張佳穎，尹藝，王哲，孫啟航，李洪娟，趙娟娟

(濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東煙臺(tái) 264003)

吳茱萸為蕓香科植物、石虎或疏毛吳茱萸的干燥近成熟果實(shí)，氣芳香濃郁，味辛辣而苦，具有清熱止痛、降逆止嘔的功效［1］，用于治療肝胃虛寒、陰濁上逆所致的頭痛或胃痛等癥狀［2-3］，并能治療消化不良、濕疹、神經(jīng)性皮炎及口腔潰瘍等多種疾病，對(duì)心血管及免疫系統(tǒng)也具有一定的藥效［4-7］。吳茱萸中含有揮發(fā)油、生物堿、檸檬苦素類(lèi)、氨基酸類(lèi)以及黃酮類(lèi)等多種有效成分［8-11］。吳茱萸揮發(fā)性成分是其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的一部分，具有抑菌殺菌、平喘、抑制麥角胺對(duì)α-受體的阻斷等作用［12-13］，其中α-蒎烯對(duì)白色念珠菌具有明顯的抑菌和殺菌作用［14］；檸檬烯具有抗腫瘤、抗炎癥、抗氧化、抗菌抑菌、祛痰平喘、利膽溶石等多種功效［15］；羅勒烯不僅能提高植物對(duì)食草類(lèi)昆蟲(chóng)及某些病原菌的抗性［16］，還對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有一定的抑制作用?，F(xiàn)有文獻(xiàn)多是對(duì)吳茱萸揮發(fā)性成分進(jìn)行分離鑒定［17-18］，而缺少對(duì)其中主要成分含量的測(cè)定研究，導(dǎo)致吳茱萸質(zhì)量控制缺少保障。在吳茱萸揮發(fā)性成分分離鑒定的基礎(chǔ)上，筆者建立氣相色譜法對(duì)吳茱萸中羅勒烯、檸檬烯、α-蒎烯3 種揮發(fā)性成分進(jìn)行含量測(cè)定，并通過(guò)聚類(lèi)分析比較了4 個(gè)產(chǎn)地9 批吳茱萸藥材樣品中3 種揮發(fā)性成分的含量差異，為吳茱萸的全面質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜儀：7890B 型，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

集熱式攪拌器：DF-101S 型，金壇市科析儀器有限公司。

調(diào)溫加熱套：DRT-TW 型，鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

電子分析天平：TB-215D 型，感量為0.01 mg，丹佛儀器北京有限公司。

α-蒎烯、檸檬烯、羅勒烯對(duì)照品：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）均大于95%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

乙酸乙酯：色譜純，批號(hào)為20160513，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

無(wú)水硫酸鈉：分析純，批號(hào)為11528044，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

吳茱萸：收集于不同產(chǎn)地，如江西、陜西、貴州、浙江等。

實(shí)驗(yàn)用水為純水。

1.2 溶液的制備

1.2.1 對(duì)照品溶液與混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

分別稱(chēng)取α-蒎烯50 mg、檸檬烯1 500 mg 及羅勒烯250 mg，置于同一50 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并定容，搖勻，得混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。分別移取不同體積的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液于一組10 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯稀釋至標(biāo)線(xiàn)，搖勻，得到一系列不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于4℃條件下保存，待測(cè)。

1.2.2 供試品溶液

按照2020 版《中國(guó)藥典》（4 部）中揮發(fā)油測(cè)定法（甲法）提取揮發(fā)油。稱(chēng)取吳茱萸50 g，置于2 000 mL 圓底燒瓶中，加入10 倍量水浸泡12 h，揮發(fā)油提取器蒸餾水上部精密加入3 mL 乙酸乙酯，加熱保持微沸狀態(tài)6 h，冷卻至室溫后，取乙酸乙酯層于10 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯定容，加入1 g 無(wú)水Na2SO4脫水，用微孔濾膜過(guò)濾，即得。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 揮發(fā)油成分鑒定

（1）色譜條件。色譜柱：DB-5 柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司)；升溫程序：0～2 min 保持溫度為60 ℃，2～29.5 min 以8℃／min 的速率升至280 ℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；分流比：10∶1；載氣：氦氣，流量為1.2 mL／min；進(jìn)樣體積：1 μL。

（2）質(zhì)譜條件。離子源：EI 源；掃描時(shí)間：3.5 min；載氣：甲烷，流量為1.0 mL／min；四級(jí)桿溫度：280 ℃；離子源溫度：300 ℃；質(zhì)量范圍：60～600 Da。

1.3.2 3 種揮發(fā)性成分含量測(cè)定

色譜柱：HP-5 彈性石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司)；檢測(cè)器：FID；升溫程序：0～5 min，保持60 ℃，5～15 min，以4 ℃／min 的速率升至100 ℃；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；檢測(cè)器溫度：310 ℃；分流比：20∶1；載氣：高純氮?dú)?，流量? mL／min；尾吹氣流量：45 mL／min；進(jìn)樣體積：1 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法選擇

揮發(fā)油的提取方法有水蒸氣蒸餾法（SD）、索氏提取法（SE)、超臨界流體萃取法（SFE)、微波輔助萃取法（MAE)等。水蒸氣蒸餾法具有操作簡(jiǎn)單、裝置簡(jiǎn)易、提取率高等優(yōu)點(diǎn)，是一種提取揮發(fā)油的常用方法［19-21］。2020 版《中國(guó)藥典》通則中收載了兩種測(cè)定方法，甲法適用于測(cè)定相對(duì)密度小于1.0 的揮發(fā)油；乙法適用于測(cè)定相對(duì)密度大于1.0 的揮發(fā)油。吳茱萸揮發(fā)油相對(duì)密度在1.0 以下，因此選擇水蒸氣蒸餾法提取吳茱萸藥材中的揮發(fā)油，為完善吳茱萸藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

2.2 揮發(fā)油成分鑒定

取適量供試品溶液，按照1.3.1 氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）條件進(jìn)樣測(cè)定，通過(guò)NIST 標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索進(jìn)一步確認(rèn)化合物，吳茱萸揮發(fā)油共鑒定出33 種化合物，主要為萜類(lèi)、烯醇類(lèi)、酯類(lèi)等物質(zhì)，其中含量較高的物質(zhì)為α-蒎烯、檸檬烯、羅勒烯、水芹醛、丁香酚、4-異丙基苯甲醇、石竹烯、芳樟醇、五烯酸。吳茱萸揮發(fā)油中化學(xué)成分GC-MS 法分析結(jié)果見(jiàn)表1所示。

表1 吳茱萸揮發(fā)油中化學(xué)成分GC-MS 分析結(jié)果

2.3 檢測(cè)指標(biāo)的選擇

GC-MS 法鑒定結(jié)果表明，吳茱萸中的揮發(fā)性成分主要包括倍半萜烯類(lèi)、醇類(lèi)、酯類(lèi)等物質(zhì)，其中α-蒎烯和檸檬烯是較為常見(jiàn)的倍半萜化合物，羅勒烯是一種無(wú)環(huán)單萜類(lèi)化合物，具有多種生理活性，如鎮(zhèn)咳、祛痰、抗真菌、抑制腫瘤等［14-16］，因此測(cè)定吳茱萸中α-蒎烯、檸檬烯及羅勒烯3 種揮發(fā)性成分的含量對(duì)吳茱萸的質(zhì)量控制有重要意義。

2.4 色譜圖

分別取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液，在1.3.2氣相色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，典型色譜圖見(jiàn)圖1。由圖1 可見(jiàn)，α-蒎烯、檸檬烯和羅勒烯與相鄰色譜峰分離良好，拖尾因子在0.95～1.05 之間。

圖1 對(duì)照品和吳茱萸樣品的氣相色譜圖

2.5 線(xiàn)性關(guān)系和檢出限

在1.3.2 氣相色譜條件下，對(duì)系列標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液進(jìn)行測(cè)定，記錄α-蒎烯、檸檬烯及羅勒烯的色譜峰面積。以3 種揮發(fā)性成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），以色譜峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)。按照3 倍信噪比計(jì)算方法的檢出限，α-蒎烯、檸檬烯及羅勒烯的線(xiàn)性范圍、線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見(jiàn)表2。

表2 線(xiàn)性范圍、線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

由表2 可知，3 種揮發(fā)性成分在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與色譜峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢出限為1.6～2.0 μg／mL，表明該方法靈敏度較高。

2.6 儀器精密度試驗(yàn)

取一種混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照1.3.2 氣相色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。由表3 可知，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%～1.3%，表明該儀器的精密度良好。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取適量供試品溶液，在室溫下放置0、2、4、8 h時(shí)，分別在1.3.2 氣相色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。由表4 可知，α-蒎烯、檸檬烯及羅勒烯色譜峰面積測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.8%、0.8%和1.5%，表明供試品溶液在室溫條件下8 h 內(nèi)是穩(wěn)定的。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取來(lái)源于浙江的吳茱萸樣品6 份，按1.2.2 方法制備供試品溶液，在1.3.2 氣相色譜條件下分別進(jìn)樣測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。由表5 可知，α-蒎烯、檸檬烯及羅勒烯峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.6%、1.7%、3.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

表5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.9 加標(biāo)回收試驗(yàn)

選取已知含量的吳茱萸藥材6 份，每份精密稱(chēng)定25 g，分別加入3 種對(duì)照品適量，按照1.2.2 方法分別制備含量約為100%的供試品溶液，在1.3.2 氣相色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率和方法精密度，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

由表6 可知，3 種揮發(fā)性成分的樣品加標(biāo)回收率為92.6%～103.2%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%。表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，滿(mǎn)足分析要求。

2.10 樣品含量測(cè)定

分別精密稱(chēng)取50 g 不同產(chǎn)地的吳茱萸，按1.2.2制備供試品溶液，在1.3.2 氣相色譜條件下測(cè)定，3種揮發(fā)性成分的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表7。由表7 可知，不同產(chǎn)地的吳茱萸中3 種揮發(fā)性成分含量差異較大，其中來(lái)自江西產(chǎn)地的吳茱萸中3 種揮發(fā)性成分的含量普遍偏高。

表7 不同產(chǎn)地吳茱萸中3 種揮發(fā)性成分測(cè)定結(jié)果 mg／g

2.11 聚類(lèi)分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)表7 中4 個(gè)產(chǎn)地的9 批吳茱萸所測(cè)成分進(jìn)行聚類(lèi)分析處理，用組間聯(lián)結(jié)法，以Euclidean 距離作為吳茱萸樣品的測(cè)度，9批吳茱萸揮發(fā)性成分的聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖見(jiàn)圖2。

圖2 9 批吳茱萸揮發(fā)性成分的聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖

由圖2 可知，4 個(gè)不同產(chǎn)地的9 批吳茱萸藥材可分為兩類(lèi)，其中S5 單獨(dú)為一類(lèi)，其余8 批吳茱萸藥材聚為一類(lèi)。分析發(fā)現(xiàn)S5 江西野生中花吳茱萸的揮發(fā)油含量遠(yuǎn)高于其余8 批吳茱萸藥材 ，將S5的數(shù)據(jù)去除掉之后，剩余8 批吳茱萸揮發(fā)性成分聚類(lèi)分析譜系圖見(jiàn)圖3。由圖3 可知，8 批吳茱萸分為兩大類(lèi)，第一類(lèi)：S1、S6、S7、S8 和S9；第二類(lèi)：S2、S3 和S4。

圖3 8 批吳茱萸揮發(fā)性成分的聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖

采用所建的氣相色譜法同時(shí)測(cè)定吳茱萸藥材中α-蒎烯、檸檬烯及羅勒烯3 種揮發(fā)性成分的含量。結(jié)果顯示，S5 吳茱萸中所測(cè)揮發(fā)性成分含量最高，為3.806 0%，S7 吳茱萸中所測(cè)揮發(fā)性成分含量最低，為0.067 5%，相差56 倍，其原因可能有植物遺傳作用、產(chǎn)地的生長(zhǎng)條件（海拔、水分、土壤、日照和地形等環(huán)境因素）、貯存環(huán)境等［22-24］。除去單獨(dú)成類(lèi)S5，其余8 批吳茱萸分為2 類(lèi)，S2、S3、S4 聚為一類(lèi)，這3 批藥材均產(chǎn)自江西，且3 種揮發(fā)性成分的含量高于另一類(lèi)，江西作為吳茱萸藥材的道地產(chǎn)區(qū)，緯度28°左右，經(jīng)度115°左右，海拔105 m 左右，環(huán)境適宜，生產(chǎn)的吳茱萸品質(zhì)較高；S1、S6、S7、S8、S9聚為一類(lèi)，分別產(chǎn)自陜西、貴州、浙江等地，結(jié)果表明產(chǎn)地的自然環(huán)境和種植條件對(duì)吳茱萸中揮發(fā)性成分有確切影響，因此在對(duì)吳茱萸藥材進(jìn)行質(zhì)量控制時(shí)，有必要進(jìn)行基源確證和揮發(fā)性成分的測(cè)定，以保證藥材質(zhì)量的均一性。

3 結(jié)語(yǔ)

采用氣相色譜-質(zhì)譜法鑒定出吳茱萸揮發(fā)油中的33 種化學(xué)成分，建立了同時(shí)測(cè)定吳茱萸中α-蒎烯、檸檬烯及羅勒烯3 種揮發(fā)性成分的氣相色譜法，并應(yīng)用所建方法測(cè)定了9 批不同來(lái)源的吳茱萸中α-蒎烯、檸檬烯及羅勒烯3 種成分的含量，表明不同來(lái)源和產(chǎn)地的吳茱萸藥材中3 種揮發(fā)性成分含量差異較大。對(duì)4 個(gè)不同產(chǎn)地的9 批吳茱萸所測(cè)成分進(jìn)行聚類(lèi)分析處理，結(jié)果表明產(chǎn)地對(duì)吳茱萸中揮發(fā)性成分含量具有較大的相關(guān)性，對(duì)吳茱萸質(zhì)量的均一性有影響。