(xù)高速發(fā)展，人民生活水平得到提高，對(duì)肉制品的需求比重逐步發(fā)生變化，禽肉制品成為了人們餐桌上肉食的重要來源。弓形蟲作為重要的人獸共患寄生蟲病，制約了家禽業(yè)的發(fā)展，并對(duì)人類的健康構(gòu)成了威脅。本文調(diào)查了2018—2020年云南省家禽飼養(yǎng)比較集中地區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)化養(yǎng)殖場(chǎng)、地方品種雞養(yǎng)殖場(chǎng)和散養(yǎng)戶中家禽弓形蟲病的流行情況及環(huán)境污染情況，調(diào)查結(jié)果表明，2 145份血液樣品的弓形蟲平均抗體陽性率為4.48%(96/2 145)，核酸平均陽性率為1.40%(30/2 145)，657份土壤樣品的弓形蟲核酸平均陽性率為2.74%(18/657)，其中散養(yǎng)場(chǎng)(戶)平均抗體陽性率為6.98%，血樣、土壤的核酸平均陽性率分別為2.18%和3.42%，而規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)均未檢出陽性樣品。分析原因可能與規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)基礎(chǔ)設(shè)施完善，飼養(yǎng)管理水平較高有關(guān)系，規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)多采用全封閉式或半封閉式飼舍，配套有防鳥、捕鼠設(shè)施，除定期進(jìn)行消殺驅(qū)蟲外，飼養(yǎng)人員和飼養(yǎng)用具進(jìn)出生產(chǎn)區(qū)嚴(yán)格執(zhí)行消毒規(guī)范，并嚴(yán)禁飼養(yǎng)犬、貓等寵物，避免了這類弓形蟲的重要寄生宿主帶蟲引起的傳播；而散養(yǎng)場(chǎng)(戶)的基礎(chǔ)設(shè)施和飼養(yǎng)水平層次不齊，且多為開放式或半開放式飼養(yǎng)，增加了與野鳥、犬、貓等動(dòng)物的接觸機(jī)會(huì)，消殺驅(qū)蟲難度大，感染機(jī)會(huì)較大。

從不同種類家禽、不同地方品種雞和不同地區(qū)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步分析，鴿抗體陽性率最高(6.41%)，鴨最低(4.10%)，雞略高于鴨(4.38%)，土壤核酸陽性率鴿子(3.70%)高于雞(3.04%)和鴨(1.56%)，鵝未檢出。最主要的原因可能是鴿多采取半放養(yǎng)模式進(jìn)行飼養(yǎng)，增加了接觸到帶蟲野鳥、野生動(dòng)物及其排泄物的機(jī)會(huì)，雞在家禽飼養(yǎng)中技術(shù)最成熟，養(yǎng)殖量大，但飼養(yǎng)模式多級(jí)分化；不同地方品種雞中，抗體陽性率武定雞(8.43%)和文山土雞(8.25%)較高，綠春黃連雞(3.85%)最低，血樣、土壤的檢測(cè)，文山土雞(4.12%)和茶花雞(4.17%)最高，南澗烏骨雞、尼西雞、云龍矮腳雞、綠春黃連雞均未檢出，瓢雞只在血樣中檢出。此次調(diào)查的地方品種雞樣品均采自種雞場(chǎng)，種雞主要收購(gòu)于農(nóng)戶手中，多有與犬、貓混養(yǎng)的習(xí)慣，雞只通過啄食受到污染的飼料和飲水而遭受感染，種雞場(chǎng)雖經(jīng)過簡(jiǎn)單篩選，但飼養(yǎng)管理水平較規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)低且參差不齊，再加之各種雞所處地區(qū)氣候、溫濕度等條件的影響，也是造成此結(jié)果的重要原因；不同地區(qū)的檢測(cè)結(jié)果顯示，滇東南陽性率(6.60%、3.55%、5.38%)最高，其次為滇西南(6.02%、2.78%、3.37%)，但將散養(yǎng)家禽單獨(dú)比較后發(fā)現(xiàn)，滇中、滇南地區(qū)平均抗體陽性率(12.22%、9.87%)遠(yuǎn)高于其他地區(qū)，血樣、土壤的核酸平均陽性率滇東南(3.55%、5.38%)、滇南(3.29%、5.77%)和滇西南(2.78%、3.37%)較其他地區(qū)高，可能與這些地區(qū)的氣候條件、生態(tài)環(huán)境及規(guī)?；B(yǎng)殖程度有關(guān)，其中滇東南、滇南和滇西南地區(qū)氣溫相對(duì)較高、生態(tài)環(huán)境較好，與帶蟲野生動(dòng)物接觸的概率較高，滇中、滇西、滇南地區(qū)為云南省家禽飼養(yǎng)較集中區(qū)域，飼養(yǎng)量和密度大，飼養(yǎng)模式呈多級(jí)分化，標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?；a(chǎn)與家庭散養(yǎng)式、山林放養(yǎng)式兼有，而滇東北和滇西北地區(qū)海拔較高，氣溫較低，養(yǎng)殖量也相對(duì)較少。

PCR-RPLP多態(tài)性分析技術(shù)廣泛應(yīng)用于對(duì)不同宿主源的弓形蟲進(jìn)行基因分型，通過該技術(shù)可將弓形蟲蟲株分為3個(gè)基因型譜系(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)。為了更好地了解云南省家禽弓形蟲的流行狀況，本調(diào)查對(duì)48份經(jīng)過ITS-1序列特異性檢測(cè)為陽性的樣品，運(yùn)用PCR-RFLP方法對(duì)表面抗原SAG3基因進(jìn)行了基因分型研究，同時(shí)設(shè)立Ⅰ型弓形蟲代表株RH株為陽性對(duì)照。結(jié)果表明，此次檢測(cè)的云南省家禽血清及環(huán)境樣品中的弓形蟲基因型主要是Ⅰ型，占97.92%(47/48)，1份土壤樣品為弓形蟲非典型基因型。國(guó)內(nèi)許多學(xué)者對(duì)我國(guó)不同來源弓形蟲的基因型研究證實(shí)，Chinese1型為流行我國(guó)的優(yōu)勢(shì)基因型[12-13]，而根據(jù)弓形蟲數(shù)據(jù)庫(kù)(www.toxodb.org)和相關(guān)研究關(guān)于 Chinese1型在 SAG3位點(diǎn)基因型的報(bào)道，SAG3基因位點(diǎn)是Ⅲ型，與本研究結(jié)果不一致，但與王瑞彪[11]對(duì)泰安市商品性雞產(chǎn)品弓形蟲基因分型的研究結(jié)果一致，若要探究雞源弓形蟲是否屬于另一基因型，仍需進(jìn)一步對(duì)其他基因位點(diǎn)進(jìn)行研究。

臨床上家禽弓形蟲病相對(duì)于哺乳動(dòng)物來說比較罕見，多呈隱性感染，主要通過血液循環(huán)到達(dá)到宿主各臟器和組織，侵入有核細(xì)胞，因此血清學(xué)檢測(cè)與PCR方法的聯(lián)合使用，能更好地反映家禽弓形蟲的感染情況。近年來，我國(guó)一些省市報(bào)道了禽類弓形蟲感染情況[5-6,14-16]，然而關(guān)于云南省家禽弓形蟲流行狀況及基因型的研究尚十分欠缺。通過本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，云南省家禽中普遍存在弓形蟲感染的情況，且環(huán)境污染情況不容樂觀，不同飼養(yǎng)模式、不同品種、不同地區(qū)之間存在差異，散養(yǎng)場(chǎng)(戶)的陽性率明顯高于規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)，鴿子由于其飼養(yǎng)方式特點(diǎn)，陽性率高于其他家禽，不同地方品種雞及不同地區(qū)弓形蟲的感染情況與該地區(qū)氣候特點(diǎn)、飼養(yǎng)方式及水平存在一定的關(guān)聯(lián)。建議加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，場(chǎng)區(qū)嚴(yán)禁飼養(yǎng)犬、貓等寵物，做好防鳥滅鼠工作，避免飼料及飲水污染，尤其對(duì)于散養(yǎng)的家禽應(yīng)定期開展驅(qū)蟲，并特別關(guān)注相關(guān)從業(yè)人員健康狀況，禁食生肉制品，切斷傳播途徑，具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。