趙佳明，劉嬌嬌，王愛德，袁 暉

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/遼寧省果品采后生物學(xué)重點實驗室/設(shè)施園藝教育部重點實驗室，沈陽 110161）

南果梨是典型的呼吸躍變型果實，在室溫貯藏條件下果實軟化較快，嚴(yán)重影響其貨架期和經(jīng)濟(jì)價值。呼吸躍變型果實的成熟過程主要受乙烯調(diào)控[1]。乙烯的合成受合成途徑及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的共同調(diào)控[2]。在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，EIN2（ethylene insensitive 2）將乙烯信號途徑傳遞至細(xì)胞核內(nèi)的EIN3[3-4]。EIN3是一類植物特有的位于細(xì)胞核內(nèi)的乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)元件，其編碼基因?qū)儆谝粋€小的轉(zhuǎn)錄因子基因家族[5]。關(guān)于EIN3的作用機制的研究仍主要集中于模式植物擬南芥。在擬南芥的生長發(fā)育過程中，EIN3的mRNA水平基本不變，蛋白水平隨著生長發(fā)育階段不斷發(fā)生變化[6]。隨著乙烯處理時間的增長，EIN3在細(xì)胞核中的積累量逐漸增多，并且用MG132（蛋白酶體抑制劑）處理之后，EIN3在細(xì)胞核中的積累量也逐漸增多[3]。說明EIN3蛋白水平的變化可能受翻譯后修飾的調(diào)控。目前的研究認(rèn)為，EIN3蛋白水平的變化主要受泛素化途徑的調(diào)控。泛素化是普遍存在于真核生物中的一種翻譯后修飾途徑，參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多數(shù)生命活動過程[7]。泛素化的發(fā)生需要泛素激活酶（ubiquitin-activating enzyme,E1）、泛素結(jié)合酶（ubiquitin-conjugating enzyme,E2）和泛素連接酶（ubiquitin ligase,E3）的共同參與[8]，其中SCF復(fù)合體是最常見的一類E3泛素連接酶[9]。而F-box作為E3泛素連接酶的組分之一，負(fù)責(zé)特異地與底物結(jié)合，最終引起泛素化降解[10]。

在乙烯不存在的情況下，EIN3迅速被泛素標(biāo)記進(jìn)而被26S蛋白酶體降解；在有乙烯存在的情況下，EIN3的泛素化降解途徑受到抑制，EIN3在細(xì)胞核中大量積累[11-12]，并與下游基因的啟動子結(jié)合，激活乙烯反應(yīng)，促使乙烯大量生成。在EIN3泛素化降解過程中，負(fù)責(zé)與EIN3識別的有2個F-box蛋白，EBF1和EBF2[13]。擬南芥中的EBF1和EBF2的N端都具有核定位序列（nuclear localization sequence,NLS），并且表達(dá)量受到乙烯的誘導(dǎo)[14]。但是EBF1和EBF2卻有不同的功能，EBF1主要在乙烯不存在的情況下和黃化苗對乙烯反應(yīng)的初始階段發(fā)揮作用[15]。并且EIN3能夠與EBF2基因的啟動子結(jié)合進(jìn)而對乙烯信號途徑進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)[16]。EBF組成的SCF復(fù)合體作為一種E3泛素連接酶泛素標(biāo)記EIN3，并進(jìn)而被26S蛋白酶體降解，這一點在擬南芥中已經(jīng)得到證實，但在南果梨中仍無關(guān)于EIN3被泛素化降解的相關(guān)研究。本研究克隆南果梨中的EIN3和EBF，并對其互作關(guān)系進(jìn)行驗證，為從分子水平調(diào)控果實軟化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試南果梨（Pyrus ussuriensiscv.Nanguo）果實采摘于遼寧省鞍山市宇昊生態(tài)紅梨種植專業(yè)合作社。試驗所用乙烯利（Ethephon，有效成分含量40%）和1-甲基環(huán)丙烯（1-MCP，純度99%）均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。試驗所用的載體pGBKT7和pGADT7以及所用的酵母菌株Y2H Gold均購于大連寶生物有限公司。試驗采用的熒光定量PCR儀（qTOWER3G）為德國生產(chǎn)；氣象色譜（Agilent 7890A）為美國生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 材料處理于花后135d挑選形態(tài)大小均等，品相相近，無病蟲害且無明顯傷痕的果實進(jìn)行采摘。采后當(dāng)天對果實進(jìn)行乙烯和1-MCP處理，以采后未作任何處理的果實作為對照，每個處理30個果實。1-MCP處理是將果實放入密封的容器中擺放均勻，互相之間留有空隙，防止果與果之間相互影響，向容器中注入1-MCP至終濃度為1μL·L-1，并于室溫（25℃）下放置24 h。乙烯處理是將果實放入1mL·L-1乙烯利溶液中浸泡30s后取出，放入一密閉容器中并于室溫下放置24h。處理結(jié)束后將果實取出，并于室溫下貯藏。

分別在采后0，5，10，15d取果實測定果實硬度和乙烯生成量；選取5個果實，將果肉切片后于液氮中冷凍，放置于-80℃冰箱內(nèi)進(jìn)行后續(xù)的基因克隆及表達(dá)分析。

1.2.2南果梨果實乙烯生成量和硬度的測定果實乙烯生成量的測定參照TAN的方法進(jìn)行[18]。分別在采后0，5，10，15d時，選取10個果實，每2個果實稱重后放置于體積為1L的密閉容器內(nèi)，室溫下1h后用注射器從密封容器中抽取1mL的氣體，每個容器抽取3次為一組，密封好后待測。

利用氣相色譜儀（Agilent，7890A）測定乙烯含量，所用的氣相色譜儀柱為S毛細(xì)管色譜柱，型號為HP-AL/S（19095P-S25，Agilent）。柱箱、檢測器和進(jìn)樣口的溫度分別為110，120，180°C。載氣為氫氣，尾吹氣為氮氣，其流速均為40mL·min-1。

果實硬度測定參照YUAN的方法[17]。分別在采后0，5，10，15d檢測果實的硬度，每次測5個果實。沿待測南果梨果實赤道均勻選取4個點，用刀將果皮切去（每一塊果皮的橫截面直徑約1cm），將硬度計（FT-327,Fac?chini,Italy）直徑為11mm的探頭垂直果面，用力均勻插進(jìn)果肉約1cm處，讀取表盤顯示的數(shù)值，并計算出果肉的硬度（N）。

1.2.3PuEIN3的克隆及表達(dá)分析根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中得到的PuEIN3的全長序列設(shè)計克隆引物（引物序列見表1），以南果梨貯藏期的cDNA混樣為模板，對PuEIN3進(jìn)行基因克隆。將所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，純化以及轉(zhuǎn)化測序最終確定所得的基因序列是否正確。

利用http://primer3.ut.ee/網(wǎng)站根據(jù)PuEIN3序列設(shè)計表達(dá)引物（引物序列見表1）。利用實時熒光定量PCR方法，以南果梨處理和未處理的貯藏期的cDNA為模板檢測PuEIN3的表達(dá)水平。PCR反應(yīng)程序為：95℃3min，95℃10s，58℃30s，72℃30s，40個循環(huán)，收集熒光信號；55℃30s，生成溶解曲線。每個樣品3次生物學(xué)重復(fù)，最后根據(jù)公式2-△△Ct法計算基因的相對表達(dá)量。

1.2.4PuEBF1和PuEBF2的克隆及表達(dá)分析根據(jù)前期南果梨轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中得到的2個EBF的序列設(shè)計全長引物對基因進(jìn)行克隆（引物序列見表1）?；蚩寺〖氨磉_(dá)分析方法同PuEIN3。

表1 本研究所用引物序列Table 1 The primers used in this research

1.2.5 PuEIN3與PuEBF1和PuEBF2的互作驗證

1.2.5.1 酵母雙雜交實驗酵母雙雜交參照YUAN的方法進(jìn)行[19]，將PuEBF1和PuEBF2的編碼區(qū)分別連接到載體pGBKT7（Clontech，CA,USA），PuEIN3的編碼區(qū)連接到載體pGADT7（Clontech，CA,USA）。將含有目的基因的載體共轉(zhuǎn)化至酵母菌株Y2H Gold（Clontech，CA,USA），涂到DDO（SD/-Trp/-Leu）培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3d。待長出單菌落之后將單菌落溶于0.9%NaCl溶液中，分別滴于QDO(SD/-Trp/-His/-Leu/-Ade)/X-α-gal（Clontech，CA,USA）培養(yǎng)基上，觀察菌斑顏色變化。

1.2.5.2 Pull down實驗將PuEBF1和PuEBF2分別構(gòu)建至pEAZY-E1載體,PuEIN3構(gòu)建至pGEX4T-1載體。將構(gòu)建好的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒并導(dǎo)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中（cat.no.CD601-02,全式金,北京），放置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。通過PCR擴(kuò)增篩選出陽性克隆的菌落。轉(zhuǎn)化成功后進(jìn)行標(biāo)簽融合蛋白的誘導(dǎo)，通過SDS-PAGE電泳檢測蛋白是否誘導(dǎo)成功。純化誘導(dǎo)成功后的蛋白。

純化出GST標(biāo)簽的蛋白,與GST(陰性對照)蛋白質(zhì)分別加入到含有His標(biāo)簽蛋白的柱料中(Ni-NTA Resin),孵育1h；孵育過后用SBB buffer洗脫未結(jié)合的蛋白3次，然后用SEB buffer洗脫蛋白質(zhì)，最后用Anti GST抗體對其進(jìn)行Western blot檢測確定2個目的蛋白是否存在互作[20-21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙烯和1-MCP處理對采后南果梨果實乙烯生成量和硬度變化的影響

試驗結(jié)果顯示，在貯藏期間南果梨果實的乙烯生成量逐漸升高，果實硬度逐漸下降；并且乙烯生成量明顯的受到1-MCP處理的抑制和乙烯的促進(jìn)（圖1）。

圖1 南果梨貯藏過程中乙烯及硬度變化Figure 1 The changes of ethylene production and firmness in post-harvest stage of Nanguo pear

2.2 PuEIN3的克隆及表達(dá)分析

試驗結(jié)果顯示，PuEIN3全長序列為1824 bp，編碼607個氨基酸，蛋白質(zhì)分子量約為72.84kD。擬南芥EIN3有5個基本的結(jié)構(gòu)域（basic domain，BD）[5]：BD I 53~66,BD II 88~94，BD III 238~248，BD IV 265~274，BD V 378~384。對克隆得到的PuEIN3序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該序列也包含著5個結(jié)構(gòu)域（圖2），可見克隆的梨的EIN3序列是正確的。

圖2 PuEIN3的結(jié)構(gòu)域分析Figure 2 Structural domain analysis of PuEIN3

對PuEIN3在南果梨貯藏期的表達(dá)特性分析結(jié)果表明，PuEIN3的的表達(dá)量無明顯變化規(guī)律（圖3）。由此推測，PuEIN3的表達(dá)是受翻譯后調(diào)控。

圖3 果實成熟關(guān)鍵基因PuEIN3的表達(dá)分析Figure 3 Expression analysis of the key gene in fruit ripening PuEIN3

2.3 PuEBF1和PuEBF2的克隆及表達(dá)分析

為驗證PuEIN3是否受泛素化調(diào)控，克隆了負(fù)責(zé)與EIN3識別的2個F-box基因，命名為PuEBF1和PuEBF2。PuEBF1全長1875bp，編碼624個氨基酸；PuEBF2全長1941bp，編碼646個氨基酸。對2個基因在梨貯藏過程中的表達(dá)特性分析結(jié)果表明，實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)PuEBF1的表達(dá)量受到1-MCP的抑制和乙烯的促進(jìn)，而PuEBF2基因表達(dá)并無明顯規(guī)律（圖4）。

圖4 PuEBF1（a）和PuEBF2（b）的表達(dá)分析Figure 4 Expression analysis of PuEBF1（a）and PuEBF2（b）

2.4 PuEIN3與PuEBF1和PuEBF2的互作驗證

2.4.1 酵母雙雜交實驗驗證PuEIN3與PuEBF1和PuEBF2互作為研究PuEIN3是否能夠與負(fù)責(zé)對其標(biāo)記泛素的EBF結(jié)合，從而被泛素化降解，進(jìn)行了后續(xù)的實驗。酵母雙雜交實驗結(jié)果顯示，含有PuENI3和PuEBF1和PuEBF2的菌株在含有X-α-gal的QDO培養(yǎng)基上能夠變藍(lán)（圖5），說明PuEIN3能夠與PuEBF1和PuEBF2互作。

圖5 PuEBF1、PuEBF2與PuEIN3互作的酵母雙雜交實驗Figure 5 Yeast two-hybrid experiment of PuEBF1,PuEBF2 and PuEIN3 interaction

2.4.2 Pull down實驗驗證PuEIN3與PuEBF1和PuEBF2互作為進(jìn)一步確定PuEBF1和PuEBF2與PuEIN3蛋白的互作關(guān)系，設(shè)計了Pull down實驗。先分別純化出PuEBF1-His、PuEBF2-His和PuEIN3-GST蛋白，用PuEBF1-His、PuEBF2-His蛋白掛柱，加入PuEIN3-GST蛋白孵育1h，然后利用SEB洗脫并用Western-blot檢測，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)同時加入PuEIN3-GST蛋白（圖6），PuEBF2-His和PuEIN3-GST蛋白（圖7）洗脫下的蛋白泳道同時檢測到His及GST信號，然而加入GST空載體對照只檢測到His信號?？梢?，PuEBF1和PuEBF2與Pu?EIN3蛋白存在互作。

圖6 PuEBF1與PuEIN3互作的Pull down實驗Figure 6 Pull down experiment of PuEBF1 and PuEIN3 interaction

圖7 PuEBF2與PuEIN3互作的Pull down實驗Figure 7 Pull down experiment of PuEBF2 and PuEIN3 interaction

3 討論與結(jié)論

乙烯作為一種重要的激素參與植物生長發(fā)育的眾多過程，南果梨是典型的呼吸躍變型果實，其成熟過程主要受乙烯調(diào)控。EIN3是乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要的轉(zhuǎn)錄因子，但是其表達(dá)模式以及是否受泛素化途徑調(diào)控在南果梨中仍無相關(guān)報道。

EIN3屬于EIL（EIN3-like）轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[22]。CHAO等[5]首次從乙烯不敏感擬南芥突變體中鑒定得到EIN3，不同的物種中其家族基因的數(shù)目也不盡相同，如擬南芥中有6個，而在煙草、番茄和水稻中分別含有5個、4個和6個[23-25]。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)EIN3和EINL1基因同時被突變掉之后，擬南芥在黃化苗時期和成年植株期都表現(xiàn)出對乙烯不敏感，說明EIN3在乙烯反應(yīng)過程中起到正調(diào)控作用[6]。梨的栽培種非常多，主要栽培種有白梨、沙梨、秋子梨和西洋梨。目前，針對白梨、沙梨和西洋梨典型的栽培品種已完成全基因組測序[26-28]。但是呈現(xiàn)的測序結(jié)果中并無關(guān)于EIL家族基因的信息，而且南果梨屬于秋子梨品種，與其他3個種遺傳背景差異非常大，因此如若參考其他梨的基因組會存在一定的偏差。鑒于此種情況，準(zhǔn)確的鑒定南果梨中是否存在多個EIL基因急需對南果梨進(jìn)行全基因組測序，目前我們正在開展南果梨基因組的測序工作，后續(xù)會展開相應(yīng)的分析。

不同植物中的EIN3和EILs的表達(dá)模式存在一定的差異。獼猴桃的AdEIL2和AdEIL4的表達(dá)量隨著果實成熟不斷升高，并且受到乙烯的誘導(dǎo)[29]。在受到250mg·L-1乙烯利處理后，葡萄VvEIL6的表達(dá)量顯著上升，而VvEIL2和VvEIL5的表達(dá)卻在乙烯抑制劑的處理下顯著增加[30]。香蕉的MA-EIL2隨著果實成熟表達(dá)量逐漸升高，并且受到乙烯的誘導(dǎo)[31]。黃金梨中的PpEIN3b在果實中大量表達(dá)，并且受到ACC（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid）處理的促進(jìn)和水楊酸的抑制[32]。南果梨中的EIN3的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平在果實貯藏期基本不發(fā)生變化，同樣也不受乙烯的調(diào)控。這點與黃金梨中的PpEIN3b存在一定的差異，推測可能是因為南果梨中存在其他與PpEIN3b表達(dá)模式相同的基因。

泛素化是一種普遍存在于生物中的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，參與眾多生命活動[33]。目前的研究認(rèn)為，作為乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要轉(zhuǎn)錄因子，EIN3蛋白水平的變化主要受泛素化途徑的調(diào)控。擬南芥中EIN3的mRNA的表達(dá)水平不受乙烯的調(diào)控，但蛋白水平受到ACC處理的誘導(dǎo)[3]，這為EIN3受泛素化途徑調(diào)控提供了直接證據(jù)。南果梨中EIN3的表達(dá)模式與擬南芥中類似，推測PuEIN3的蛋白水平變化同樣受泛素化途徑的調(diào)控，但仍需要檢測PuEIN3的蛋白水平變化來進(jìn)一步驗證。

擬南芥中的研究表明在乙烯信號途徑中負(fù)責(zé)與EIN3識別的有2個F-box基因，分別為EBF1和EBF2[4]。EBF1和EBF2在蛋白水平能夠與EIN3互作，并且在EBF1和EBF2突變的擬南芥植株中EIN3的蛋白表達(dá)水平大幅度升高；而當(dāng)過表達(dá)EBF1和EBF2時，幾乎檢測不到EIN3的蛋白表達(dá)[3-5]。這為EIN3被標(biāo)記泛素并被26S蛋白酶體降解進(jìn)一步提供了理論依據(jù)。南果梨中同樣存在2個EBF蛋白，PuEBF1和PuEBF2。酵母雙雜交實驗和Pull down實驗驗證PuEBF1和PuEBF2能夠分別與PuEIN3在蛋白水平互作，這為PuEIN3能夠被泛素化降解提供了初步的理論依據(jù)。

PuEIN3的表達(dá)水平在果實貯藏期基本不發(fā)生變化，并且能夠與PuEBF1和PuEBF2在蛋白水平互作，推測其受泛素化途徑調(diào)控，但仍需進(jìn)一步驗證。本研究為從分子水平調(diào)控果實成熟提供一定的理論依據(jù)。