陳芙，袁婷，郝華芳，儲岳峰，顏新敏*，王鵬雁

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730046;2. 石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832001)

羊支原體肺炎(Mycoplasma pneumonia of sheep and goats,MPSG)在我國長期普遍流行，危害巨大。MPSG病原復雜，根據(jù)文獻報道，我國MPSG的病原至少包括：山羊支原體山羊肺炎亞種(Mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae, Mccp)、綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae,Mo)和絲狀支原體山羊亞種(Mycoplasmamycoidessubsp.capri,Mmc)等[1-3]。這3種病原引起的疾病臨床表現(xiàn)以肺炎、胸膜炎等呼吸系統(tǒng)癥狀為主，但文獻報道Mmc還可導致乳腺炎、關(guān)節(jié)炎、角膜炎和敗血癥等綜合征(MAKePS)，是傳染性無乳癥(contagious agalactia, CA)的病原之一[4-6]。本實驗室前期對由Mccp和Mo引起的羊支原體肺炎進行了較為系統(tǒng)的研究，已通過構(gòu)建人工感染模型等工作研發(fā)了相應的疫苗和診斷試劑，并實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化[7-8]。但目前對Mmc感染的防控技術(shù)研究，國內(nèi)外報道的不多[9-11]。建立有效的動物模型是深入了解病原致病機制和研發(fā)疫苗等防控技術(shù)的基礎。本文采用Mmc國內(nèi)分離株對山羊進行人工感染試驗觀察，初步了解Mmc感染后山羊的臨床表現(xiàn)和病理特征，為下一步建立Mmc人工感染模型和我國MPSG病原學研究積累數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

絲狀支原體山羊亞種Mm1901株，中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所分離、鑒定和保存。

1.2 試驗動物

來自甘肅榆中某羊場的6月齡左右、體重12 kg中衛(wèi)白山羊6只，隨機平均分為2組，攻毒組和對照組。熒光定量PCR(qPCR)檢測鼻拭子樣品中Mmc核酸[12]，間接血凝試驗檢測Mmc抗體[13]皆為陰性。

1.3 試驗試劑

MTB和MTA培養(yǎng)基，參考文獻[1]制備。PremixTaq和DNA Marker DL2000，購自大連寶生物有限公司；細菌DNA提取試劑盒和組織DNA提取試劑盒(離心柱型)，購自天根生化科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 攻毒菌液準備

用MTB培養(yǎng)基按照1∶10比例接種復蘇Mm1901株F2代凍存菌液，經(jīng)傳代2次擴大培養(yǎng)，待培養(yǎng)基顏色變黃后8 000 r/min離心15 min進行10倍濃縮，將離心菌體與10 mL上清液混合濃縮后作為攻毒菌液。同時測定菌液的菌落形成單位(CFU)(結(jié)果為1.0×109CFU/mL)，并接種血平皿做無菌檢測(應無菌生長)。

1.4.2 人工感染

人工感染程序參考文獻[14]進行：第1天鼻腔噴霧攻毒2 mL/只，每個鼻孔各1 mL；第2天同樣噴霧感染；第5天氣管注射6 mL/只。對照組噴鼻和注射同樣體積的生理鹽水[8-10]。

從第0天開始，每天測量體溫，記錄臨床表現(xiàn)，攻毒前后、剖檢前取全血測定血常規(guī)。

死亡(鼻腔攻毒后第8天，攻毒程序結(jié)束后第3天)和瀕臨死亡羊剖檢并記錄病變，同時取肺臟、脾臟、肝臟、腎臟、氣管等組織樣品進行支原體病原學檢測，并送成都里來生物科技有限公司做病理觀察。

1.4.3 Mmc病原學檢測

1.4.3.1 引物及反應體系、程序

根據(jù)文獻[12]合成引物(見表1)，并按照已公布的反應體系及反應條件進行。反應體系：SYBR PremixExTaqⅡ(2×) 12.5 μL，Mmc-1700F 0.5 μL，Mmc-1770R 0.5 μL，模板2 μL，水補足至25 μL。反應條件：95 ℃ 30 s預變性；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。

表1 引物信息

1.4.3.2 標準曲線的建立

將復蘇的菌液提取DNA，測定濃度并計算拷貝數(shù)，調(diào)整濃度為1.0×109拷貝數(shù)/μL后進行10倍梯度稀釋，取1.0×108～1.0×102拷貝數(shù)/μL共7個濃度梯度樣品，作為模板按反應體系與反應條件進行擴增，以各梯度起始模板濃度之對數(shù)值為x軸，以反應之Ct值為y軸，繪制標準曲線。

1.4.3.3 樣品檢測

將剖檢獲取的各組織樣品組織研磨，試劑盒提取DNA，同時進行分離培養(yǎng)，對陽性培養(yǎng)物提取DNA，同時利用合成的引物進行qPCR定量檢測組織。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Graphpad Prism 5軟件，對血常規(guī)參數(shù)進行雙因素方差分析(Two-way ANOVA) 。數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀

山羊鼻腔接種培養(yǎng)物后無明顯臨床表現(xiàn)，但氣管攻毒后第2 天體溫明顯上升，最高可達41.2 ℃，并出現(xiàn)精神沉郁、食欲廢絕、精神異常(臥地或呆立)、頭頸僵直、背腰拱起、腹肋緊縮、咳嗽、口鼻流涎、呼吸極度困難(張口呼吸)、顫動，胸部按壓有痛感等臨床癥狀。其中1只羊在氣管攻毒后第3天(噴鼻后第8 天)死亡，其余2只羊瀕死，同時處死、剖檢。

2.2 剖檢變化

全部攻毒羊頸部皮下水腫嚴重(下頜至胸前)，氣管上有出血點，呼吸道內(nèi)含有泡沫樣物質(zhì)，氣管被膠凍樣滲出物包裹。肺淤血、出血，大部分肺組織紅色肉變，縱膈、肺門淋巴結(jié)淤血。腎臟表面、皮質(zhì)有淤血和出血點。脾臟有淤血、梗死灶。心臟水腫有心包積液，透明無色，左心耳淤血。瘤胃鼓氣，瓣胃、真胃無食。

2.3 血液參數(shù)變化

使用Graphpad Prism 5軟件對攻毒組與對照組山羊在攻毒前后時間點的組間及組內(nèi)進行血液參數(shù)分析，其中對照組在第0天和第8天均無差異性(P>0.05)。攻毒組第0天白細胞總數(shù)(圖1a，P<0.05)、中間細胞比率(圖1b，P<0.01)、紅細胞總數(shù)(圖1c，P<0.01)顯著或極顯著高于第8天，粒細胞比率第0天顯著低于第8天(P<0.05)。攻毒組白細胞總數(shù)在攻毒第8天顯著低于對照組(P<0.05)。血紅蛋白含量(圖1e)均無差異性(P>0.05)。

*表示P<0.05，**表示P<0.01

2.4 病理組織學變化

肺臟間質(zhì)輕度炎細胞浸潤，主要為核圓形深染的淋巴細胞和分葉核的中性粒細胞，支氣管周圍可見多量炎細胞成團浸潤，以淋巴細胞為主(圖2a)；肝臟血管內(nèi)見少量中性粒細胞邊緣化，組織少量炎細胞浸潤(圖2b)；脾臟紅髓內(nèi)少量含鐵血黃素沉積(圖2c)；氣管固有層細胞灶性壞死，并伴有較多炎細胞浸潤，以淋巴細胞為主，周圍和固有層下脂肪組織內(nèi)輕度出血，見紅細胞溢出血管(圖2d)；腎小球玻璃樣變，腎小囊腔內(nèi)數(shù)量不等的嗜伊紅圓形小體沉積，腎小管上皮空泡變性，見胞質(zhì)內(nèi)含大小不等的空泡(圖2e)。

a.肺臟間質(zhì)輕度炎細胞浸潤;b. 肝臟少量炎性細胞浸潤;c. 脾臟紅髓內(nèi)含鐵血黃素沉積;d.氣管固有層細胞灶性壞死;e. 腎小球玻璃樣變、腎小管上皮空泡變性

2.5 病原學檢測

2.5.1 Mmc-qPCR標準曲線建立

從圖3可見，基因組參考品起始模板濃度與對應的Ct值表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)R2=0.997，其擴增效率E=91.7%，直線方程是y=-3.537log(x)+49.260。

圖3 qPCR檢測Mmc的標準曲線

2.5.2 攻毒羊組織樣品檢測

共獲得23份攻毒羊各部位組織樣品，其中心臟3份、肝臟3份、脾臟3份、肺臟3份、腎臟3份、血液3份、皮下水腫液2份、氣管滲出物2份、尿液1份。除尿液樣品分離培養(yǎng)為陰性外，其余均為陽性。qPCR檢測結(jié)果一致，尿液樣未檢出Mmc。

用qPCR比較攻毒羊各組織器官Mmc含量(表2)，其中含量較高的為肺臟(Ct值為16～17)和脾臟(Ct值為17～18)。

表2 qPCR檢測對照組與攻毒組羊各組織中Mmc含量

3 討論

本試驗利用一定劑量的Mmc分離株培養(yǎng)物人工感染山羊進行致病性觀察，臨床癥狀與剖檢與已發(fā)表文獻[15]描述一致。病理學觀察結(jié)果由于病程短，組織臟器發(fā)現(xiàn)不同程度的炎性細胞浸潤，除氣管出現(xiàn)灶性壞死，其余組織細胞未見明顯病理變化，間接血凝血清抗體檢測由于感染時間短，因此尚未轉(zhuǎn)陽。血常規(guī)變化顯示白細胞總數(shù)、中間細胞比率、紅細胞總數(shù)、中性粒細胞比率攻毒前后存在顯著差異性，血紅蛋白均無差異性，提示山羊機體組織損傷、炎癥反應、貧血脫水及紅細胞損傷。qPCR均能夠從心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、血液、皮下水腫液等檢測到Mmc的DNA，檢出含量較高的組織器官為肺臟(Ct：16～17)和脾臟(Ct：17～18)。這些結(jié)果，均可說明Mmc可引起山羊嚴重的急性呼吸道癥狀、急性炎癥和全身性臟器病理損傷，與文獻中記載Mmc可導致MAKePS一致[1-6]。

Mmc是一種系統(tǒng)性感染病原，盡管是我國報道的羊支原體肺炎病原之一[1-3,11]，但與我國流行的其他兩種羊支原體肺炎病原(Mccp和Mo)只引起肺臟、胸腔等呼吸道癥狀不同，Mmc對宿主毒力和致死性可能更強。目前，我國Mmc分布、危害等流行病學資料較少，可能是由于支原體不易培養(yǎng)，不是病原學檢測實驗室常規(guī)檢測項目，導致支原體病原常被自然忽視和漏檢。但隨著我國奶羊產(chǎn)業(yè)規(guī)模擴大和產(chǎn)業(yè)興起，加強對能引起傳染性無乳癥和支原體肺炎的Mmc檢測和調(diào)查，對我國奶羊產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展非常重要。

總之，本試驗在實驗室初步證實了Mmc的系統(tǒng)性感染特點，確定了關(guān)鍵致病表現(xiàn)和病理變化特征。下一步將通過劑量分組和不同接種途徑，探索建立Mmc人工感染山羊模型，為Mmc防控技術(shù)研究提供支撐。