王瀟璐 于竹芹 汪貫習(xí) 劉宗保 周縝 郭云良

[摘要]?目的 探討胡黃連苷對人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖（OGD/R）損傷的保護作用及其最佳劑量。方法 體外培養(yǎng)SH-SY5Y細胞，建立OGD/R模型。于復(fù)氧復(fù)糖時分別加入胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ各5個濃度梯度（5、10、20、40、80 μmol/L），優(yōu)化最佳劑量。后續(xù)選用胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ各自的最佳劑量，進行2×2×2析因設(shè)計分組。光學(xué)顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)學(xué)變化，采用CCK-8法檢測細胞存活率，采用乳酸脫氫酶（LDH）釋放法測定細胞損傷程度，采用熒光探針DCFH-DA標(biāo)記法檢測細胞內(nèi)活性氧（ROS）的水平，根據(jù)用藥劑量及結(jié)果綜合評價胡黃連苷的保護作用。結(jié)果 與對照組相比較，OGD/R后SH-SY5Y細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，模型組細胞變圓或腫脹，突起回縮或消失，細胞膜有皺褶或破損，細胞數(shù)目明顯減少，漂浮細胞增多;與模型組相比較，胡黃連苷組細胞損傷得到不同程度的改善，細胞貼壁性增強。對各指標(biāo)進行綜合分析，從用藥劑量最小化和療效最大化的角度考慮，選用胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ的最佳劑量為20 μmol/L進行后續(xù)實驗。胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ聯(lián)合應(yīng)用組與其他組相比，細胞形態(tài)較完整，細胞貼壁性強，細胞存活率明顯提高，LDH含量下降，細胞損傷明顯減輕，ROS水平下降（F=82.9～186.3，P<0.01）。結(jié)論 胡黃連苷可能通過抗氧化應(yīng)激對SH-SY5Y細胞OGD/R損傷發(fā)揮神經(jīng)保護作用，且胡黃連苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各20 μmol/L時聯(lián)合使用效果最好。

[關(guān)鍵詞]?胡黃連甙;再灌注損傷;卒中;神經(jīng)保護;氧化性應(yīng)激

[中圖分類號]?R743.3

[文獻標(biāo)志碼]?A

[文章編號]?2096-5532（2021）04-0537-07

腦卒中是臨床上常見的腦血管疾病，其中缺血性腦卒中約占80%[1]。東亞人群患腦卒中的風(fēng)險位居全球首位[2-3]。腦缺血再灌注損傷是指腦組織缺血后血流再通進一步導(dǎo)致組織損傷和功能障礙的過程，是一種涉及多個因素的復(fù)雜病理生理現(xiàn)象[4]。氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖（OGD/R）神經(jīng)細胞模型，是通過氧糖剝奪后快速恢復(fù)氧糖供應(yīng)，從而在細胞水平模擬臨床腦缺血再灌注損傷，以進行細胞機制和藥物研究[5]。正常情況下，自由基的生成和清除會形成動態(tài)平衡。在缺血再灌注時，會產(chǎn)生大量的自由基[6-7]。大量的活性氧（ROS）是導(dǎo)致缺血再灌注損傷的主要原因[8-9]。ROS是有氧代謝產(chǎn)生的自由基，是一種不穩(wěn)定的化合物質(zhì)，易與核酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)反應(yīng)，從而引起細胞損傷或細胞死亡[10]。ROS導(dǎo)致的氧化應(yīng)激會進一步引起DNA損傷和局部炎癥反應(yīng)，引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)可能導(dǎo)致隨后的炎癥因子風(fēng)暴，使細胞結(jié)構(gòu)受損，最終導(dǎo)致細胞死亡[11-12]。因此，研究開發(fā)抗氧化應(yīng)激的神經(jīng)保護藥物至關(guān)重要。傳統(tǒng)中藥胡黃連是玄參科植物西藏胡黃連的干燥根莖[13]。研究證明，胡黃連的主要有效成分是環(huán)烯醚萜類化合物，主要單體有效成分為胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ和胡黃連苷Ⅲ;胡黃連苷具有保護肝臟[14]，保護腦缺血再灌注[15-17]、腎缺血再灌注、急性胰腺炎[18]以及減輕炎癥反應(yīng)[19]的作用。但胡黃連苷對SH-SY5Y細胞OGD/R損傷的保護作用和最佳劑量尚未見報道。本研究通過建立人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞OGD/R模型模擬腦缺血再灌注損傷過程[20-21]，旨在探討胡黃連苷對OGD/R損傷的保護作用及其最佳劑量，以期為缺血性腦血管病的治療提供新的思路。

1?材料與方法

1.1?藥品和試劑

胡黃連苷Ⅰ（分子式為C24H28O11，分子量為492.47）、胡黃連苷Ⅱ（分子式為C23H28O13，分子量為512.46）、胡黃連苷Ⅲ（分子式為C25H30O13，分子量為538.5）（B20515，上海源葉生物科技有限公司）。DMEM高糖培養(yǎng)基（Hyclone，?USA）;DMEM無糖培養(yǎng)基（GIBCO，USA）;胰蛋白酶（Trypsin，GIBCO，USA）;澳洲胎牛血清（GIBCO，USA）;細胞培養(yǎng)專用100×青-鏈霉素混合液（P1400，Solarbio）;Cell counting kit-8（DOJINDO，Japan）;乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，中國）;ROS檢測試劑盒（碧云天，中國）。

1.2?SH-SY5Y細胞培養(yǎng)

人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞株（批號為20181105）由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞資源中心提供，置于含有體積分數(shù)0.10胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 g/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細胞接種后放置在37 ℃、體積分數(shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中，待生長至對數(shù)期時作為實驗細胞。當(dāng)細胞覆蓋瓶底面積達80%時，倒掉培養(yǎng)液，用PBS清洗，加入2.5 g/L的胰蛋白酶，消化30 s后以1 000 r/min離心5 min，使用完全培養(yǎng)基重懸，將細胞懸液以2×108/L接種于96孔板中，置于37 ℃、體積分數(shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。

1.3?OGD/R模型制備

細胞生長至匯合率為80%時，將含有體積分數(shù)0.10胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基更換成無糖無血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)箱中，連續(xù)充以無氧氣體（體積分數(shù)0.90的N2、體積分數(shù)0.09的CO2和體積分數(shù)0.01的O2），4 h后取出，換成含體積分數(shù)0.10胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，放入37 ℃、體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.4?分組設(shè)計

前期實驗將細胞隨機分為對照組（使用含體積分數(shù)0.10胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基進行正常培養(yǎng)，不做其他處理）、模型組（建立OGD/R模型）、胡黃連苷組（建立OGD/R模型，在復(fù)氧的同時加入5、10、20、40、80 μmol/L等5個濃度梯度的胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ）。每次每組設(shè)5個平行復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。通過觀察細胞形態(tài)和檢測細胞存活率、LDH釋放量和ROS水平，確定胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ和胡黃連苷Ⅲ的最佳濃度。

后續(xù)實驗選用胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ的最佳濃度作為研究因素，采用2×2×2的析因設(shè)計分組，每個因素各取2個水平，即胡黃連苷Ⅰ（0用、1不用）、胡黃連苷Ⅱ（0用、1不用）、胡黃連苷Ⅲ（0用、1不用），不同水平完全交叉組合形成了23個實驗組，即8個實驗組。

1.5?檢測指標(biāo)

1.5.1?細胞生長狀況?復(fù)氧復(fù)糖24 h后，在倒置顯微鏡下每組隨機選取5個視野拍照，觀察細胞的生長狀況、數(shù)量、形態(tài)的變化。

1.5.2?CCK-8法檢測細胞存活率?將生長狀態(tài)良好的細胞消化、離心，用培養(yǎng)基重懸細胞、計數(shù)。取細胞懸液每孔100 μL（2×108/L）鋪在96孔板中，放入37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞匯合率達到80%時，制備OGD/R模型。造模結(jié)束后，在每孔中加入10 μL的CCK-8溶液，放入培養(yǎng)箱中孵育3 h，同時再設(shè)一個空白孔作為對照，用全自動酶標(biāo)儀檢測450 nm處各孔的吸光度值。計算各組SH-SY5Y細胞的存活率，細胞存活率=實驗組吸光度均值/對照組吸光度均值×100%。實驗重復(fù)3次。

1.5.3?LDH釋放量測定?SH-SY5Y細胞分組及培養(yǎng)同前，在OGD/R后，于96孔板中取各組處理后的細胞培養(yǎng)上清液適量，進行LDH測定。反應(yīng)結(jié)束后用酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光度值，計算細胞損傷程度。

1.5.4?細胞內(nèi)ROS水平檢測?SH-SY5Y細胞分組及培養(yǎng)同前，在OGD/R后，棄去細胞培養(yǎng)上清液，加不含血清DMEM培養(yǎng)基稀釋的DCFH-DA工作液，37 ℃孵育30 min，棄去上清液，洗滌2次，使用PBS吹打均勻，應(yīng)用熒光酶標(biāo)儀進行檢測，設(shè)置激發(fā)波長為488 nm、發(fā)射波長為525 nm。結(jié)果以熒光強度比值表示，熒光強度比值=實驗組的熒光強度/對照組的熒光強度。

1.6?統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用Graph Pad Prism 8.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料結(jié)果以X2±s表示，胡黃連苷對OGD/R后SH-SY5Y細胞的存活率、損傷程度和ROS水平影響的分析采用單因素方差分析（One-way Anova），組間兩兩比較采用LSD t檢驗;胡黃連苷組合優(yōu)化對OGD/R后SH-SY5Y細胞的影響分析采用析因設(shè)計的方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2?結(jié)?果

2.1?胡黃連苷對OGD/R后SH-SY5Y細胞形態(tài)學(xué)的影響

對照組細胞大部分正常貼壁生長，僅少量半貼壁，漂浮細胞數(shù)量較少，細胞形態(tài)呈兩極或多極，細胞突起明顯，細胞之間相互交織成網(wǎng)狀，細胞膜光滑、完整，胞體折光性較強。與對照組相比較，模型組細胞的間隙變大，部分細胞形狀不規(guī)則，細胞皺縮，細胞質(zhì)凝聚，細胞突起明顯減少，貼壁細胞數(shù)量明顯減少，部分細胞團脫落，胞體折光性下降，部分細胞裂解成碎片。胡黃連苷組在藥物濃度為20～80 μmol/L時細胞狀態(tài)較好，OGD/R導(dǎo)致的SH-SY5Y細胞形態(tài)變化明顯減輕。雖然細胞間隙增大、突起有所回縮，但是細胞數(shù)量比模型組明顯增加，細胞貼壁性增強，可觀察到正常形態(tài)細胞，大部分細胞呈長梭形或三角形，少部分細胞皺縮變形或脫壁，細胞碎片與模型組相比明顯減少，生長狀態(tài)有明顯改善。其中藥物濃度為20、40 μmol/L時細胞形態(tài)較好、貼壁能力較強，兩個濃度組細胞形態(tài)無明顯差異;當(dāng)藥物濃度為80 μmol/L時細胞間隙增大。根據(jù)劑量最小化和療效最大化的原則，胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ均選擇以20 μmol/L為最佳劑量。見圖1。

2.2?胡黃連苷對OGD/R后SH-SY5Y細胞存活率的影響

經(jīng)過OGD/R處理后模型組的細胞存活率較對照組顯著下降，差異均有顯著性（F=101.9～364.1，t=20.66～38.15，P<0.01）;與模型組、胡黃連苷5 μmol/L組相比較，胡黃連苷20、40、80 μmol/L組的細胞存活率明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.71～8.84，P<0.05）;但是20、40、80 μmol/L的胡黃連苷對細胞存活率的影響差異無顯著性（P>0.05）。根據(jù)劑量最小化和療效最大化的原則，胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ均選擇以20 μmol/L為最佳劑量。見圖2。

2.3?胡黃連苷對OGD/R后SH-SY5Y細胞損傷程度的影響

與模型組相比，胡黃連苷Ⅰ 20、40、80 μmol/L組和胡黃連苷Ⅲ 20、40、80 μmol/L組SH-SY5Y細胞的LDH釋放量明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=156.7～252.0，t=8.19～13.78，P<0.01）;而胡黃連苷Ⅰ 20、40、80 μmol/L組間和胡黃連苷Ⅲ 20、40、80 μmol/L組間比較差異無顯著性（P>0.05）。胡黃連苷Ⅱ 40、80 μmol/L組SH-SY5Y細胞的LDH釋放量與模型組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=94.4，t=16.12、16.89，P<0.01）。根據(jù)劑量最小化和療效最大化的原則，胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅲ均選擇以20 μmol/L為最佳劑量，胡黃連苷Ⅱ則選擇以40 μmol/L為最佳劑量。見圖3。

2.4?胡黃連苷對OGD/R后SH-SY5Y細胞ROS水平的影響

與對照組相比較，OGD/R各組SH-SY5Y細胞的ROS水平均有顯著升高（F=385.7～630.0，t=35.41～43.78，P<0.01）。與模型組相比較，胡黃連苷20、40、80 μmol/L組SH-SY5Y細胞的ROS水平均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=12.80～31.39，P<0.01），而胡黃連苷5、10 μmol/L組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），胡黃連苷40、80 μmol/L組間比較差異無顯著性（P>0.05）。根據(jù)劑量最小化和療效最大化的原則，胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ均選擇以40 μmol/L為最佳劑量。見圖4。

2.5?胡黃連苷組合優(yōu)化對OGD/R后SH-SY5Y細胞的影響

按照上述細胞形態(tài)學(xué)、細胞存活率、LDH釋放量和ROS水平結(jié)果，胡黃連苷Ⅰ最佳劑量分別為20、20、20、40 μmol/L，胡黃連苷Ⅱ最佳劑量分別為20、20、40、40 μmol/L，胡黃連苷Ⅲ最佳劑量分別為20、20、20、40 μmol/L。對各指標(biāo)進行綜合分析，從用藥劑量最小化和療效最大化的角度考慮，選用胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ的最佳劑量為20 μmol/L進行后續(xù)實驗。

光學(xué)顯微鏡下觀察，胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ聯(lián)合用藥組細胞狀態(tài)最好，較其他組改善更加明顯，OGD/R導(dǎo)致的SH-SY5Y細胞損傷明顯減輕，雖然細胞突起有所回縮，但是大部分細胞呈長梭形或三角形，貼壁性較其他組好，少部分細胞皺縮變形或脫壁，細胞碎片與模型組相比明顯減少。見圖5。胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ聯(lián)合應(yīng)用組細胞存活率、LDH漏出率、ROS水平結(jié)果也優(yōu)于其他組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=82.9～186.3，t=2.64～40.17，P<0.05）。見表1。

3?討?論

腦卒中具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率的特點，是導(dǎo)致全球成年人死亡的主要原因之一[22-23]。腦缺血的主要發(fā)病機制為腦局部組織血流量減少導(dǎo)致氧氣和葡萄糖輸送不足以支持細胞代謝需求[24]。腦缺血再灌注損傷是指腦組織缺血后重新獲得血流灌注或者氧氣供應(yīng)后產(chǎn)生的一系列損傷和功能障礙，從而引起神經(jīng)元不可逆性損傷或死亡[25]。研發(fā)能夠減輕再灌注損傷的神經(jīng)保護藥物至關(guān)重要。

胡黃連是我國傳統(tǒng)中藥，別名割孤露澤、胡連，始載于《唐本草》，功效退虛熱、消疳熱、清熱燥濕、瀉火解毒[26]。胡黃連苷的主要有效成分是環(huán)烯醚萜苷[27-28]。既往有研究結(jié)果表明，在腦缺血再灌注損傷中，胡黃連苷Ⅱ具有抗炎、抗氧化、減輕興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性、抑制神經(jīng)元細胞凋亡[29]和神經(jīng)營養(yǎng)的作用[30]。

研究表明，缺血再灌注損傷與氧化應(yīng)激反應(yīng)密不可分[31]。神經(jīng)元因抗氧化防御能力弱，維持能量穩(wěn)態(tài)能力較低，極易遭受氧化應(yīng)激損傷[32]。測定神經(jīng)細胞的存活率是檢測神經(jīng)保護藥物作用的常用實驗方法[33]。正常情況下LDH不能通過細胞膜，但當(dāng)細胞膜受到損傷時，漏出到培養(yǎng)液中的LDH增加，故LDH釋放量可作為細胞膜完整性的標(biāo)志物，與細胞損傷程度呈正相關(guān)[34]。當(dāng)體內(nèi)腦缺血再灌注或體外OGD/R損傷時，細胞的凋亡通常伴隨著細胞膜結(jié)構(gòu)的破壞，細胞通透性上升。

本研究結(jié)果顯示，胡黃連苷對SH-SY5Y細胞OGD/R損傷具有保護作用，且胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ在20 μmol/L時效果最好。胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ各20 μmol/L聯(lián)合用藥，系最佳級聯(lián)優(yōu)化組合。胡黃連苷可能通過抗氧化應(yīng)激發(fā)揮神經(jīng)保護作用，因此胡黃連苷可能是治療腦缺血再灌注損傷有效且有潛力的藥物。胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅲ的最佳劑量及聯(lián)合應(yīng)用優(yōu)化尚未有研究報道，本文結(jié)果對減輕缺血低氧引起的神經(jīng)細胞損傷和保護治療機制研究具有重要的價值，對進一步了解胡黃連苷的神經(jīng)保護作用具有重要意義。

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（本文編輯?馬偉平）