牛 波，王欣怡，徐江平，汪海濤

（南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院神經(jīng)藥理學(xué)科，廣東廣州510515）

阿爾茲海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）是最為常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾?。?］，患者在發(fā)病過程中會(huì)出現(xiàn)進(jìn)行性不可逆轉(zhuǎn)性的認(rèn)知功能和記憶力的下降，最終患者會(huì)失去自主生活能力［2］。目前AD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但普遍存在神經(jīng)元凋亡及突觸蛋白丟失等病理表現(xiàn)。通過前期的基礎(chǔ)研究，β淀粉樣蛋白（amyloidβ-protein，Aβ）沉積假說是目前學(xué)術(shù)界較為認(rèn)可的假說之一［3］，由于患者腦內(nèi)蛋白質(zhì)水解能力的改變，導(dǎo)致Aβ多肽的異常合成、寡聚和聚集，形成了淀粉樣蛋白斑塊［4］，淀粉樣蛋白斑塊對(duì)神經(jīng)元有一定的毒性作用，同時(shí)可以引起了腦內(nèi)炎癥的激活，從而進(jìn)一步影響神經(jīng)元的功 能［5］。叉 頭 框 蛋 白O3a（forkhead box protein O3a，F(xiàn)oxO3a）屬于叉形頭轉(zhuǎn)錄因子的O亞型，這一類轉(zhuǎn)錄因子的特點(diǎn)是有明顯的叉頭型DNA結(jié)合域；可進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯，而磷酸化的FoxO3a是其非活性形式［6］。FoxO3a廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)中［7-8］，有研究報(bào)道FoxO3a可以調(diào)控AD動(dòng)物模型中神經(jīng)細(xì)胞的凋亡［9］；近期也有研究將血清中可檢測(cè)出的FoxO3a作為早期診斷AD的參考［10］；這些研究提示轉(zhuǎn)錄因子FoxO3a參與到AD的發(fā)病過程中，但是AD患者病理學(xué)產(chǎn)物之一Aβ對(duì)FoxO3a的作用尚不明確。另一方面，突觸后致 密 蛋 白95（postsynaptic density protein 95，PSD95）作為突觸的重要組成之一，參與學(xué)習(xí)過程和記憶的形成［11-12］。PSD95表達(dá)量可以一定程度上反映學(xué)習(xí)記憶功能的受損程度［13］。本研究以體外細(xì)胞模型和AD動(dòng)物模型為研究對(duì)象，系統(tǒng)地考察Aβ對(duì)FoxO3a及PSD95的作用，同時(shí)初步探討了其可能的機(jī)制，為揭示AD的發(fā)病機(jī)制和探索治療途徑提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材 料

PC12細(xì)胞，購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)。SPF級(jí)健康Sprague Dawley（SD）雄性大鼠26只（6~8周，體質(zhì)量150～180 g），購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（粵）2015-0041）；SPF級(jí)雄性APPswe/PS1dE9（APP/PS1）轉(zhuǎn)基因小鼠（7月齡，體質(zhì)量22～25 g）購(gòu)自南京大學(xué)國(guó)家遺傳工程小鼠資源庫(kù)。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（蘇）2010-0003，由本實(shí)驗(yàn)室繁殖鑒定。大小鼠分別在飼養(yǎng)籠內(nèi)自由攝食攝水，環(huán)境溫度（20±2）℃，相對(duì)濕度40%~70%。DMEM培養(yǎng)基、Neurobasal培養(yǎng)基、B27、胰酶、多聚賴氨酸、HBSS、胎牛血清（FBS）購(gòu)自Gibco公司，Aβ25-35（β-淀粉樣蛋白片段25-35）購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，RIPA裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。FoxO3a、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、磷酸化FoxO3a（p-FoxO3a）抗體購(gòu)自Cell Signaling公司，PSD95、GAPDH抗體購(gòu)自Abcam公司，BCA蛋白定量分析試劑盒購(gòu)自Thermo scientif?ic公司。Alexa Fluor 488、DAPI購(gòu)自Invitrogen公司，PVDF膜、ECL發(fā)光液購(gòu)自Merck Millipore公司，Real Time RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊有限公司，2×Taq PCR Mastermix及DNA marker購(gòu)自Gene Star公司。其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 Aβ25-35的寡聚化

將Aβ25-35粉末在超凈臺(tái)中用無菌PBS配制成濃度為1 mmol/L的母液，放置于37℃的CO2孵箱中孵化7 d；置于4℃冰箱保存，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求稀釋成工作液。

1.3 大鼠皮層神經(jīng)元的培養(yǎng)

取孕19 d的孕鼠用異氟烷麻醉后，用75%酒精消毒，剪開子宮，小心夾出胎鼠，消毒后，剪下腦袋，用眼科鑷取出腦組織，分離皮層組織，用預(yù)冷的PBS沖洗后，剝?nèi)ケ砻娴难?，眼科剪子將組織剪至糜狀，加HBSS沖洗干凈后，加胰酶消化10 min，加FBS終止消化反應(yīng)，吸去FBS，加HBSS，反復(fù)吹打至分散均勻，經(jīng)細(xì)胞篩過濾，過濾后再吹打均勻，111.8×g離心10 min后洗去上清，加入適量的培養(yǎng)基接種到提前包被多聚賴氨酸的培養(yǎng)板上，置CO2培養(yǎng)箱，6 h后換成神經(jīng)元培養(yǎng)基（Neuronbasal：B27=50：1），每3天換一半培養(yǎng)基。

1.4 Aβ25-35海馬注射

將大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組和模型組，將大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后，將其頭部固定在立體定位儀上。沿頭背中部縱向切口，碘伏消毒，暴露前囟，參照大鼠腦立體定位儀使用說明，定位左右兩側(cè)海馬區(qū)的坐標(biāo)：前囟后5.2 mm，旁開4.4 mm。用顱骨鉆在坐標(biāo)點(diǎn)周圍環(huán)形鉆開顱骨，微量注射器自此處緩慢垂直進(jìn)針4.8 mm，然后將1.5μL Aβ25-35緩慢注入大鼠左右側(cè)海馬，留針5 min，再緩慢撤針，縫合切口。假手術(shù)組則用同樣的方法注射生理鹽水。注射完成7 d后進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.5 水迷宮實(shí)驗(yàn)

將大鼠/小鼠面朝池壁放入水中，4個(gè)象限每個(gè)象限各放1次，記錄動(dòng)物找到平臺(tái)的時(shí)間，找到后讓動(dòng)物在平臺(tái)上停留10 s以便記憶，在訓(xùn)練7 d獲記憶后，將平臺(tái)移走，記錄在平臺(tái)所在象限停留的時(shí)間和穿越的次數(shù)，時(shí)長(zhǎng)短和次數(shù)少的動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能受損。

1.6 RT-PCR實(shí)驗(yàn)

按Trizol試劑說明書提取細(xì)胞RNA，以O(shè)D260/280作為RNA純度檢測(cè)的指標(biāo)，OD260/280在1.9~2.1之間，符合要求可進(jìn)一步按Prime-Script RT Master Mix試劑盒說明，將5×PrimeScript Buffer、PrimeScript RT Enyzme Mix I、Oligo dT Primer（50μmol/L）和Random 6 meres（100μmol/L）試劑置冰上解凍，RNase-free H2O在室溫解凍，按步驟合成cDNA。將引物、cDNA、試劑按比例混勻后，采用PCR擴(kuò)增試劑盒對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。PSD95上游引物：TG?CACTATGCTCGTCCCATCATCA，下游引物：TGT?GCCTGGATGTCCTTCTCCATT；FoxO3a上游引物：5’-GGAACGUGAUGCUUCGCAATT-3’，下 游 引物：5’-UUGCGAAGCAUCACGUUCCTT-3’，GAP?DH上游引物：GCAGTGGCAAAGTGGAGATT，下游引物：ACAGTCTTCTGGGTGGCAGT。在瓊脂凝膠上每孔加入1.5～2μL的各組樣品和Maker進(jìn)行電泳，完成后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.7 Western Blot免疫印跡法

細(xì)胞采用預(yù)冷的細(xì)胞裂解液（含1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑）進(jìn)行振蕩裂解，組織樣品在加入上述裂解液后采用超聲裂解。裂解完成后采用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量后，樣品加入裂解液和上樣緩沖液稀釋至終濃度1μg/μL，煮沸10 min后備用。樣品隨后分別加入到聚丙烯酰胺SDS凝膠孔中，80 V電泳后完成后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上；5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗稀釋液孵育4℃過夜；將TBST緩沖液洗脫3次后，二抗稀釋液孵育2 h；TBST洗脫后，滴加發(fā)光液曝光。

1.8 免疫熒光

將PC12細(xì)胞接種于共聚焦小皿中，Aβ25-35處理后，棄培養(yǎng)基，40 g/L的多聚甲醛固定20 min，Tri?tonX-100室溫孵育20 min，5%的FBS室溫封閉1 h，一抗溶液4℃孵育過夜后，熒光二抗溶液室溫避光孵育1 h，DAPI溶液室溫孵育15 min，滴加防熒光淬滅劑封片后，于共聚焦熒光顯微鏡下觀察。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤描述，數(shù)據(jù)由Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組是兩組數(shù)據(jù)時(shí)，如果每一組資料都呈正態(tài)分布并且方差齊性，組間比較采用t檢驗(yàn)，反之用校正t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)。多組均數(shù)比較，若各組定量資料都呈正態(tài)分布并且方差齊性采用One way-ANO?VA進(jìn)行分析，反之則用Kruskal WallisH檢驗(yàn)。不滿足方差齊性的情況時(shí)，采用Welch′s anova方法分析。柱狀圖采用GraphPad Prism8.0軟件繪制。

2 結(jié)果

2.1 Aβ25-35在PC12細(xì)胞中降低PSD95的表達(dá)且增加FoxO3a的表達(dá)

如圖1A、B、C所示，梯度濃度（5、10、20μmol/L）的寡聚化的Aβ25-35處理PC12細(xì)胞24 h，Western Blot的結(jié)果顯示Aβ25-35可以濃度依賴性地降低PSD95的蛋白水平的表達(dá)量和增加FoxO3a蛋白的表達(dá)。20μmol/L Aβ25-35處理時(shí)，PSD95蛋白表達(dá)量下調(diào)至（45.09±1.61）%（F=7.487，P=0.054 0）。FoxO3a的蛋白表達(dá)的上調(diào)則在20μmol/L Aβ25-35處理時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=17.48，P=0.021 0），是對(duì)照組表達(dá)量的（228.7±20.4）%。圖1D是Aβ25-35處理PC12細(xì)胞后對(duì)PSD95蛋白的染色結(jié)果，綠色熒光標(biāo)記PSD95，藍(lán)色為DAPI染色，免疫熒光的結(jié)果與Western blot的結(jié)果一致，Aβ25-35處理組的綠色熒光強(qiáng)度變?nèi)?，提示PSD95表達(dá)下調(diào)。而如圖1E所示，同樣用免疫熒光的方法檢測(cè)了Aβ25-35處理后FoxO3a的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示Aβ25-35有促進(jìn)FoxO3a進(jìn)入細(xì)胞核的作用。以上結(jié)果提示Aβ25-35在引起PC12細(xì)胞突觸受損的同時(shí)促進(jìn)了FoxO3a的表達(dá)和進(jìn)核。

圖1 β淀粉樣蛋白在PC12細(xì)胞中對(duì)PSD95和FoxO3a表達(dá)的影響Fig.1 Effects of Aβ25-35 on the expression of PSD95 and FoxO3a in PC12 cells

2.2 Aβ25-35在神經(jīng)元中對(duì)PSD95及FoxO3a表達(dá)的影響

為進(jìn)一步證實(shí)在PC12細(xì)胞中獲得的結(jié)果，我們培養(yǎng)了體外的原代神經(jīng)元（圖2A）。在神經(jīng)元中用同樣梯度濃度的寡聚化的Aβ25-35（5～20μmol/L）去處理24 h。結(jié)果如圖2B、C、D所示，PSD95的蛋白表達(dá)量隨Aβ25-35濃度增加而下降，在劑量20μmol/L時(shí)與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=5.445，P=0.015 3），此時(shí)PSD95的表達(dá)量下調(diào)至（53.52±3.85）%，而Aβ25-35的處理也濃度依賴性地增加FoxO3a的表述，在20μmol/L濃度時(shí)即可上調(diào)FoxO3a至（314.9±31.51）%（F=17.46，P=0.019 7）。此結(jié)果與PC12細(xì)胞中獲得的結(jié)果一致，提示Aβ25-35在神經(jīng)元中引起突觸損傷的同時(shí)可促進(jìn)FoxO3a的表達(dá)。

圖2 β淀粉樣蛋白在神經(jīng)元中對(duì)PSD95和FoxO3a的影響Fig.2 Effects of Aβ25-35 on the expression of PSD95 and Foxo3a in neurons

2.3 Aβ25-35立體定位注射的AD大鼠模型中FoxO3a的表達(dá)增加

在SD大鼠的海馬組織中立體定位注射寡聚化的Aβ25-35后對(duì)假手術(shù)組和模型組進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練，第8天進(jìn)行探索性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3A、B所示：對(duì)照組的目標(biāo)象限的探索實(shí)踐為（31.56±2.17）s，Aβ25-35組的時(shí)長(zhǎng)為（24.35±1.29）s，組間對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=2.843，P=0.098）；對(duì)照組在目標(biāo)象限的穿越次數(shù)為（5.31±0.91）次，而Aβ25-35組的穿越次數(shù)為（2.53±0.49）次（F=3.459，P=0.014 9），水迷宮的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Aβ25-35引起了大鼠的認(rèn)知障礙。RTPCR法檢測(cè)海馬組織中PSD95的mRNA水平，結(jié)果如圖3C、D、E所示，與行為學(xué)結(jié)果一致，PSD95的mRNA顯著下降至對(duì)照組的（58.40±8.28）%（F=1.193，P=0.010 1），同時(shí)FoxO3a的mRNA水平升高至（140.9±7.45）%（F=2.378，P=0.049 6），說明在Aβ25-35注射的在體AD模型中，突觸功能受損的同時(shí)FoxO3a的表達(dá)水平上調(diào)，注射Aβ25-35的動(dòng)物模型的結(jié)果與細(xì)胞模型中趨勢(shì)一致。

圖3 在Aβ25-35注射的大鼠模型中β淀粉樣蛋白對(duì)PSD95和FoxO3a的影響Fig.3 Effects of Aβ25-35 on the expression of PSD95 and FoxO3a in Aβ25-35-injected rats

2.4 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中FoxO3a及PSD95表達(dá)的變化

APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠是AD的動(dòng)物模型。野生型和APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練如圖4A所示。探索性的結(jié)果如圖4B，野生型小鼠在目標(biāo)象限的穿越次數(shù)為（4.91±0.81）次，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的穿越次數(shù)是（2.6±0.58）次，與野生型組相比顯著下降（F=2.158，P=0.033 3）。在目標(biāo)象限的停留時(shí)間如圖4C所示野生型小鼠為（30.47±2.23）s，而APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的探索時(shí)間為（17.32±2.08）s，組間對(duì)比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=1.265，P=0.000 4）。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明7月齡的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出明顯的認(rèn)知障礙。進(jìn)一步用RT-PCR法和Western Blot的方法檢測(cè)野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中PSD95和FoxO3a的表達(dá)情況。結(jié)果如圖4D所示，與野生型組相比，轉(zhuǎn)基因小鼠中的PSD95的mRNA水平下降至對(duì)照組的（60.89±1.53）%（F=20.05，P=0.008 8），而蛋白表達(dá)量水平為野生型組的（59.63±13.55）%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=8.496，P=0.044 5），與行為學(xué)中表現(xiàn)出的記憶認(rèn)知障礙相符。在檢測(cè)突觸相關(guān)蛋白PSD95的表達(dá)量變化的同時(shí)，圖G所示在轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中FoxO3a的mRNA是野生型小鼠表達(dá)量的（172.4±4.87）%，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=2.351，P=0.000 4），而對(duì)應(yīng)的蛋白水平是野生型組的（235±39.03）%（F=2.754，P=0.032 0），這進(jìn)一步說明β-淀粉樣蛋白在降低突觸相關(guān)蛋白PSD95表達(dá)量的同時(shí)，上調(diào)了FoxO3a的表達(dá)水平。

圖4 在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中β淀粉樣蛋白對(duì)PSD95和FoxO3a的影響Fig.4 The levels of PSD95 and Foxo3a in the brain of APP/PS1 transgenic mice

2.5 Aβ對(duì)AKT及FoxO3a磷酸化的影響

在上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)，Aβ可以增加體外神經(jīng)細(xì)胞模型中FoxO3a的表達(dá)量，與此同時(shí)在體內(nèi)模型中也可以上調(diào)FoxO3a的表達(dá)水平。已經(jīng)證實(shí)磷酸化的AKT可以增加FoxO3a的磷酸化水平，降低FoxO3a的活性，那么β-淀粉樣蛋白上調(diào)FoxO3a表達(dá)的作用是不是通過介導(dǎo)AKT磷酸化而實(shí)現(xiàn)的呢？如圖5A所示，用20μmol/L的寡聚化的Aβ25-35處理PC12細(xì)胞，Western Blot方法檢測(cè)不同處理時(shí)間點(diǎn)（5、10、20和40 min）p-AKT的量，發(fā)現(xiàn)隨著處理時(shí)間的增加，AKT的磷酸化水平降低，在處理時(shí)間為40 min時(shí)AKT的磷酸化水平為對(duì)照組的（37.64±11.92）%，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=6.553，P=0.042 6）。與此同時(shí)，如圖5B所示，F(xiàn)oxO3a的磷酸化水平與AKT的磷酸化水平變化趨勢(shì)一致，在處理時(shí)間為10 min有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，p-FoxO3a的量是對(duì)照組的（41.43±9.49）%（F=44.88，P=0.041 4）。此外，圖5C、D所示APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠中腦組織中的p-AKT的下降為對(duì)照組的（65.75±3.51）%（F=6.362，P=0.023 6），而p-FoxO3a的表達(dá)量下降至對(duì)照組的（46.62±9.64）%（F=8.562，P=0.007 9）。綜上結(jié)果，在細(xì)胞模型和動(dòng)物模型中，Aβ都可以降低AKT和FoxO3a的磷酸化水平。

圖5 Aβ在體內(nèi)、外模型中抑制AKT及FoxO3a磷酸化水平Fig.5 Aβinhibited the phosphorylation of Akt and FoxO3a both in in vitro and in vivo models.

3 討論

為了考察異常沉積的β淀粉樣蛋白對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子FoxO3a的作用，本研究首先從體外細(xì)胞模型入手，選取了操作方便可重復(fù)性強(qiáng)的PC12細(xì)胞。β淀粉樣蛋白的前體是淀粉樣前體蛋白（amyloid pre?cursor protein，APP），APP是一種廣泛存在于細(xì)胞膜上的蛋白，APP本身無毒，只有在被分泌酶裂解后產(chǎn)生了β淀粉樣蛋白沉積后，才會(huì)對(duì)中樞神經(jīng)元有毒性作用［14-15］。本研究中為了確保β淀粉樣蛋白產(chǎn)生并且有一定的毒性作用，將突觸后膜蛋白PSD95作為神經(jīng)元功能正常的標(biāo)志物，學(xué)習(xí)認(rèn)知能力的下降受損伴隨著PSD95表達(dá)量的減少［16-17］。本研究中采用37℃孵育7 d的方法去制備寡聚化的Aβ25-35，在處理24 h后，在神經(jīng)元細(xì)胞系和體外培養(yǎng)的神經(jīng)元中的結(jié)果都顯示寡聚化的Aβ25-35可以濃度依賴性的減少PSD95蛋白的表達(dá)，提示體外寡聚化的Aβ25-35處理可以模擬阿爾茲海默的發(fā)病過程。同時(shí)，相應(yīng)組別的FoxO3a的表達(dá)量濃度依賴性的上調(diào)。這些結(jié)果提示Aβ25-35處理PC12細(xì)胞及原代神經(jīng)元會(huì)導(dǎo)致FoxO3a及PSD95的變化，但這些變化是一個(gè)伴隨過程還是一個(gè)有因果關(guān)系的事件，值得進(jìn)一步的研究。

在體外細(xì)胞模型上證實(shí)了Aβ可以促進(jìn)核轉(zhuǎn)錄因子Foxo3a的表達(dá)以及降低PSD95的表達(dá)，那么在體內(nèi)模型中Aβ是否有相同的作用呢？實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將寡聚化的Aβ25-35立體定位注射大鼠海馬造模［18］，選擇大鼠進(jìn)行Aβ25-35海馬注射的主要是因?yàn)樾g(shù)后大鼠的存活率高于小鼠。在水迷宮實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠表現(xiàn)出明顯的記憶認(rèn)知障礙的同時(shí)也同樣檢測(cè)到海馬組織中PSD95表達(dá)量下降，這與認(rèn)知功能受損的分子生物學(xué)上的變化相符。進(jìn)一步檢測(cè)模型組海馬中的FoxO3a的表達(dá)量，與假手術(shù)比模型組顯著增加，說明在體內(nèi)環(huán)境中，Aβ同樣促進(jìn)核轉(zhuǎn)錄因子FoxO3a的表達(dá)。利用體外立體定位在海馬區(qū)注射的方法主要是在腦組織中加入外源性的Aβ，那么在體內(nèi)環(huán)境中增加內(nèi)源性的Aβ，是否也會(huì)影響FoxO3a和PSD95表達(dá)呢？本研究中采用了APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠模型［19］。文獻(xiàn)報(bào)道Aβ是由APP基因編碼產(chǎn)生的，APP蛋白經(jīng)過蛋白水解作用可產(chǎn)生Aβ，Aβ在正常生理狀態(tài)下存在于血液和腦脊液中［20］。但是病理狀態(tài)下如AD患者腦組織中出現(xiàn)大量Aβ沉積，這種異常的蛋白沉積對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生毒性。前期的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)：在家族性AD患者有多個(gè)APP基因的突變位點(diǎn)，APP突變可改變APP的水解代謝過程，導(dǎo)致具有神經(jīng)毒性作用的Aβ沉積產(chǎn)生，并引發(fā)包括神經(jīng)炎癥在內(nèi)的多種病理機(jī)制，進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡或死亡，因神經(jīng)元不可逆的受損，患者會(huì)出現(xiàn)認(rèn)知障礙和記憶功能下降。而PS1基因編碼的PS蛋白是γ分泌酶的重要組成部分，在生成Aβ的過程中起重要作用。PS1基因的突變是另一個(gè)引起家族性AD的主要原因之一。本實(shí)驗(yàn)中所選用APPswe/PS1dE9轉(zhuǎn)基因小鼠能較為真實(shí)地模擬β淀粉樣蛋白引起的AD的發(fā)病過程［21］。APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠一般在6-7月齡開始表現(xiàn)出較為明顯的認(rèn)知功能障礙［22］。將7月齡的野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致，APP/PS1小鼠的認(rèn)知功能明顯受損，同時(shí)轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中的PSD95表達(dá)量與野生型組相比顯著下調(diào)，并伴隨著FoxO3a表達(dá)量的增加。由此通過對(duì)“外源性”和“內(nèi)源性”的Aβ聚集的兩種動(dòng)物模型腦組織中FoxO3a的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩種模型中FoxO3a的水平皆上調(diào)，與細(xì)胞模型中Aβ的作用相同。與此同時(shí)，也有文獻(xiàn)報(bào)道Aβ可以通過調(diào)節(jié)FoxO3a激活NF-κB的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中經(jīng)典炎癥通路［23］，腦內(nèi)的神經(jīng)炎癥假說也逐漸成為近年來AD研究熱點(diǎn)之一。此外APP蛋白的胞內(nèi)肽段可以激活FoxO3a從而阻止海馬神經(jīng)元的神經(jīng)發(fā)生［24］，神經(jīng)發(fā)生在神經(jīng)退行性疾病和顱腦損傷的治療方面也有著重要意義。文獻(xiàn)報(bào)道與本研究結(jié)果都提示核轉(zhuǎn)錄因子FoxO3a與AD的發(fā)病過程關(guān)系密切。

無論是體外還是體內(nèi)模型中，Aβ都可以促進(jìn)FoxO3a的表達(dá)，但是其機(jī)制卻尚不明確。AKT可通過磷酸化生成p-AKT，p-AKT是激活模式，有文獻(xiàn)報(bào)道AKT已經(jīng)被證實(shí)是FoxO3a的上游信號(hào)通路之一［25-26］，p-AKT可以 磷酸 化FoxO3a，上 調(diào)p-FoxO3a的表達(dá)量，而p-FoxO3a是非“激活”狀態(tài)，p-FoxO3a無法進(jìn)入細(xì)胞核與DNA結(jié)合，繼而對(duì)下游的基因發(fā)揮調(diào)控作用。為了研究β淀粉樣蛋白上調(diào)FoxO3a水平作用是否是通過介導(dǎo)AKT磷酸化實(shí)現(xiàn)的，本研究中采用了20μmol/L的Aβ去處理PC12細(xì)胞不同時(shí)間，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的增加，Aβ25-35可以減少p-AKT的量，同時(shí)，p-FoxO3a的量也隨處理時(shí)間增長(zhǎng)而降低。而在體內(nèi)環(huán)境中，與野生型相比，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的腦組織中p-AKT和p-FoxO3a的量都顯著下降。本研究結(jié)果提示β淀粉樣蛋白可能是通過降低AKT磷酸化水平從而去磷酸化FoxO3a，上調(diào)FoxO3a的表達(dá)水平。AKT除了可以直接通過FoxO3a影響下游基因轉(zhuǎn)錄外，實(shí)際上還參與到神經(jīng)元內(nèi)功能蛋白的合成，突觸可塑性的形成以及神經(jīng)元在疾病模型中功能的改變等過程中［27］。PSD95作為突觸后致密蛋白，維持著突觸間信息的傳遞和突觸可塑性的形成。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如抑郁癥和AD模型的動(dòng)物模型腦組織中都能觀察到PSD95的表達(dá)量的下降。有研究報(bào)道，在抑郁癥模型p-AKT的水平低于生理狀態(tài)下水平，而激活A(yù)KT可以提高PSD95的水平，改善突觸功能同時(shí)增強(qiáng)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)［28］。在實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)Aβ處理的細(xì)胞模型和APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中的AKT的磷酸化下調(diào)，而PSD95的表達(dá)量也下降，與文獻(xiàn)報(bào)道的趨勢(shì)一致，說明AKT也參與到AD的發(fā)病過程中。但Aβ及AKT通過怎樣的途徑影響PSD95的表達(dá)還需進(jìn)一步研究。另外，F(xiàn)oxO3a在Aβ對(duì)PSD95的調(diào)控中發(fā)揮怎樣的作用，值得深入研究。通過鑒定PSD95的啟動(dòng)子區(qū)是否存在FoxO3a轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，并通過雙熒光素酶報(bào)告基因和點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)有利于研究該問題。同時(shí)還可通過轉(zhuǎn)染組成性激活的AKT（constitutively ac?tive AKT）來研究Aβ是否通過AKT/FoxO3a途徑來調(diào)控PSD95的表達(dá)。

綜上，β淀粉樣蛋白無論在體外細(xì)胞模型還是在體內(nèi)模型中都可以降低PSD95的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子FoxO3a的水平，并可能是通過介導(dǎo)AKT磷酸化水平實(shí)現(xiàn)的對(duì)PSD95和FoxO3a的作用。