程 顯 陳 碩 呂彥鵬 葛國偉 連昊宇

（1. 鄭州大學(xué)電氣工程學(xué)院 鄭州 450001 2. 河南省輸配電裝備與電氣絕緣工程研究中心 鄭州 450001）

0 引言

納秒脈沖電場是一種新興的腫瘤物理治療方法。納秒脈沖電場能夠透過細(xì)胞膜作用到細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器膜上產(chǎn)生納米級的孔洞，同時會伴隨Annexin-V綁定、Caspase激活、Cytochrome C釋放等凋亡指標(biāo)出現(xiàn)[1-7]。納秒脈沖電場治療腫瘤時，不需要藥物的參與，且避免了炎癥、潰瘍等副作用。此外，歐道明大學(xué)A. G. Pakhomov、A. Rossi等新近發(fā)現(xiàn)，納秒脈沖可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫原性死亡，激活機體抗腫瘤免疫應(yīng)答[8-9]，為納秒脈沖聯(lián)合免疫療法治療腫瘤提供了契機。

為更好地研究納秒脈沖電場作用下細(xì)胞核膜上的電穿孔效應(yīng)，麻省理工學(xué)院J. C. Weaver等采用網(wǎng)格傳輸模型仿真研究了納秒脈沖電場作用下細(xì)胞膜與細(xì)胞核膜的電穿孔效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)納秒脈沖電場能夠同時作用于細(xì)胞膜與細(xì)胞核膜上產(chǎn)生電穿孔[10]。米彥采用場-路復(fù)合模型仿真分析了細(xì)胞內(nèi)外膜跨膜電位時頻特性，發(fā)現(xiàn)納秒脈沖能夠作用于細(xì)胞核膜，并使內(nèi)膜發(fā)生穿孔，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡效應(yīng)[11]。盧布爾雅那大學(xué)D. Miklav?i?等基于有限元數(shù)值分析方法，對建立的球形單細(xì)胞的多層介電模型研究發(fā)現(xiàn)，納秒脈沖作用下細(xì)胞核膜的跨膜電壓峰值可大于細(xì)胞膜的跨膜電壓，其大小受細(xì)胞核膜及內(nèi)部基質(zhì)的結(jié)構(gòu)參數(shù)和電氣參數(shù)影響[12]。

上述文獻表明，納秒脈沖電場作用下細(xì)胞核膜是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的重要作用靶區(qū)，此外，姚陳果團隊新近的實驗與仿真研究發(fā)現(xiàn)，由于腫瘤耐藥細(xì)胞的核質(zhì)比較大，相比常規(guī)腫瘤細(xì)胞，納秒脈沖電場能夠優(yōu)先殺傷腫瘤耐藥細(xì)胞。這為臨床中殺傷耐藥細(xì)胞提供了一種新型途徑[13]。而核膜的電穿孔程度與其本身的形態(tài)等特性密切相關(guān)[4]，然而，已往的仿真研究中僅將細(xì)胞核膜簡單等效為完整的形態(tài)進行理論分析，但文獻表明，核膜上存在大量的核孔復(fù)合體（Nuclear Pore Complexes, NPC），其結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，主要結(jié)構(gòu)為胞質(zhì)環(huán)、核質(zhì)環(huán)、輻、中央栓[14-16]，中央栓是位于NPC中心的中空通道，小分子物質(zhì)可通過擴散作用自由進出，因此，具有高電導(dǎo)率的特性[17-18]。典型單個哺乳細(xì)胞核膜上有3 000～4 000個NPC，直徑40～125nm[19]，NPC的存在是否對納秒脈沖電場作用下的細(xì)胞核電穿孔效應(yīng)具有顯著性的影響目前猶未可知，因此，本文建立了考慮細(xì)胞核上NPC存在的五層細(xì)胞介電模型，分析電穿孔關(guān)鍵參數(shù)跨膜電壓、孔密度參數(shù)的時空變化特性，研究納秒脈沖作用下NPC對細(xì)胞電穿孔程度的影響，通過對比無NPC存在下細(xì)胞核膜的電穿孔程度，表明NPC的存在會使附近一定區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞核膜電穿孔狀態(tài)發(fā)生顯著性的改變，影響區(qū)域大小與NPC個數(shù)及分布相關(guān)。

1 模型建立

選用COMSOL軟件進行仿真計算，模型如圖1所示。求解域由電極、球形細(xì)胞組成，其中，電極尺寸為200μm×1μm矩形，電極間距為198μm，考慮NPC作用的細(xì)胞介電模型如圖1b所示。為減少網(wǎng)格計算量，提高仿真準(zhǔn)確度，細(xì)胞膜、核膜設(shè)置為接觸阻抗，厚度分別為5nm、40nm[20]。為研究NPC的存在對周圍細(xì)胞核膜電穿孔的影響，本文的研究分為兩部分，首先是在無NPC存在下研究細(xì)胞核膜上電穿孔的時空分布作為對比；其次在存在NPC狀態(tài)下分析細(xì)胞核膜上電穿孔的時空分布規(guī)律。因電穿孔程度與細(xì)胞核膜上的空間位置相關(guān)，本文對細(xì)胞核膜上的區(qū)域進行等距離設(shè)置NPC，總數(shù)量為8，其介電參數(shù)參考電穿孔設(shè)定，仿真參數(shù)見表1[13]。

圖1 COMSOL仿真計算模型 Fig.1 The simulation model in COMSOL

根據(jù)式（1）求解細(xì)胞膜、核膜電位Ψ為

式中，ε0為真空介電常數(shù)；εr為相對介電常數(shù)；σ為電導(dǎo)率；t為時間；?為梯度算子。

細(xì)胞膜、核膜接觸阻抗的初始電導(dǎo)率分別為σmem0、σne0，但電穿孔后的磷脂雙分子層通透性提高會導(dǎo)致其等效電導(dǎo)率增大，該部分以σmemt、σnet表示，則考慮穿孔效應(yīng)的細(xì)胞膜電導(dǎo)率定義（核膜與細(xì)胞膜計算原理相同，下面以核膜為例進行推導(dǎo)）為

其中

式中，N為電穿孔密度；σP為空隙電導(dǎo)率；rP為穿孔孔半徑；n為孔的相對密度。通過微分方程求解相應(yīng)變量，有

表1 仿真計算參數(shù) Tab.1 Simulation parameters

式中，ΔΨ(t)為細(xì)胞膜內(nèi)外電位差；rj為時變穿孔半徑；r≥r*；F、R分別為法拉第常數(shù)、氣體常數(shù)；T為熱力學(xué)溫度。式（7）中，第一項為跨膜電位產(chǎn)生的電場力；第二項為磷脂雙分子層親水性頭部空間排斥力；第三項為微孔邊沿線性張力；第四項為細(xì)胞膜表明張力，膜的有效張力系數(shù)δeff為

式中，δ0為未穿孔細(xì)胞膜的單位面積的表面能；δ′為碳水化合物-水交界面的單位面積的表面能；dp為所有穿孔的孔面積之和；d為細(xì)胞膜表面積。

為提高仿真結(jié)果準(zhǔn)確性，選取平行于電場方向的最大截面進行分析[21-23]。其中，施加的方波脈沖寬度為50ns、幅值為300V、上升沿和下降沿各設(shè)置為5ns，仿真模擬時間為0～160ns，最大步長為1ns。上述參數(shù)方程代入COMSOL軟件的電流模塊和偏微分模塊求解后，進行相關(guān)仿真研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 對細(xì)胞膜電穿孔的影響

本文首先分析納秒脈沖電場作用下NPC對細(xì)胞膜電穿孔的影響。圖2為θ=0°處（A點）孔密度、跨膜電壓隨時間的變化曲線，圖2a表明納秒脈沖作用期間，孔密度瞬間激增至穩(wěn)定值；圖2b表明納秒脈沖作用期間，跨膜電壓達到穿孔閾值后迅速降低。 曲線變化高度重合表明NPC的存在不會對細(xì)胞膜A點電穿孔產(chǎn)生明顯的影響。

圖2 NPC對A點的孔密度、跨膜電壓的時間特性影響 Fig.2 The effect on the time characteristics of pore density and transmembrane voltage at piont A

圖3為納秒脈沖作用后細(xì)胞膜的孔密度、跨膜電壓的空間分布。因其他時刻下的細(xì)胞膜孔密度和跨膜電壓隨相位變化曲線所得結(jié)果與脈沖電場作用后（t=50ns）的孔密度和跨膜電壓隨相位變化曲線結(jié)果基本相同，這里主要展示t=50ns的跨膜電壓和孔 密度變化曲線。從圖中可以看出，NPC的存在也未對細(xì)胞膜電穿孔產(chǎn)生明顯的影響，本文重點分析NPC對核膜電穿孔的影響。

圖3 NPC對細(xì)胞膜的孔密度、跨膜電壓的 空間特性影響 Fig.3 The effect on the spatial characteristics of pore density and transmembrane voltage on cell membrane

2.2 對核膜電穿孔的影響

本節(jié)首先分析距離NPC1 1nm處（見圖1中M點）跨膜電壓、孔密度的時間變化特性。圖4a為NPC對M點跨膜電壓的影響。在無NPC時，M點的跨膜電壓迅速上升至1.09V，脈沖結(jié)束后跨膜電壓下降至0.51V。當(dāng)M點附近存在NPC時，其跨膜電壓的峰值僅為0.64V。脈沖結(jié)束后，跨膜電壓下降至0.53V。上述對比表明，NPC的存在會降低M點的跨膜電壓的幅值。圖4b為NPC對M點孔密度的影響。當(dāng)M點無NPC時，M點的孔密度迅速上升至1.6×1018m?2；當(dāng)M點存在NPC時，M點孔密度僅為1×107m?2，表明NPC的存在對周圍電穿孔特性有顯著性影響。

圖4 NPC對M點的跨膜電壓、孔密度的時間特性影響 Fig.4 The effect on the time characteristics of transmembrane voltage and pore density at piont M

為研究NPC分布對核膜電穿孔分布的影響，同時定量分析NPC有效作用區(qū)域，圖5分析了不同脈沖電場作用時刻（t=10ns, 30ns, 50ns）的跨膜電壓空間分布，其NPC的位置如圖5的黑色小圓所示。脈沖上升期間（t=10ns），NPC區(qū)域的跨膜電壓較NPC=0下降幅度最大可達55.3%，在脈沖作用期間與脈沖作用后，跨膜電壓的空間分布差異逐漸變大，表明NPC對周圍區(qū)域的電穿孔影響范圍也在逐漸擴大。

圖5 NPC對核膜的跨膜電壓空間特性影響， 圓圈代表NPC及其所在位置 Fig.5 The effect on the spatial characteristics of transmembrane voltage on nuclear membrane, where the circle represents NPC

圖6為脈沖電場作用后（t=50ns），NPC對核膜孔密度的影響。通過對比發(fā)現(xiàn)，NPC周圍的孔密度顯著性低于未設(shè)置NPC時的孔密度，如NPC-1、NPC-2區(qū)域內(nèi)孔密度峰值減少90%以上，表明該部分區(qū)域由穿孔狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榇┛壮潭容^小甚至未穿孔狀態(tài)。

為進一步量化NPC影響范圍，小于初始孔密度N0的區(qū)域定義為未穿孔，同時定義電穿孔衰減系數(shù)αk為

圖6 NPC對核膜的孔密度空間特性影響 Fig.6 The effect on the spatial characteristics of pore density on nuclear membrane

式中，Ni為核膜上第i點在模型中沒有設(shè)定NPC條件下得到的孔密度數(shù)值；NNPCi為第i點在模型中設(shè)定NPC條件下得到的孔密度數(shù)值。電穿孔衰減系數(shù)αk達到90%以上且大于N0的區(qū)域定義為嚴(yán)重衰減；電穿孔衰減系數(shù)αk為50%～90%的區(qū)域定義為中度衰減；電穿孔衰減系數(shù)αk為10%～50%的區(qū)域定義為輕度衰減。

在模型中設(shè)定NPC個數(shù)為8的條件下，分別計算未穿孔和嚴(yán)重衰減區(qū)域（αk≥90%）大小，結(jié)果如圖7所示。

圖7 未穿孔、穿孔程度較小區(qū)域示意圖 Fig.7 The none-electroporation and less-electroporation regions of nuclear membrane produced by NPC

從圖7可明顯看出，因90°與270°區(qū)域本身在無NPC時不會發(fā)生電穿孔，所以，此區(qū)域即使存在NPC，也不會對結(jié)果產(chǎn)生明顯的影響。而在其他NPC周圍，均有一定區(qū)域內(nèi)的核膜由電穿孔狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榇┛壮潭容^小甚至未穿孔狀態(tài)，其中，在45°、135°、225°、315°附近影響的范圍最廣，未穿孔、嚴(yán)重衰減的相位區(qū)域分別為1.68°、6.90°，而0°、180°附近的響應(yīng)區(qū)域只有1.06°、3.88°，即不同位置下的NPC對核膜電穿孔影響程度不同，半徑方向電場強度較弱的區(qū)域?qū)PC相對敏感。弧長I與相位θ轉(zhuǎn)換公式為

經(jīng)計算可得，在當(dāng)前設(shè)定條件下，單一的NPC對細(xì)胞核膜電穿孔產(chǎn)生影響的范圍可達617.8nm，其中，距離NPC較近的66.6nm范圍內(nèi)的細(xì)胞核膜由穿孔狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槲措姶┛谞顟B(tài)。

上述分析表明，NPC對細(xì)胞核膜附近區(qū)域電穿孔狀態(tài)具有顯著性影響，為研究NPC的存在及個數(shù)對整體細(xì)胞核膜上電穿孔的影響，本文分別計算了NPC個數(shù)分別為2、4、8、16、32時核膜未穿孔、電穿孔程度嚴(yán)重衰減、中度衰減、輕度衰減的區(qū)域大小，其中，NPC進行等距離分布，例如，當(dāng)NPC=2時，每隔180°設(shè)置NPC；當(dāng)NPC=16時，每隔22.5°設(shè)置NPC。核膜未穿孔、穿孔程度衰減區(qū)域隨NPC個數(shù)變化趨勢如圖8所示，區(qū)域百分比為核膜電穿孔衰減區(qū)域與沒有NPC存在時核膜的總電穿孔區(qū)域大?。?3 774.58nm）的百分比值。

圖8 核膜未穿孔、穿孔程度衰減區(qū)域隨 NPC個數(shù)變化趨勢 Fig.8 The area size of none and decay electroporation and varies with the number of NPC

與無NPC存在下的電穿孔程度相比，隨著NPC個數(shù)的增加，未穿孔、穿孔程度衰減區(qū)域逐漸增加，當(dāng)NPC=32，輕度衰減、中度衰減、嚴(yán)重衰減的區(qū)域分別為89.93%、36.00%、22.94%，表明絕大部分核膜電穿孔程度都因NPC的存在受到不同程度的影響；由電穿孔區(qū)域轉(zhuǎn)變?yōu)槲创┛讌^(qū)域的百分比為2.54%，而典型哺乳動物核膜NPC個數(shù)可達3 000～4 000（合成功能旺盛的細(xì)胞具有更多的NPC數(shù)量，而癌細(xì)胞普遍具有旺盛的合成功能），這必然導(dǎo)致核膜在一定電場強度下無法形成大面積電穿孔區(qū)域，造成類似“電場屏蔽”效果，從而影響基于電穿孔療法的治療效果。因此，在進行脈沖電場參數(shù)設(shè)計和優(yōu)化過程中，應(yīng)充分考慮NPC的存在導(dǎo)致核膜電穿孔效應(yīng)衰減的影響。

本文通過兩種模型（傳統(tǒng)細(xì)胞五層介電模型和含核孔復(fù)合體的細(xì)胞五層介電模型）分析了細(xì)胞核膜上電穿孔的空間分布規(guī)律，通過對比表明，核孔復(fù)合體的存在會極大地降低其周圍細(xì)胞核區(qū)域電穿孔效應(yīng)及整體細(xì)胞核電穿孔的程度。本文模型將核孔復(fù)合體設(shè)定為均勻分布，從而研究不同位置上核孔復(fù)合體對附近區(qū)域電穿孔程度的影響，然而，核孔復(fù)合體的數(shù)量、分布與細(xì)胞生理狀態(tài)關(guān)系密切，不同種類的哺乳細(xì)胞核復(fù)合體的數(shù)目及大小有所不同，即使是同一細(xì)胞在不同階段也會有所差異。后續(xù)將選取核孔復(fù)合體分布存在較大差異的哺乳類細(xì)胞，完善本文模型中核孔復(fù)合體的空間分布設(shè)置，并通過納秒脈沖電場細(xì)胞實驗，分析不同類別細(xì)胞的核膜電穿孔程度差異，進一步驗證仿真所得到的結(jié)論。

3 結(jié)論

本文建立了考慮NPC作用的五層介電模型，利用COMSOL軟件電流模塊和偏微分模塊分析了細(xì)胞電穿孔過程中的關(guān)鍵參數(shù)跨膜電壓、孔密度的時空變化特性，得到主要結(jié)論如下：

1）NPC的存在會導(dǎo)致附近一定區(qū)域內(nèi)的核膜由電穿孔狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槲措姶┛祝⑶乙矔@著性衰減周圍一定核膜區(qū)域的電穿孔程度，離核膜越近，其衰減程度越大，單一NPC（半徑為80nm）對核膜電穿孔產(chǎn)生影響的范圍可達617.8nm（衰減90%），其中，距離NPC較近的66.6nm范圍內(nèi)的核膜由穿孔狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槲措姶┛谞顟B(tài)。

2）NPC附近核膜電穿孔衰減程度也與NPC的位置相關(guān)，半徑方向電場強度較弱的區(qū)域?qū)PC相對敏感。相位在45°、135°、225°、315°區(qū)域?qū)PC相對敏感，而在90°、270°區(qū)域設(shè)置核孔時對電穿孔的發(fā)展沒有影響。

3）隨著NPC數(shù)目的增加，與無NPC狀態(tài)下的電穿孔程度對比，核膜上電穿孔受影響的區(qū)域可達89.93%，而電穿孔程度嚴(yán)重衰減的區(qū)域也達到22.94%。較多數(shù)量的NPC將會產(chǎn)生類似“電場屏蔽”現(xiàn)象，嚴(yán)重影響基于納秒脈沖電場靶向作用細(xì)胞核進而治療腫瘤的效果。