王立超，陳鳳毛*，仇才樓，唐進根，丁學(xué)農(nóng)，任吉星

(1.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210037；2.江蘇省森林病蟲害防治檢疫站，江蘇 南京 210036；3.江蘇省東臺林場，江蘇 鹽城 224200)

坡面方胸材小蠹(Euwallaceainterjectus)，原屬于鞘翅目(Coleoptera)小蠹科(Scolytidae)材小蠹族(Xyleborini)材小蠹屬(xyleborus)[1]，后因材小蠹屬蟲數(shù)眾多且不同小蠹生活習(xí)性和形態(tài)特征多樣，1980年Wood[2]將材小蠹屬提升，并對材小蠹屬內(nèi)昆蟲重新進行分類，坡面材小蠹、闊面方胸小蠹(E.validus)以及小圓方胸小蠹(E.fornicatus)等也逐漸由材小蠹屬歸類到方胸材小蠹屬(Euwallacea)之中。此外，小蠹科也由原先獨立的科級分類單元降級為象蟲科下的一個亞科單元[3]。因此，目前坡面方胸材小蠹分類地位屬于鞘翅目，象甲科(Curculionidae)小蠹亞科(Scolytinae)方胸材小蠹屬。

方胸材小蠹屬昆蟲具有很強的入侵性，中國、日本、美國等國家口岸曾多次截獲多種隨木材調(diào)運的方胸材小蠹屬昆蟲，其中包括坡面方胸材小蠹[4]。據(jù)文獻報道坡面方胸材小蠹為東亞本土物種，目前分布在美國、日本、阿根廷、泰國、馬來西亞、孟加拉國等地[5-10]，于1976年在美國紐約地區(qū)發(fā)現(xiàn)，2011年首次報道在泰國橡膠樹中發(fā)現(xiàn)該小蠹，2019年在阿根廷枯死楊樹內(nèi)第1次發(fā)現(xiàn)該小蠹蟲分布。有文獻記載坡面方胸材小蠹在我國境內(nèi)有分布，也曾多次在來自馬來西亞、菲律賓、新加坡等國家的木材中發(fā)現(xiàn)該小蠹蟲[8,11-12]?，F(xiàn)有文獻資料表明坡面方胸材小蠹已在我國江蘇、安徽、浙江等地區(qū)分布[13-15]，而國內(nèi)尚有大部分地區(qū)有寄主植物分布，因此該小蠹蟲在國內(nèi)仍存在進一步擴散的可能。

由于小蠹蟲自身體型小，且近似種之間差異不明顯，因此很難用肉眼準(zhǔn)確鑒定，如坡面方胸材小蠹和闊面方胸材小蠹十分相似，兩者區(qū)別僅在于小蠹蟲鞘翅斜面上第2溝間部齒瘤分布特征[5]，造成小蠹蟲種類鑒定困難；此外若在檢疫過程中僅有幼蟲或小蠹蟲殘體存在，此時小蠹蟲的形態(tài)檢疫則根本無法進行。如今，分子生物學(xué)技術(shù)逐漸運用到小蠹蟲鑒定工作中，已有文獻報道用于小蠹蟲分子鑒定的基因有線粒體基因COI、核糖體基因28S rDNA、核蛋白編碼基因CAD和ArgK基因以及延長因子基因EF-1α[16]，但是國內(nèi)對小蠹蟲分子鑒定研究較少[15,17]，對坡面方胸材小蠹的研究更是鮮見[4,18]。

2019年7月，在江蘇省東臺林場有大量楊樹死亡，調(diào)查中發(fā)現(xiàn)一種小蠹蟲，數(shù)量十分龐大。但由于其體型小，加之小蠹蟲不同種類間的形態(tài)相似，難以準(zhǔn)確區(qū)分。為此采用形態(tài)和分子生物學(xué)技術(shù)對枯死楊樹內(nèi)小蠹蟲的種類進行鑒定，同時對該小蠹蟲在中國境內(nèi)的分布進行風(fēng)險評估，以期為準(zhǔn)確識別坡面方胸材小蠹及防控該小蠹蟲進一步傳播提供參考。

1 材料與方法

1.1 小蠹蟲采集及形態(tài)鑒定

2019年8月1在江蘇省鹽城東臺林場(120°48′E，32°43′N)枯死楊樹中選擇有大量小蠹蟲蛀道的樹干，截取厚約為20 cm的圓盤置于泡沫盒中(425 mm ×300 mm×245 mm)，保存于南京林業(yè)大學(xué)江蘇省有害生物預(yù)防與控制重點實驗室，待小蠹蟲羽化后收集該蟲并浸泡于75% 酒精溶液中，將其命名為JSYC-beetle，以備后續(xù)形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定試驗使用。

將采集的小蠹蟲置于SteREO Discovery V28蔡司體視顯微鏡(德國卡爾蔡司公司)下拍照，記錄小蠹蟲頭部、前足、前胸背板等主要形態(tài)特征，并對小蠹蟲鞘翅和前胸背板進行形態(tài)測定，其中雌蟲測量20頭，雄蟲測量1頭，使用Photoshop CS 6.0對照片進行處理。

1.2 小蠹蟲基因組DNA提取

采用CTAB法提取小蠹蟲基因組DNA[19]，主要步驟如下：①液氮研磨小蠹蟲至粉末狀，置于1.5 mL 離心管中，加入100 μL 2× CTAB，10 μL二硫蘇糖醇(DTT)和 4 μL的蛋白酶，浸沒小蠹蟲粉末；②渦旋混勻，65 ℃金屬浴裂解45 min；③加入等體積氯仿/異戊醇(體積比 24∶1)，12 000 r/min 離心 20 min；④取上清，加入 300 μL 冰凍異丙醇混勻，室溫條件下靜置 30 min；⑤12 000 r/min離心 30 min，棄上清液，70%(體積分?jǐn)?shù))酒精洗滌自然風(fēng)干后加20 μL去離子水溶解DNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物序列

選取常用基因引物包括COI、28S rDNA以及CAD等對枯死楊樹內(nèi)小蠹蟲基因組DNA進行擴增，擴增引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，具體引物堿基序列見表1[13]。

表1 COI、28S rDNA和 CAD引物序列Table 1 Primers sequence of COI，28S rDNA and CAD

1.4 PCR擴增

PCR反應(yīng)體系50 μL：2 μL的正向引物，2 μL的反向引物，2 μL的模板，25 μL 2×PCR MIX和19 μL ddH20。其中COI擴增程序為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，45 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃條件下延伸10 min。28SrDNA的擴增程序為：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。CAD擴增程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.5 電泳檢測

取PCR擴增產(chǎn)物8 μL，用1.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物(電壓為80V，電泳時間為45 min)，GelRed 染色，置凝膠于302 nm 透射紫外燈上觀察、拍照。

1.6 序列比對以及系統(tǒng)發(fā)育樹的制作

3個基因的PCR擴增產(chǎn)物送由上海生工生物工程公司測序。用DNAMAN 6.0軟件對每個基因正反向測序的結(jié)果進行拼接，得到完整序列。將得到的3個基因序列分別在NCBI網(wǎng)站上進行BLAST 相似性比對，查看相似性數(shù)據(jù)。使用MEGA 6軟件，以NJ法構(gòu)建小蠹蟲COI、28S rDNA和CAD的系統(tǒng)發(fā)育樹，其中COI外群為Ipswoodi，28S rDNA和CAD的外群為Ipsacuminatus。

1.7 坡面方胸材小蠹在中國的風(fēng)險評估

根據(jù)林業(yè)有害生物風(fēng)險分析指標(biāo)體系[20-21]，依據(jù)坡面方胸材小蠹在國內(nèi)分布 (P1)，傳入、定殖和擴散可能性(P2)，潛在危害(P3)，受害寄主經(jīng)濟重要性(P4)以及危險性管理難度(P5)等5 個準(zhǔn)則層(Pi)分別對其評價賦分，由綜合評判公式最終確定其風(fēng)險值(R)，綜合評判公式如下:

P1=P11;

P3=0.4×P31+0.4×P32+0.2×P33;

P4=max(P41,P42,P43);

P5=(P51+P52+P53)/3;

風(fēng)險分級標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定按照:2.5 ≤R<3.0 為特別危險，2.0 ≤R<2.5為高度危險，1.5 ≤R<2.0 為中度危險，1.0 ≤R<1.5 為低度危險。

2 結(jié)果與分析

2.1 坡面方胸材小蠹的形態(tài)鑒定

經(jīng)觀測發(fā)現(xiàn)(表2，圖1)，雌蟲體色紅褐色至黑色(圖1)，體長3.3～3.7 mm，寬1.49～1.64 mm(表2);雄蟲體色黃褐色(圖1)，體長2.264 mm，寬1.195 mm。該小蠹蟲體金屬光澤強，觸角鞭節(jié)5節(jié)，第1節(jié)長度小于其余各節(jié)，觸角末節(jié)球狀，有2條明顯的橫縫，復(fù)眼腎形，從小蠹蟲的背面看不到頭部，頭部無喙，前胸背板近方形狀，凸出明顯，前緣闊圓形，寬略大于長，前半部分分布鱗狀齒，后半部分光滑。小盾片舌狀，鞘翅寬略大于前胸背板的寬度，鞘翅斜面從基部至端部逐漸傾斜，鞘翅輪廓如舌，鞘翅列間部上的刻點與溝內(nèi)刻點大小相近，分布均勻，鞘翅茸毛長。前足脛節(jié)具有8～14個齒瘤不等，第1跗節(jié)小于其余跗節(jié)長度之和，依據(jù)以上形態(tài)特征初定為坡面方胸材小蠹(圖1)。

表2 坡面方胸材小蠹形態(tài)指標(biāo)測量值Table 2 The measurement value of E. interjectus mm

A-C. 雄蟲male; D-F. 雌蟲female; A+D. 背面觀dorsal view; B+E. 側(cè)面觀lateral view; C+F. 腹面觀ventral view。圖1 坡面方胸材小蠹形態(tài)Fig.1 Optical photograph of E. interjectus

2.2 PCR擴增結(jié)果

以坡面方胸材小蠹基因組DNA為模版，分別對COI、28S rDNA和CAD基因進行擴增，電泳結(jié)果表明(圖2)，3對引物均能擴增出單一、明亮條帶。其中COI基因擴增引物擴增出的條帶大小為700～1 000 bp，28S rDNA基因擴增引物擴增出的條帶大小約為500 bp,CAD基因擴增引物擴增出的條帶大小為400～500 bp。

M. DL 1 000 DNA marker; 1. COI; 2. 28S rDNA; 3. CAD.圖2 坡面方胸材小蠹基因擴增結(jié)果Fig.2 Amplification results of E. interjectus gene

2.3 NCBI序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析

經(jīng)NCBI 序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹的分析結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，該小蠹蟲3個基因測序序列在NCBI基因庫中均與坡面方胸材小蠹E.interjectus相關(guān)基因的相似度最高(其中COI基因比對相似度為99.14%；28S rDNA 基因比對相似度為99.38%；CAD基因比對相似度為99.36%)?；贑OI、28S rDNA和CAD，采用NJ法構(gòu)建小蠹的系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示：本試驗收集的小蠹蟲JSYC-beetle 蟲株均與坡面方胸材小蠹(E.interjectus)聚在一個分支上(圖3)，進一步確證形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，即本試驗收集的小蠹蟲JSYC-beetle蟲株為坡面方胸材小蠹。

圖3 基于鄰接法構(gòu)建的坡面方胸材小蠹系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Neighbor-joining tree of E. interjectus

2.4 坡面方胸材小蠹在中國的風(fēng)險分析

坡面方胸材小蠹在綜合評價賦分體系中的具體賦分值及賦分理由如表 3 所示。經(jīng)計算，各準(zhǔn)則層P1= 1.8，P2= 1.9，P3= 1.88，P4=2.5，P5=2.06，最終計算出風(fēng)險值R=2.01，對照風(fēng)險分級標(biāo)準(zhǔn)，坡面方胸材小蠹在中國流行風(fēng)險性較高，需加強檢疫。

表3 坡面方胸材小蠹多指標(biāo)綜合評價體系Table 3 The index layer evaluation of integrated multi index evaluation system for E. interjectus

3 討 論

小蠹蟲是一類重要的蛀干害蟲，根據(jù)其食性可分為樹皮小蠹和食菌小蠹。方胸材小蠹是唯一能培養(yǎng)真菌的食菌小蠹，是食菌小蠹蟲中典型代表，方胸材小蠹可幫助鐮刀菌擴散和繁殖，而小蠹培養(yǎng)的鐮刀菌則可作為幼蟲和成蟲的食物資源，兩者之間形成強烈的共生關(guān)系，稱之為鐮刀菌-方胸材小蠹共生體(Fusarium-Euwallaceamutualism)[22]。雖然鐮刀菌為弱寄生菌，但是可以在多種植物上引起植物枯萎病[23-25]，已有文獻報道小圓方胸小蠹和小圓方胸小蠹近似種(Euwallaceanr.fornicatus)攜帶的鐮刀菌在Platanus×acerifolia和Perseaamericana上引起嚴(yán)重枯萎病[26-27]，但前提是需要攜帶鐮刀菌的小蠹蟲入侵寄主植物。此外，日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)坡面方胸材小蠹可以攜帶無花果角孢菌(Ceratocystisficicola)，該病原物可以引發(fā)無花果樹(Ficuscarica)產(chǎn)生一種系統(tǒng)性病害無花果潰瘍病，由于前期對無花果潰瘍病的流行規(guī)律認(rèn)識不足，導(dǎo)致該病害已在日本果園廣泛存在，對當(dāng)?shù)氐墓麍@造成重大經(jīng)濟損失[28]。因此在日本坡面方胸材小蠹被認(rèn)為是果園中的一種毀滅性害蟲，至今沒有良好的防控措施。

方胸材小蠹屬昆蟲一直被認(rèn)為是次期性害蟲，不會危害健康寄主植物，但隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)方胸材小蠹屬昆蟲也可能危害健康寄主植物[22]。2019年，在阿根廷報道種植美洲黑楊(Populusdeltoides)上發(fā)現(xiàn)坡面方胸材小蠹，該研究同時指出坡面方胸材小蠹可以危害健康寄主[6]。而本次試驗所鑒定的坡面方胸材小蠹從江蘇東臺枯死楊樹中收集，林場內(nèi)出現(xiàn)大量的楊樹死亡，推測可能是由坡面方胸材小蠹以及攜帶的病原微生物所致。楊樹作為我國主要的材用樹種，因生長速度快、適應(yīng)能力強，在我國大面積種植，具有重要的經(jīng)濟和生態(tài)價值[29]。坡面方胸材小蠹雖曾多次在調(diào)運木材發(fā)現(xiàn)，但未被列入檢疫名單，而且該小蠹蟲體積小，寄生在寄主植物體內(nèi)，因此在檢疫和防治工作中容易被忽略。若坡面方胸材小蠹可以直接危害健康楊樹，則會對北方楊樹安全構(gòu)成威脅。對坡面材小蠹在中國風(fēng)險分析表明，該生物在中國屬于高危物種，需要加強檢疫。

坡面方胸材小蠹目前在國內(nèi)雖有，但尚未爆發(fā)成災(zāi)，因此國內(nèi)對坡面方胸材小蠹研究較少。本研究以坡面方胸材小蠹為材料，通過傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)對該小蠹進行鑒定，為將來防治坡面方胸材小蠹提供支持，但對于坡面方胸材小蠹的具體防治措施還需要建立在小蠹蟲生活習(xí)性、危害特征以及傳播規(guī)律的基礎(chǔ)之上，因此還需要對坡面方胸材小蠹進行深入研究。