唐清蘭，周 利，徐姿靜

(四川劍南春集團(tuán)有限責(zé)任公司，四川綿竹 618200)

大曲在濃香型白酒釀造中起著接種微生物、投糧、糖化發(fā)酵和生香的作用，它的質(zhì)量好壞直接影響到白酒的產(chǎn)量和質(zhì)量，是傳統(tǒng)固態(tài)白酒釀造的物質(zhì)基礎(chǔ)[1-2]。由于大曲的制作過程是敞開式、自然接種，且制曲過程長(zhǎng)達(dá)數(shù)月，因此富集在其中的微生物種類和數(shù)量與環(huán)境、水分、溫度等條件息息相關(guān)。因此，大曲培養(yǎng)過程是一個(gè)復(fù)雜的微生物動(dòng)態(tài)變化過程，微生物種類和數(shù)量在此過程中此消彼長(zhǎng)，賦予了大曲糖化、發(fā)酵和生香等功能，為釀酒發(fā)酵提供動(dòng)力[3-4]。

大曲微生物主要有細(xì)菌和真菌兩大類，其中真菌在釀酒過程的產(chǎn)酒、產(chǎn)酶、產(chǎn)香等方面起到重要作用，因此大曲真菌的研究是釀酒微生物體系研究中不可忽視的環(huán)節(jié)[5]。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的發(fā)展，高通量測(cè)序等技術(shù)廣泛應(yīng)用于大曲微生物的研究，該方法可以檢測(cè)到相對(duì)豐度較低的微生物以及不可培養(yǎng)的微生物，克服了傳統(tǒng)可培養(yǎng)技術(shù)操作繁瑣、準(zhǔn)確性差、局限性大等缺點(diǎn)，能夠客觀地認(rèn)識(shí)大曲復(fù)雜的微生物群落結(jié)構(gòu)及其變化規(guī)律，挖掘更多的生物學(xué)信息[6-8]。施思等[9]利用高通量測(cè)序?qū)庀阈痛笄A藏階段的真菌多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)大曲真菌群落結(jié)構(gòu)不斷變化，畢赤酵母屬、根霉屬和恒梗霉屬為最終優(yōu)勢(shì)菌群。夏玙等[10]研究了貯藏期不同干燥方式和不同儲(chǔ)存方式對(duì)大曲真菌群落的影響。吳樹坤等[11]對(duì)四川不同地區(qū)的濃香型大曲微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)不同區(qū)域的微生物群落結(jié)構(gòu)確實(shí)存在差異，遂寧大曲的真菌多樣性比宜賓和瀘州的要豐富。目前，很多關(guān)于濃香型白酒大曲真菌微生物群落結(jié)構(gòu)的報(bào)道都集中在大曲制曲過程的某個(gè)階段或某個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，而本實(shí)驗(yàn)則是跟蹤研究濃香型白酒大曲整個(gè)制曲過程，在不同時(shí)間點(diǎn)取樣分析，剖析濃香型白酒大曲從入房發(fā)酵到成品可用這個(gè)過程的真菌微生物群落結(jié)構(gòu)變化，為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)濃香型大曲和揭示濃香型白酒微量風(fēng)味物質(zhì)形成原因提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

曲樣：劍南春不同制曲階段大曲。

耗 材：引 物ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA），引物ITS2R（GCTGCGTTCTTCATCGATGC），Soil DNA Kit試劑盒（OMEGA）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

濃香型大曲曲醅壓制成型后堆入房間進(jìn)行培菌，在第2 d、5 d、12 d、24 d 取樣，分別命名為N_2d、N_5d、N_12d和N_24d；接著多層堆碼進(jìn)行入庫儲(chǔ)存，此階段在入庫、貯存1 個(gè)月、貯存3 個(gè)月3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，分別命名為N_R、N_Z1 和N_Z3，儲(chǔ)存結(jié)束后可用于釀酒生產(chǎn)的是成品曲，取樣并命名為N_C。整個(gè)過程共取樣8 個(gè)，所有樣本在取樣后立即用干冰冷凍。

采用引物ITS1F 和ITS2R 對(duì)真菌ITS 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，并高通量測(cè)序，每個(gè)樣品做3 個(gè)平行，進(jìn)行真菌微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀釋曲線（圖1）

圖1 稀釋曲線

圖1 是以Chao 指數(shù)來反映本實(shí)驗(yàn)中濃香型白酒大曲不同制曲階段樣本的真菌稀釋曲線，Chao指數(shù)常用來估計(jì)物種總數(shù)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)8 個(gè)不同發(fā)酵期的濃香型大曲進(jìn)行測(cè)序，在97%相似度的OTU 水平進(jìn)行Chao 指數(shù)計(jì)算，每個(gè)樣本的測(cè)序深度為43757 條序列。由圖1 可以看出，隨著測(cè)序深度增加，Chao 指數(shù)曲線逐步趨于平緩，說明本實(shí)驗(yàn)測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，可以代表樣本的真菌微生物多樣性信息。

2.2 多樣性指數(shù)（表1）

表1 Alpha多樣性指數(shù)

表1 為濃香型白酒大曲不同制曲階段真菌Alpha 多樣性指數(shù)，本試驗(yàn)通過Coverage、Shannon、Simpon、Ace 和Chao 5 個(gè)指標(biāo)對(duì)大曲真菌群落Alpha 多樣性進(jìn)行分析。可以看出，各樣本Covergae≥0.9997，說明本次測(cè)定結(jié)果能夠真實(shí)地反映樣本中真菌的多樣性。不同制曲階段的大曲真菌多樣性指數(shù)均存在差異，Shannon 和Simpson 反映樣本中真菌物種多樣性，結(jié)果表明，物種種類在制曲過程中不斷變化。Ace 和Chao 指數(shù)反映樣本中真菌群落的豐富度，可以看出，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，真菌豐富度呈先下降后緩慢增加的趨勢(shì)。綜合分析，發(fā)酵12 d 到入庫這個(gè)階段是制曲轉(zhuǎn)折期，此階段因?yàn)榇笄鷾囟壬?、水分下降等原因，生長(zhǎng)條件變得嚴(yán)苛，不適合生長(zhǎng)的微生物不斷消亡，而利于生長(zhǎng)的微生物逐步富集。

2.3 不同制曲階段Venn圖（圖2）

圖2 屬水平下不同制曲階段大曲Venn圖

圖2 是屬水平下不同制曲階段濃香型白酒大曲的真菌Venn 圖，重疊部分的數(shù)字代表不同制曲階段的大曲共有物種數(shù)量，非重疊部分的數(shù)字代表各階段特有物種數(shù)量，由圖2 可知，有12 種真菌微生物為各階段所共有，其中第2 天和第12 天特有物種數(shù)分別為6 種和4 種，其他階段特有物種數(shù)≤2，說明整個(gè)制曲階段真菌微生物種類進(jìn)行著動(dòng)態(tài)變化，但多數(shù)微生物種類保持一致。

2.4 真菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 門水平下真菌群落結(jié)構(gòu)分析（圖3）

圖3 門水平下不同制曲階段大曲真菌組成圖

圖3 是門水平下不同制曲階段濃香型白酒大曲真菌組成圖，可以看出子囊菌門（Ascomycota）占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，豐度值均在98.8%以上，毛霉菌門（Mucoromycota）在不同制曲階段均被檢出，但是含量極低。

2.4.2 屬水平下真菌群落結(jié)構(gòu)分析（圖4）

圖4 為濃香型白酒大曲不同制曲階段在屬水平上的真菌群落組成圖。伊薩酵母屬（Issatchenkia）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、曲霉屬（Aspergillus）、假絲酵母屬（Candida）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）、紅曲霉屬（Monascus）、粉狀米勒氏酵母屬（Millerozyma）、釀酒酵母屬（Saccharomycopsis）均被檢出。其中，伊薩酵母屬（Issatchenkia）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、曲霉屬（Aspergillus）分別在制曲過程不同時(shí)期占據(jù)主導(dǎo)地位。

圖4 屬水平下不同制曲階段大曲真菌組成圖

伊薩酵母屬（Issatchenkia）廣泛存在于釀酒生產(chǎn)中，有較高的產(chǎn)乙醇和產(chǎn)酯能力。該菌在發(fā)酵前12 d 占主導(dǎo)地位，第2 天豐度值最高，為89.6%，之后逐步降低，第12 天降為59.5%，后面幾個(gè)階段均較低，儲(chǔ)存1 個(gè)月、3 個(gè)月豐度分別為8.4%和1.5%。分析出現(xiàn)此現(xiàn)象是因?yàn)榕囵B(yǎng)初期大曲溫度較低、水分適中，適于酵母菌的生長(zhǎng)繁殖，因此數(shù)量較高，隨著發(fā)酵進(jìn)行，大曲溫度升高，水分減少，不利于酵母菌的生長(zhǎng)，酵母菌數(shù)量急劇下降。

嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）和嗜熱真菌屬（Thermomyces）均是嗜熱菌，該類微生物耐高溫，其最低生長(zhǎng)溫度為20 ℃或20 ℃以上，最高生長(zhǎng)溫度為50 ℃或50 ℃以上，可產(chǎn)生嗜熱酶，包括纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等，這些嗜熱酶在高溫條件下保持極好穩(wěn)定性，有利于大曲產(chǎn)酒生香作用。濃香型大曲為中高溫大曲，在制曲階段溫度可到50 ℃以上，這為嗜熱真菌的生長(zhǎng)和繁殖提供了良好條件，有研究發(fā)現(xiàn)，嗜熱真菌廣泛存在于濃香型大曲中[12-14]。其中，嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）在發(fā)酵第5 天開始出現(xiàn)，發(fā)酵24 d 時(shí)豐度最高，可達(dá)94.1%，隨后降低，最后成品曲中達(dá)46.4%。嗜熱真菌屬（Thermomyces）在第12、24 天，入庫3 個(gè)月和成品曲中豐度值分別為2.6%、3.1%、4.3%和0.9%，其他階段幾乎未被檢出。嗜熱菌的存在正體現(xiàn)了制曲溫度對(duì)大曲品質(zhì)的影響。

曲霉屬（Aspergillus）是大曲中種類眾多的一類微生物，耐糖和耐鹽能力強(qiáng)，糖化酶系發(fā)達(dá)，主要為大曲提供糖化力、液化力、蛋白質(zhì)分解能力及多種有機(jī)酸等物質(zhì)。整個(gè)階段其數(shù)量幾乎呈增加趨勢(shì)，儲(chǔ)存3 個(gè)月時(shí)達(dá)到高峰，豐度為74.4%，成品曲中達(dá)52.3%。

假絲酵母屬（Candida）具有產(chǎn)乙醇和產(chǎn)香能力，能發(fā)酵生成多元醇和呋喃酮類，豐度在整個(gè)發(fā)酵期呈下降趨勢(shì)，在第2、5、12 天分別為9.4%、1.7%和2.6%，其他階段含量極低。

紅曲霉屬（Monascus）為腐生真菌，嗜乳酸，能產(chǎn)生糖化酶、淀粉酶，也能產(chǎn)生辛酸、癸酸、月桂酸、豆蔻酸、油酸、亞油酸以及相應(yīng)乙酯等微量成分，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的風(fēng)味和質(zhì)量有利。本研究發(fā)現(xiàn)，該微生物在制曲第5 天和第12 天被檢出，豐度值分別為1.7%和0.7%。

粉狀米勒氏酵母屬（Millerozyma）呈瓜子橢圓形，菌落呈白色，該菌具有一定的耐鹽性，能產(chǎn)生醇類和酮類等物質(zhì)。僅在第12 天被檢出，豐度值為2.3%。

釀酒酵母屬（Saccharomycopsis）在自然界分布甚廣，發(fā)酵過程主要產(chǎn)乙醇，同時(shí)還能生成多種有機(jī)酸、高級(jí)醇和酯類物質(zhì)，這些物質(zhì)在白酒的風(fēng)味中發(fā)揮重要作用。該菌在第12 天時(shí)豐度相對(duì)較高，為1.5%，其他階段較低。

綜上分析，伊薩酵母屬（Issatchenkia）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、曲霉屬（Aspergillus）為主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)菌。伊薩酵母屬（Issatchenkia）在制曲發(fā)酵期豐度高，而嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）和曲霉屬（Aspergillus）在儲(chǔ)存和成品階段數(shù)量較多。由此可知，制曲整個(gè)階段前期是接種酵母屬，為大曲的釀酒和生香提供菌源，制曲后面階段主要是耐高溫和曲霉類微生物的生長(zhǎng)，為大曲提供糖化、液化以及生香相關(guān)的微生物。

3 結(jié)論

本研究運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)，解析了濃香型白酒大曲整個(gè)制曲過程中的真菌菌群結(jié)構(gòu)變化。發(fā)現(xiàn)門水平下，子囊菌門（Ascomycota）占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；屬水平下，伊薩酵母屬（Issatchenkia）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、曲霉屬（Aspergillus）分別在制曲過程不同時(shí)期占據(jù)主導(dǎo)地位。通過群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)演變過程，可以剖析濃香型白酒大曲的糖化、發(fā)酵和生香等功能與微生物間的潛在關(guān)系。該技術(shù)的應(yīng)用，大大提高了對(duì)大曲微生物認(rèn)識(shí)的深度和寬度，對(duì)生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)大曲和釀造優(yōu)質(zhì)白酒具有重要意義。