馬周杰，何世道，龐欣宇，王禹博，張照然，唐爽爽，高增貴

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，沈陽 110161）

玉米大斑病作為世界玉米生產(chǎn)的一種葉部病害，在玉米生育期的多數(shù)階段均可造成為害，該病害在溫度15~25℃以及降水過多的地區(qū)普遍流行[1]。20世紀(jì)初，玉米大斑病已在世界所有玉米產(chǎn)區(qū)發(fā)生并流行[2]。據(jù)報(bào)道，在法國(guó)、奧地利以及美國(guó)等地區(qū)，由玉米大斑病造成的田間產(chǎn)量損失達(dá)到30%，有些年份甚至近50%[3-4]。1899年，在我國(guó)東北地區(qū)首次報(bào)道了玉米大斑病的發(fā)生，20世紀(jì)30年代后期，該病害遍及我國(guó)玉米主產(chǎn)區(qū)，主要流行于東北、華北北部、西北和南方山區(qū)等冷涼玉米產(chǎn)區(qū)[5]。80年代初，隨著抗病品種的廣泛應(yīng)用和推廣，玉米大斑病曾一度得到有效控制，但后期由于生理小種的變異以及先玉335等感病品種的大面積種植，玉米生產(chǎn)再次遭受玉米大斑病的威脅，經(jīng)濟(jì)效益遭受嚴(yán)重影響，特別是在東北地區(qū)的春玉米種植區(qū)[6]。

玉米大斑病菌有性態(tài)為大斑剛毛座腔菌[Setosphaeria turcica(Luttr.)K.J.Leonard&Suggs]，屬子囊菌門剛毛座腔菌屬真菌，其有性生殖受MAT基因控制[7]。作為異宗配合真菌，玉米大斑病菌交配型分為僅含StMAT1-1基因的A交配型、僅含StMAT1-2基因的a交配型和2種基因都包含的Aa交配型[8]。玉米大斑病菌交配型存在明顯的分化現(xiàn)象，其A交配型和a交配型被指在熱帶地區(qū)分布均勻，而在溫帶地區(qū)表現(xiàn)出明顯的不平衡現(xiàn)象[3]，且同一國(guó)家的不同地區(qū)間交配型均存在顯著差異[9]。在國(guó)內(nèi)，孫淑琴[10]（2005）指出我國(guó)玉米大斑病菌主要存在3種交配型（A、a和Aa），Aa交配型的兩性菌株數(shù)量最大，而a交配型比例最小。王利智等[11]（2011）對(duì)云南省玉米大斑病菌進(jìn)行交配型檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)A交配型比例明顯大于a交配型。楊貝貝[12]（2020）報(bào)道a交配型已在組成上占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。可見，不同年份、不同地理區(qū)域間，玉米大斑病菌交配型組成及比例不同，自然條件下玉米大斑病菌遺傳變異加劇。

近幾年，SRAP分子標(biāo)記技術(shù)被越來越多的應(yīng)用于分析植物病原真菌遺傳多樣性[20-21]。但在國(guó)內(nèi)外尚未有關(guān)SRAP技術(shù)檢測(cè)玉米大斑病菌遺傳多樣性的報(bào)道。本試驗(yàn)利用SRAP技術(shù)對(duì)東北地區(qū)玉米大斑病菌遺傳多樣性進(jìn)行分析，并確定所有分離菌株的交配類型，進(jìn)一步討論遺傳多樣性、交配類型以及地理來源之間的關(guān)系，明確東北地區(qū)玉米大斑病菌遺傳動(dòng)態(tài)，為玉米大斑病的科學(xué)合理防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2017年9月在東北地區(qū)的黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古4個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)）34個(gè)市縣采集玉米大斑病病葉標(biāo)樣，用標(biāo)本紙壓制后帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌分離。

供試水瓊脂培養(yǎng)基為瓊脂18g，蒸餾水1000mL；PDA培養(yǎng)基為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂18g，蒸餾水1000mL；PD培養(yǎng)液為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL。

供試2×Power Taq PCR Master Mix、DL2000 DNA Marker和植物基因組DNA提取試劑盒均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；TAE和4S Green Plus Nucleic Acid Stain均購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；PCR引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離培養(yǎng)采用單孢分離法[22]從病葉標(biāo)樣上分離病原菌，首先通過敲打葉子將孢子轉(zhuǎn)移到水瓊脂培養(yǎng)基上，然后使用挑孢針在普通光學(xué)顯微鏡4倍物鏡下直接挑取單個(gè)孢子轉(zhuǎn)移至PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，將平板置于25℃光暗交替（12h/12h）培養(yǎng)7d后，4℃保存，同時(shí)用PD培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)，富集菌絲進(jìn)行DNA提取。通過分離培養(yǎng)，共從病葉標(biāo)樣上獲得57株病菌，其地理來源信息見表1，菌株編號(hào)由采集省份（自治區(qū)）漢語拼音首字母縮寫加數(shù)字組成。

表1 供試菌株地理來源信息及編號(hào)Table 1 Information of geographic source and codes of tested isolates

1.2.2 DNA提取及檢測(cè)挑取PD培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)后的菌絲用無菌雙層紗布過濾，用無菌蒸餾水洗滌3次后轉(zhuǎn)移至離心管中，-20℃冰凍后，使用真空冷凍干燥機(jī)干燥24h，置于預(yù)冷的研缽中，加入液氮迅速研磨，利用植物基因組DNA提取試劑盒提取各菌株DNA，測(cè)定OD260/OD280，確定其濃度與純度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 病原菌鑒定將純化后的單菌落接種至PDA培養(yǎng)基平板上，置于25℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，觀察菌落特征，并置于普通光學(xué)顯微鏡下觀察各菌株的微觀結(jié)構(gòu)。同時(shí)，以提取的DNA為模板，利用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）對(duì)ITS區(qū)序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25μL）：2×Power Taq PCR Master Mix，12.5μL；DNA模板，1μL；引物ITS1，1μL；引物ITS4，1μL；ddH2O補(bǔ)足至25μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，54℃退火1min，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃最終延伸10min；4℃保存產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%（w/v）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)拍照后，交于上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。將ITS測(cè)序結(jié)果與GeneBank中的Setosphearia turcica菌株序列（NCBI accession No.KJ380909.1）進(jìn)行比對(duì)。

1.2.4 交配類型分子鑒定以提取的DNA為模板，參照張泗舉[23]提出的玉米大斑病菌交配型測(cè)定引物進(jìn)行PCR鑒定。交配型基因StMAT1-1片段（A交配型）引物為MAT1-1-F（5’-ACAGGCTACTACATCACAATCC-3’）和MAT1-1-R（5’-ATAGTCGATCAATTCAGGCATG-3’），交配型基因StMAT1-2片段（a交配型）引物為MAT1-2-F（5’-CGTCCGATGAACTGCTGGATC-3’）和MAT1-2-R（5’-ACGCAGGTGTTCTTCTTTCGC-3’）。PCR反應(yīng)體系（25μL）：2×Power Taq PCR Master Mix，12.5μL；DNA模板，1μL；上游引物，1μL；下游引物，1μL；ddH2O補(bǔ)足至25μL。A交配型PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，55℃退火40s，72℃延伸90s，35個(gè)循環(huán)；72℃最終延伸10min；4℃保存產(chǎn)物。a交配型PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，53℃退火45s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃最終延伸10min；4℃保存產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%（w/v）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)擴(kuò)增條帶有無及大小確定交配型。

1.2.5 SRAP分析根據(jù)表2提供的10條正向隨機(jī)引物和10條反向隨機(jī)引物共產(chǎn)生了100對(duì)引物組合。隨機(jī)選擇5個(gè)菌株DNA用于引物篩選，選擇條帶清晰、豐富且穩(wěn)定的引物組合進(jìn)行SRAP分析。PCR反應(yīng)體系（25μL）：2×Power Taq PCR Master Mix，12.5μL；DNA模板，1μL；上游引物，1μL；下游引物，1μL；ddH2O補(bǔ)足至25μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，30~40℃退火1min（各引物組合最適溫度不同），72℃延伸1min，5個(gè)循環(huán)；94℃變性1min，50~56℃退火1min（各引物組合最適溫度不同），72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃最終延伸10min；4℃保存產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%（w/v）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并拍照，對(duì)電泳圖譜條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，在相同遷移率下，同一位置出現(xiàn)條帶記為“1”，沒有觀察到條帶記為“0”，以所得數(shù)據(jù)構(gòu)建二元數(shù)據(jù)矩陣，利用NTSYS pc 2.1軟件分析遺傳多樣性，聚類分析通過算術(shù)平均法（UPGMA）進(jìn)行。

由表2可知，不同配方制作的油茶湯色不同。加入花生及魚粉的油茶湯色為乳狀綠色，加入冰鮮烏龍茶的油茶湯色偏黃、稍暗，加入羅漢果和石崖茶油茶的茶湯色顏色較相同，對(duì)比原料嫩度相同無輔料添加的配方，湯色較淺。各配方制作的油茶湯色排名為配方2＞（配方3，配方4，配方5） ＞配方1＞配方 6＞配方 7＞配方 8＞配方 9＞CK。

表2 SRAP引物序列Table 2 Sequences of SRAP primers

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的鑒定

利用普通光學(xué)顯微鏡觀察，所有供試菌株的菌落正圓形，呈黑褐色（圖1A）；菌絲為灰黑色，分生孢子梗單生或簇生，呈直立狀或彎曲狀，褐色，具2~6個(gè)橫隔膜，（30.2~180.6）×（2.7~5.2）μm（圖1B）；分生孢子頂側(cè)生，淡黃褐色，呈長(zhǎng)梭形或紡錘形，中下部較寬，存在明顯臍點(diǎn)，具2~8個(gè)橫隔膜，（58.7~106.8）×（11.2~23.6）μm（圖1C）。同時(shí)，所有分離菌株均用ITS1/ITS4引物擴(kuò)增出約600bp的條帶，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列結(jié)果與GeneBank中的Setosphearia turcica菌株序列（NCBI accession No.KJ380909.1）進(jìn)行比對(duì)，同源性性均高達(dá)100%。因此，所有分離株均被鑒定為凸臍蠕孢菌，為玉米大斑病病原菌。

圖1 供試菌株形態(tài)學(xué)特征Figure 1 Morphology of tested isolates

2.2 玉米大斑病菌交配型組成分析

利用鑒定交配型的2對(duì)特異性引物對(duì)57株供試菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示（圖2），只擴(kuò)增出800bp左右目的條帶的菌株為A交配型菌株，只能擴(kuò)增出250bp左右目的條帶的菌株為a交配型菌株，同時(shí)可以擴(kuò)增出2個(gè)目的條帶的菌株為Aa交配型菌株，無條帶擴(kuò)增結(jié)果的菌株為中性菌株。

圖2 部分供試菌株交配型基因MAT1-1和MAT1-2電泳圖譜Figure 2 The electrophoresis results of mating type genes MAT1-1 and MAT1-2 of some tested isolates

在供試的57個(gè)菌株中，A交配型的（僅包含MAT1-1）共有12株，占菌株總數(shù)的21.05%，而a交配型的（僅包含MAT1-2）共有45株，占菌株總數(shù)的78.95%，并未檢測(cè)到Aa交配型菌株和中性菌株（表3）。從東北地區(qū)各?。ㄗ灾螀^(qū)）交配型的分布情況來看，a交配型菌株數(shù)量均明顯大于A交配型，表明a交配型為東北地區(qū)玉米大斑病菌優(yōu)勢(shì)交配型，玉米大斑病菌交配型種類在地理分布上存在隨機(jī)性。

表3 東北地區(qū)玉米大斑病菌交配型鑒定Table 3 Mating type determination of Setosphaeria turcica in Northeast China

2.3 玉米大斑病菌遺傳多樣性分析

2.3.1 SRAP-PCR擴(kuò)增結(jié)果對(duì)100對(duì)引物組合進(jìn)行初篩，最終有8對(duì)引物能夠擴(kuò)增出清晰、多態(tài)性豐富、分布均勻且穩(wěn)定性較好的條帶。利用這8對(duì)SRAP引物進(jìn)行2輪退火溫度的篩選，根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜各條帶的明亮整齊程度確定每一對(duì)引物的退火溫度組合（表4）。8對(duì)引物組合共擴(kuò)增出64條帶，其中引物組合Me5/Em9和Me8/Em1可擴(kuò)增出數(shù)量最多的10條帶，而Me3/Em3僅可擴(kuò)增出數(shù)量最少的5條帶，在64條帶中有44條帶為多態(tài)性條帶，不同引物組合可擴(kuò)增出3~7條多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率為60.00%~77.78%，平均每個(gè)引物組合擴(kuò)增出5.5個(gè)多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率達(dá)到68.75%，表明玉米大斑病菌存在遺傳分化現(xiàn)象，菌株間表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。

表4 SRAP引物組合篩選及擴(kuò)增結(jié)果Table 4 SRAP primer combination screening and amplification results

2.3.2 玉米大斑病菌聚類分析結(jié)果聚類分析系結(jié)果表明（圖3），從東北地區(qū)分離的57株玉米大斑病菌遺傳相似系數(shù)介于0.76~1.00。當(dāng)閾值為0.76時(shí)，供試菌株被分為2個(gè)類群（SRAP groups，SGs），其中SGI僅包含9個(gè)菌株，占菌株總數(shù)的15.79%；其余的48個(gè)菌株均被聚類到SGII，占菌株總數(shù)的84.21%；當(dāng)閾值為0.78時(shí)，SGII又可分為2個(gè)亞類群（SRAP subgroups，SSGs），其中SSGII包含3個(gè)菌株（HLJ01、JL01和JL02），其余的45個(gè)菌株均被聚類到SSGI；當(dāng)閾值為0.82時(shí)，供試的所有菌株又可被分為4個(gè)SGs。由此說明東北地區(qū)玉米大斑病菌存在遺傳分化現(xiàn)象。進(jìn)一步分析后發(fā)現(xiàn)，來自同一地區(qū)的供試菌株被劃分到不同的類群或亞類群中，例如，盡管NM06和NM05都是從內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市的標(biāo)樣中分離出來的，但它們分別分配到SGI和SGII中。同時(shí)，來自不同省市的部分供試菌株被劃分為同一類群，例如，SGI中菌株地理來源就包括黑龍江省的黑河市（HLJ03）和綏化市（HLJ04），吉林省的白城市（JL07）和吉林市（JL11），遼寧省的丹東市（LN02）、阜新市（LN15）和大連市（LN20和LN23）以及內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市（NM06）4省8市縣。綜上，玉米大斑病菌SRAP類群的劃分與菌株的地理來源沒有明顯的相關(guān)性。另外，由聚類分析樹狀圖中各菌株交配型分布可以看出，SGI中所有菌株均為A交配型，a交配型菌株均聚集于SGII，由此可見，玉米大斑病菌菌株遺傳類群和交配型在分子水平上存在密切關(guān)系。

圖3 東北地區(qū)玉米大斑病菌菌株SRAP聚類分析圖譜Figure 3 Cluster analysis of isolates of Setosphearia turcica in Northeast China based on SRAP

3 討論與結(jié)論

玉米大斑病在東北各玉米產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，其是玉米生產(chǎn)上不可忽視的重要病害。我國(guó)玉米大斑病菌存在不同的交配類型（A交配型和a交配型），并具有有性生殖的潛力，這可能導(dǎo)致玉米大斑病菌的遺傳變異。對(duì)異宗配合的真菌來說，有性生殖受交配基因MAT的控制，交配類型A和a分別由MAT1-1和MAT1-2基因編碼[7]。BUNKOED等[24]報(bào)道泰國(guó)玉米大斑病菌A交配型與a交配型比例接近1∶1，在國(guó)內(nèi)，孫淑琴等[10]報(bào)道我國(guó)玉米大斑病菌中Aa交配型的兩性菌株數(shù)量最大，王利智等[11]發(fā)現(xiàn)云南省玉米大斑病菌A交配型比例明顯大于a交配型。同時(shí)，NELSON[25]報(bào)道了玉米大斑病菌存在雙性菌株和中性菌株，玉米大斑病菌的交配類型不是簡(jiǎn)單的雙極性。而在本研究中，只檢測(cè)出了a和A兩種交配類型，且a交配型比A交配型更為普遍，說明不同地區(qū)玉米大斑病菌交配型組成情況存在較大差異，遺傳背景趨于多態(tài)化和復(fù)雜化。

分子標(biāo)記技術(shù)已被廣泛用于研究真菌中的遺傳多樣性，本研究通過計(jì)算SRAP程序中引物的2輪退火溫度，擴(kuò)增清晰，穩(wěn)定和重復(fù)性較好的DNA條帶，并從不同的分離菌株中獲得具有較高多態(tài)性的DNA片段。這些結(jié)果表明SRAP技術(shù)是研究玉米大斑病菌遺傳變異和親緣關(guān)系的有效方法。同時(shí)，本研究首次利用SRAP技術(shù)分析東北地區(qū)玉米大斑病菌遺傳多樣性。結(jié)果表明，57個(gè)供試菌株之間存在遺傳差異，8個(gè)引物組合共擴(kuò)增出64條條帶，其中多態(tài)性條帶為44個(gè)，平均每個(gè)引物組合擴(kuò)增出5.5個(gè)多態(tài)性條帶，多態(tài)性比例為68.75%，略低于之前的報(bào)道[26]。同時(shí)，本研究SRAP標(biāo)記用簡(jiǎn)單的瓊脂糖凝膠分析代替了更敏感的聚丙烯酰胺凝膠銀染或熒光標(biāo)記來檢測(cè)菌株擴(kuò)增DNA片段的條帶；這也可能是多態(tài)性比率較低的原因。FERGUSON等[9，14]分別通過RAPD和AFLP等方法證實(shí)玉米大斑病菌存在豐富的遺傳多態(tài)性。在歐洲，玉米大斑病菌遺傳結(jié)構(gòu)被報(bào)道與地理分布存在密切關(guān)系[27]，本研究卻發(fā)現(xiàn)遺傳多樣性與地理起源沒有顯著的相關(guān)性，這與MA等[28]和谷守芹等[17]關(guān)于不同地區(qū)玉米大斑病菌研究結(jié)論一致。本研究另發(fā)現(xiàn)，玉米大斑病菌遺傳多樣性與交配型之間存在密切關(guān)系,其可能是因?yàn)榻慌湫褪躆AT基因調(diào)控，其在分子水平與遺傳信息存在某種必然聯(lián)系。本研究只使用有限數(shù)量的引物，而且某些地區(qū)的菌株數(shù)量還不夠，有必要擴(kuò)大引物組合和菌株數(shù)量，以期通過SRAP分析更好地了解玉米大斑病菌遺傳多樣性與交配型之間的關(guān)系。此外，應(yīng)進(jìn)一步分析菌株的致病性和生理小種類型，以幫助更好地解釋所獲得SRAP分子標(biāo)記的遺傳信息。

在生產(chǎn)上，由于東北地區(qū)大量感大斑病玉米品種的種植以及適宜的氣候條件，玉米大斑病的發(fā)生日趨嚴(yán)重，因此應(yīng)加強(qiáng)對(duì)東北地區(qū)玉米大斑病菌遺傳結(jié)構(gòu)及其與交配型間密切關(guān)系的研究，明確其優(yōu)勢(shì)種群及遺傳動(dòng)態(tài)，為玉米大斑病的科學(xué)合理防治提供理論依據(jù)。