季士亮，洪蕾，郭東凱，江翊國，徐飛，黃立峰

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州科技城醫(yī)院，江蘇蘇州 215153)

神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma，NB)是起源于神經(jīng)外胚層原始神經(jīng)嵴細(xì)胞的顱外惡性實(shí)體腫瘤，年發(fā)病率0.3/100 000～5.5/100 000，占兒童惡性腫瘤的8%～10%，已成為兒童主要死亡病因之一[1]。近年來，臨床對NB的治療手段不斷完善和改進(jìn)，但療效并無顯著提升，約15%患者對誘導(dǎo)治療無反應(yīng)，約50%患者臨床癥狀緩解后復(fù)發(fā)，平均5年生存率30%～60%，病死率約為兒童時期腫瘤死亡病例的15%[2]。目前NB發(fā)病機(jī)制尚不明確，一般被認(rèn)為是一系列遺傳性改變累積導(dǎo)致，包括癌基因、抑癌基因和DNA修復(fù)基因的改變[3]。癌基因(MYC)的過度表達(dá)被認(rèn)為是NB發(fā)生發(fā)展的一個重要原因[4]。MYC是NB大量基因及遺傳通路失調(diào)的原因，MYC介導(dǎo)的致癌作用是通過調(diào)控與腫瘤相關(guān)的microRNA(miRNA)實(shí)現(xiàn)的。miRNA參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡及器官發(fā)育等生理過程，并在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，是腫瘤惡性行為的重要調(diào)控因子。近期有研究表明，microRNA(miR)-515-5p在乳腺癌和前列腺癌中的表達(dá)異常[5]。miR-515-5p家族在NB細(xì)胞中表達(dá)異常及作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究探討了NB細(xì)胞中miR-515-5p對c-MYC-p53信號軸的調(diào)控作用及其對NB細(xì)胞系體外增殖和侵襲能力的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

SK-N-BE(2)和SK-N-AS購自上海中科院細(xì)胞庫；胎牛血清購自Gibco公司；miR-515-5p、mimics-NC購自Gene Pharma公司；脂質(zhì)體Lipo 2000購自Thermo Fisher公司，c-MYC、p53、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體及辣根過氧化物酶抗體(HRP)標(biāo)記二抗購自Santa 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 SK-N-BE(2)和SK-N-AS細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM/FBS(Gibco)培養(yǎng)基，并放置于含有5% CO2的37 ℃孵箱中。采用胰蛋白酶將細(xì)胞消化后，將其濃度調(diào)整為1×105/mL，取1 mL接種至12孔板，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。當(dāng)細(xì)胞密度接近50%時，采用Lipo 2000將接種的細(xì)胞分為miR-515-5p過表達(dá)組(miR-515-5p mimics組)和陰性對照組(NC mimics組)，未進(jìn)行轉(zhuǎn)染組即空白對照組(Control組)，轉(zhuǎn)染步驟按說明書操作。轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行相關(guān)檢測。利用Gene Pharma miRNA提取試劑盒說明書的要求提取細(xì)胞中的miRNA。檢測RNA濃度，并取500 ng RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以U6 RNA作為內(nèi)源性對照。在SYBR Green 5×PCR Master Mix作用下進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng)。

1.2.2 MTT檢測 將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以3 000個/孔接種到96孔板中，連續(xù)檢測5 d。根據(jù)說明書，待測孔加入 10 μL CCK-8(Dojindo，Japan)分析細(xì)胞活性，37 ℃避光孵育2 h，于450 nm處檢測吸光度，根據(jù)吸光度值繪制增殖曲線，每個細(xì)胞做6個復(fù)孔。

1.2.3 Transwell小室和劃痕實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞計數(shù)并接種到Transwell小室(孔徑8 μm，1×105個細(xì)胞)，在上室加入無血清培養(yǎng)基，下室采用含15% FBS的培養(yǎng)液覆蓋。培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室，以4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌2次，風(fēng)干。采用0.1%結(jié)晶紫(sigma)染色，在顯微鏡下隨機(jī)選擇4個視野觀察發(fā)生侵襲的細(xì)胞，并計數(shù)每個視野下發(fā)生侵襲的細(xì)胞。同理，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞密集度達(dá)到90%左右時，利用500 mL的槍頭垂直均勻劃出交叉橫線，每孔至少穿過5條線。采用PBS清洗細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在顯微鏡下觀察劃痕后0、24、48、72 h劃痕愈合情況，反映細(xì)胞的遷移能力。

1.2.4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種到6孔板(300個細(xì)胞/板)，每3 d換液一次，7～10 d出現(xiàn)肉眼可見的克隆球時終止培養(yǎng)，4%多聚甲醛固定30 min，采用吉姆薩染色，以顯微鏡觀察并計數(shù)。

1.2.5 細(xì)胞凋亡與周期實(shí)驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞，消化離心用預(yù)冷PBS洗2次，調(diào)整細(xì)胞終濃度為1×106/mL，先后加入5 μL Annexin V-FITC染液和10 μL碘化丙啶(PI)染液，室溫孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。同理，收集轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗2次，緩慢滴加3 mL 70%預(yù)冷的無水乙醇，4 ℃靜置過夜。離心重懸后加入20 μL核糖核酸酶(RNase)，37 ℃溫箱孵育30 min；加入PI 20 μL至終濃度50 μg/mL，用錫箔紙包住，24 h內(nèi)上機(jī)檢測。

1.2.6 Western免疫印跡檢測 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，利用RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳。采用含5%脫脂奶粉的TBS進(jìn)行封閉。最后利用電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影，并分析條帶的強(qiáng)弱。

2 結(jié)果

2.1 miR-515-5p對NB細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞活性的影響

采用實(shí)時定量PCR檢測miR-515-5p在SK-N-BE(2)和SK-N-AS細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率，見圖1A。通過熒光顯微鏡觀察到過表達(dá)miR-515-5p的細(xì)胞形態(tài)略有變化，細(xì)胞面積有所增加，見圖1B。利用CCK8實(shí)驗(yàn)對細(xì)胞的活性進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-515-5p mimics的SK-N-BE(2)和SK-N-AS細(xì)胞活性均降低(P<0.05)，見圖1C。因此，miR-515-5p通過改變細(xì)胞形態(tài)抑制NB細(xì)胞的活性。

注：A.轉(zhuǎn)染miR-515-5p 48 h后細(xì)胞形態(tài)變化；B.轉(zhuǎn)染48 h后RT-PCR檢測miR-515-5p表達(dá)水平；C.轉(zhuǎn)染miR-515-5p 24、48、72和96 h后CCK8法觀察細(xì)胞活性變化。*與NC mimics組比較，P<0.05

2.2 miR-515-5p對NB細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響

與NC mimics組比較，miR-515-5p組細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力均降低(P<0.05)，其中，過表達(dá)miR-515-5p后，miR-515-5p mimics組細(xì)胞集落平均形成率明顯減少(0.33±0.02)，與NC mimics組(0.42±0.05)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2A。劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，過表達(dá)miR-515-5p的細(xì)胞在72 h后劃痕仍未愈合，而NC mimics組基本愈合(P<0.05)，見圖2B。此外，Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，過表達(dá)miR-515-5p降低了細(xì)胞侵襲能力(P<0.05)，見圖2C。

注：A.轉(zhuǎn)染miR-515-5p后SK-N-BE(2)和SK-N-AS細(xì)胞克隆形成率；B.轉(zhuǎn)染miR-515-5p后通過劃痕實(shí)驗(yàn)測定0、24、48和72 h細(xì)胞遷移能力；C.轉(zhuǎn)染48 h后通過Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲能力。*與NC mimics組比較，P<0.05

2.3 miR-515-5p對NB細(xì)胞凋亡與自細(xì)胞周期的影響

采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期與凋亡率，與NC mimics組比較，轉(zhuǎn)染miR-515-5p后細(xì)胞G1期比例明顯增加，S期比例明顯減少(P<0.05)，見圖3A。同時，轉(zhuǎn)染miR-515-5p后細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05)，且與轉(zhuǎn)染miR-515-5p的濃度呈正比，見圖3B。因此，miR-515-5p可影響NB細(xì)胞的凋亡與自我更新能力。

2.4 miR-515-5p對c-MYC-p53信號通路的影響

采用Western Blot法檢測miR-515-5p對MYC及抑癌基因p53表達(dá)水平的影響。與NC mimics組比較，轉(zhuǎn)染miR-515-5p mimics的細(xì)胞中c-MYC水平降低，P-p53水平升高，而p53的表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化，見圖4。因此，miR-515-5p通過調(diào)控c-MYC-p53信號軸抑制細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。

注：A.轉(zhuǎn)染miR-515-5p后SK-N-BE(2)和SK-N-AS細(xì)胞G1期比例明顯增加，S期比例明顯減少；B.轉(zhuǎn)染miR-515-5p后細(xì)胞凋亡率增加。*與NC mimics組比較，P<0.05

圖4 Western Blot法檢測miR-515-5p對相關(guān)蛋白水平表達(dá)的影響

3 討論

近年來，有研究表明NB的發(fā)生發(fā)展與miRNA密切相關(guān)[6-7]。miRNA是一類內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA分子，通過堿基互補(bǔ)配對的方式，導(dǎo)致靶基因mRNA降解或mRNA的翻譯抑制，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)[8]。筆者前期通過生物信息學(xué)技術(shù)和多種軟件預(yù)測方法，發(fā)現(xiàn)miR-515-5p在NB的表達(dá)不同于正常組織。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-515-5p后，NB SK-N-BE(2)和SK-N-AS細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力均下降，提示miR-515-5p可能作為NB診斷及預(yù)測預(yù)后的新分子。

有研究表明，MYC通過作用于一系列細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡相關(guān)的下游靶基因，導(dǎo)致細(xì)胞周期和增殖改變，最終引發(fā)腫瘤[9-10]。MYC下游靶分子包括p53、S期相關(guān)蛋白激酶-2、鳥氨酸脫羧酶-1、雙微體-2、miRNA和長鏈非編碼RNA(lncRNA)，這些分子在NB細(xì)胞的增殖、凋亡及分化等方面具有重要作用[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，在MYC擴(kuò)增且預(yù)后不良的NB患者中，包括miR-184在內(nèi)的多種miRNA顯著下調(diào)[12]。為系統(tǒng)研究MYC調(diào)控的miR-515-5p在NB中的作用，本研究在前期工作中利用RNA干擾技術(shù)在NB細(xì)胞中抑制了內(nèi)源性MYC高表達(dá)，并通過miRNA芯片檢測比較其與對照細(xì)胞miRNA的表達(dá)譜，證實(shí)miR-515-5p的表達(dá)水平低于正常組織。

p53是細(xì)胞中重要的腫瘤抑制因子之一，>50%腫瘤患者有p53基因突變。p53突變體喪失了與DNA結(jié)合的能力，因此失去了腫瘤抑制功能。有研究顯示，p53突變能夠抑制miR-27a的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖及腫瘤形成[13]。部分miRNA在高級別NB細(xì)胞中的表達(dá)發(fā)生變化，從而改變p53活性，促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移[14]。本研究在利用生物信息學(xué)手段預(yù)測miR-515-5p轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，在其上游保守區(qū)域內(nèi)有MYC結(jié)合位點(diǎn)，而轉(zhuǎn)染MYC的表達(dá)載體后，miR-515-5p的轉(zhuǎn)錄受到顯著抑制。進(jìn)一步表明miR-515-5p可通過 c-MYC-p53信號軸調(diào)控NB瘤細(xì)胞的生長。部分miRNA在高級別NB細(xì)胞中的表達(dá)發(fā)生變化，從而改變p53的活性，促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移[14]。

綜上所述，MYC調(diào)控的miR-515-5p在NB惡性行為中的功能及其機(jī)制值得深入探討。本研究驗(yàn)證了miR-515-5p可能通過調(diào)控c-MYC-p53信號軸在NB發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮促抑制作用。此外，本研究將進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討miR-515-5p在傳遞MYC惡性行為信號過程中的功能和意義，并為NB的診斷和預(yù)測、預(yù)后提供具有應(yīng)用價值的新分子，為NB的生物治療提供新的作用靶點(diǎn)。