王澤平 宋修鵬 顏梅新 李毅杰 李翔 張小秋 唐紅琴 龍盛風(fēng)

摘要 本文旨在探討核苷酸結(jié)合位點(diǎn)和富含亮氨酸重復(fù)（NBS-LRR）類基因參與甘蔗抗梢腐病菌侵染應(yīng)答機(jī)制，為后續(xù)克隆關(guān)鍵抗病基因以及研究抗病機(jī)理提供理論依據(jù)。試驗(yàn)利用Illumina高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)檢測高抗梢腐病品種‘粵糖94-128和高感梢腐病品種‘桂糖37號(hào)接種前后NBS-LRR類抗梢腐病基因的表達(dá)情況，然后設(shè)計(jì)引物對(duì)顯著差異表達(dá)基因進(jìn)行不同接種時(shí)期下的熒光定量PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明，16個(gè)NBS-LRR類基因在甘蔗葉片受到梢腐病菌侵染后持續(xù)上調(diào)表達(dá)，但表達(dá)趨勢存在兩種情況，13個(gè)基因在誘導(dǎo)后7 d顯著或極顯著上調(diào)表達(dá)，3個(gè)基因在誘導(dǎo)7 d后上調(diào)表達(dá)不顯著，在誘導(dǎo)14 d后才顯著上調(diào)表達(dá)。據(jù)此可將其分為瞬時(shí)基礎(chǔ)防御基因（0～7 d）和滯后特異性防御基因（14～21 d），確定NBS-LRR類基因參與甘蔗防御梢腐病菌的侵染。

關(guān)鍵詞 甘蔗; 梢腐病; 轉(zhuǎn)錄組; NBS-LRR

中圖分類號(hào)： S 556.1， S 435.661

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.

2020301

Screening and quantitative analysis of NBS-LRR gene against pokkah boeng disease in sugarcane

WANG Zeping1， SONG Xiupeng1， YAN Meixin1， LI Yijie1， LI Xiang1，ZHANG Xiaoqiu1， TANG Hongqin2*， LONG Shengfeng3*

（1. Sugarcane Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Sugarcane Research Center，

Chinese Academy of Agricultural Science， Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic

Improvement （Guangxi）， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Nanning 530007， China;

2. Institute of Agricultural Resources and Environment， Guangxi Academy of Agricultural Sciences，

Nanning 530007， China; 3. Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530007， China）

Abstract

The molecular mechanism of nucleotide binding sites and leucine-rich replication （NBS-LRR） genes resistant to pokkah boeng disease （PBD） in sugarcane was explored to provide a theoretical basis for cloning resistant genes. This study firstly used Illumina high-throughput transcriptome sequencing technology to detect NBS-LRR genes against PBD with typical resistant and susceptive sugarcane materials， and then designed primers to verify the expression characteristics of significant differentially expressed NBS-LRR genes under different inoculation periods using real-time quantitative PCR （qRT-PCR）. The results showed that 16 NBS-LRR-like genes steadily increased expression when sugarcane leaves were infected with the PBD pathogen， including two trends in expression： 13 genes significantly or extremely significantly increased expression at 7 d post-inoculation， but three genes did not significantly increased expression at 7 d post-inoculation， but significantly increased expression at 14 d post-inoculation. Therefore， these genes could be divided into instantaneous basic defense genes （0 d to 7 d） and specific lagging defense genes （14 d to 21 d）， suggesting that NBS-LRR genes are actively involved in resistance against the PBD pathogen.

Key words

sugarcane; pokkah boeng disease; transcriptome; NBS-LRR

甘蔗梢腐?。╬okkah boeng disease）作為一種真菌性氣傳病害，其發(fā)生幾乎遍及所有的甘蔗生產(chǎn)國家和地區(qū)，在我國主產(chǎn)蔗區(qū)廣西已上升為僅次于黑穗病的主要病害[1]。生產(chǎn)上主要是通過噴施多菌靈進(jìn)行防治，而挖掘抗病基因進(jìn)而利用其進(jìn)行雜交聚合育種是解決當(dāng)前主栽甘蔗品種抗病性有限的重要途徑。隨著克隆技術(shù)的發(fā)展，目前對(duì)植物抗病基因的結(jié)構(gòu)有了全面的認(rèn)識(shí)，在許多植物中已克隆出抗病基因，且多種植物的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)和富含亮氨酸重復(fù)（nucleotide binding sites and leucine-rich replication，NBS-LRR）類抗病基因的數(shù)目已確定[2]。在甘蔗抗病基因同源序列研究方面，Rossi等[3]采用與典型病原菌抗性基因同源比對(duì)的方法，從甘蔗EST數(shù)據(jù)庫中獲得88個(gè)抗病基因同源片段（resistance gene analogs， RGAs），并研究了它們?cè)诟收峄蚪M中的分布;McIntyre等[4]從54個(gè)RGAs中確定了3個(gè)與甘蔗抗銹病相關(guān)的RGAs;Wanderley-Nogueira等[5]通過基因芯片研究表明，甘蔗抗病基因在非誘導(dǎo)條件下能在根莖葉中表達(dá);闕友雄等[6]從高抗甘蔗黑穗病品種‘NCo 376的基因組中克隆了一個(gè)NBS-LRR類基因的cDNA全長片段并推測其可能為抗病相關(guān)基因;賀爾奇等[7]根據(jù)已克隆的植物抗病基因保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)簡并引物，采用RT-PCR方法對(duì)抗病果蔗品種‘黔糖5號(hào)的RNA進(jìn)行擴(kuò)增，共獲得7條果蔗NBS-LRR類抗病同源基因，這些抗病基因同源序列與基因 RPM1 和RPS2的親緣關(guān)系較近[8]。本課題組在前期進(jìn)行甘蔗防御梢腐病菌侵染生理生化機(jī)制相關(guān)研究過程中，發(fā)現(xiàn)不同遺傳背景的甘蔗品種抗性存在顯著差異[9-11]。而對(duì)于大部分NBS類抗病基因來說，其只具有?；剐?，隨著病原菌的變異，植物抗病性很容易喪失。此外，利用Illumina RNA-Seq高通量測序技術(shù)可以對(duì)生物個(gè)體在特定時(shí)刻、特定組織的基因表達(dá)情況進(jìn)行整體水平研究，在發(fā)掘甘蔗目標(biāo)基因方面已得到充分應(yīng)用[12-13]。因此，本試驗(yàn)擬通過對(duì)高抗梢腐病品種‘粵糖94-128和高感梢腐病品種‘桂糖37號(hào)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，分析其接種梢腐病菌前后的差異基因表達(dá)譜，驗(yàn)證NBS-LRR 類抗病基因表達(dá)規(guī)律，為最終克隆獲得甘蔗抗梢腐病基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)以多次篩選鑒定的高抗甘蔗梢腐病品種‘粵糖94-128（‘YT 94-128）和高感甘蔗梢腐病品種‘桂糖37號(hào)（‘GT 37）作為轉(zhuǎn)錄組測序材料，以農(nóng)業(yè)農(nóng)村部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的輪枝鐮刀菌Fusarium verticillioides孢子懸浮液為接種液（孢子濃度為1×106個(gè)/mL）。在甘蔗5～6葉期采用針刺法[10]進(jìn)行接種，并遮陰保濕，保持大棚溫度20～35℃，濕度80%～85%。于病情指數(shù)最嚴(yán)重階段即接種后第14天采集甘蔗+1葉（接種病原菌和清水的2個(gè)甘蔗品種，各含3次生物學(xué)重復(fù)，共計(jì)12個(gè)樣品，每個(gè)樣品各1.000 0 g）經(jīng)液氮速凍，保存于-80℃冰箱備用。

1.2 葉片總RNA提取、cDNA文庫構(gòu)建及Illumina測序

利用TRIzol法提取樣品總RNA后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，向得到的mRNA中加入fragmentation buffer使其打斷成為短片段，再以打斷后的mRNA為模板，用6堿基隨機(jī)引物合成cDNA第一鏈，并加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成cDNA第二鏈，經(jīng)過QiaQuick PCR試劑盒純化并加入EB緩沖液洗脫后經(jīng)末端修復(fù)、加堿基A，加測序接頭，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而完成整個(gè)文庫制備工作，構(gòu)建好的文庫用Illumina HiSeqTM 2000進(jìn)行測序。

1.3 引物設(shè)計(jì)

本研究從R 基因與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中[亞洲栽培稻Oryza sativa、短花藥野生稻O.brachyantha、秈稻O.sativa indica group、粳稻O.sativa japonica group、

美國蒺藜草Cenchrus americanus、狗牙根Cynodon dactylon、甘蔗品種‘N 11Saccharum hybrid cultivar ‘N 11、

甘蔗品種‘LCP 85-384 Saccharum hybrid cultivar ‘LCP 85-384、甘蔗品種‘NCo 376 Saccharum hybrid cultivar ‘NCo376、大麥Hordeum vulgare]比對(duì)上的Unigenes中選擇16個(gè)顯著差異表達(dá)的Unigenes進(jìn)行熒光定量分析，研究其在梢腐病菌誘導(dǎo)后的表達(dá)趨勢。引物設(shè)計(jì)選用軟件Primer 5.0，引物序列見表1。本試驗(yàn)內(nèi)參基因25S rRNA正向引物5′-GCAGCCAAGCGTTCATAGC-3′，反向引物5′-CCTATTGGTGGGTGAACAATCC-3′[14]。

1.4 基因表達(dá)量分析

Unigene表達(dá)量的計(jì)算使用RPKM法（reads per kb per million reads），其計(jì)算公式為：RPKM=（1 000 000×C）/（N×L/1 000）。設(shè)RPKM為Unigene A的表達(dá)量，則C為比對(duì)到Unigene A的reads數(shù)，N為比對(duì)到所有Unigene的總reads數(shù)，L為Unigene A的堿基數(shù)。RPKM法能消除基因長度和測序量差異對(duì)計(jì)算基因表達(dá)的影響，計(jì)算得到的基因表達(dá)量可直接用于比較不同樣品間的基因表達(dá)差異。

1.5 抗性相關(guān)基因的表達(dá)模式分析

采用qPCR分析抗病品種‘YT 94-128在梢腐病菌誘導(dǎo)下與抗性相關(guān)的基因表達(dá)情況。分別選取梢腐病菌誘導(dǎo)及清水處理后7、14 d和21 d葉片的cDNA為模板。熒光定量試劑盒選用SYBR Premix EX TaqTM（TaKaRa公司），儀器選用Applied Biosystems 7500 Fast。每個(gè)樣品重復(fù)3次。采用2—△△Ct法[15]計(jì)算目的基因在不同樣品中的表達(dá)量。計(jì)算公式：RQ=2—△△Ct;△△Ct=△Ct2-△Ct1;△Ct1=目的基因Ct1-內(nèi)參基因Ct1;△Ct2=目的基因Ct2-內(nèi)參基因Ct2;結(jié)果繪制成柱狀圖。其中，Ct表示擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到一定閾值時(shí)需要的循環(huán)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA 檢測

對(duì)‘YT 94-128和‘GT 37接種梢腐病菌后14 d的葉片進(jìn)行RNA提取。樣本初始濃度都大于200 μg/μL，RNA integrity number（RIN值）大于7，總量都超過7 μg，樣本無DNA、雜質(zhì)污染，無降解或者輕微降解，樣品質(zhì)量滿足建庫測序要求，且總量滿足2次或者2次以上建庫需要。

2.2 候選抗病基因的表達(dá)情況

從‘YT 94-128和‘GT 37中的轉(zhuǎn)錄本中共獲得174個(gè)NBS-LRR基因，其中‘YT 94-128含162個(gè)，‘GT 37含171個(gè)，兩者間不同的有18個(gè)，相同的有156個(gè)，然后進(jìn)一步篩選出顯著差異表達(dá)的16個(gè)NBS-LRR類Unigenes（RPKM值的倍數(shù)變化>1.0，見表1）。16個(gè)Unigenes在抗病品種‘YT 94-128中均為上調(diào)表達(dá)，其中Unigene0008680接種后較之接種清水差異表達(dá)倍數(shù)最大，但表達(dá)量并不高，而Unigene0064857接種病原菌后的差異表達(dá)倍數(shù)僅為1.19，但其表達(dá)量最高。這16個(gè)Unigenes在感病品種‘GT 37接種病原菌后或上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，Unigene0074043在接種清水情況下不表達(dá)，但在接種病原菌后卻能夠注釋到其基因信息。代謝通路分析顯示大部分Unigenes存在于植物與病原體相互作用的通路中（ko04626），還有部分Unigenes存在苯丙烷類代謝途經(jīng)中（ko00940）?？傮w來看，NBS-LRR類基因在受到病原菌誘導(dǎo)后會(huì)持續(xù)上調(diào)表達(dá)，表達(dá)方式可分為兩種情況：3個(gè)基因（Unigene0054622、Unigene0008546、Unigene0064857）在病原菌誘導(dǎo)7 d后上調(diào)表達(dá)不顯著，誘導(dǎo)14 d后才顯著上調(diào)表達(dá);其他13個(gè)基因快速被誘導(dǎo)表達(dá)，即在梢腐病菌誘導(dǎo)后7 d顯著或極顯著上調(diào)表達(dá)。這表明NBS-LRR類基因積極參與甘蔗防御梢腐病菌的侵染反應(yīng)，據(jù)此將其分為瞬時(shí)基礎(chǔ)防御基因（0～7 d）和滯后特異性防御基因（14～21 d）。

2.3 候選抗病基因表達(dá)的熒光定量PCR分析

對(duì)抗病品種‘YT 94-128中主要涉及活性氧代謝、基質(zhì)蛋白輸入和受體再循環(huán)、腺苷酸載體以及過氧化物酶體組成部分的4個(gè)Unigenes進(jìn)行熒光定量分析發(fā)現(xiàn)（圖1），各基因在接菌處理的樣品中表達(dá)量都顯著或極顯著高于清水處理的樣品，驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果，并表現(xiàn)出隨著病原菌侵染程度加劇，其含量逐漸積累，但表達(dá)模式具有一定差異。其中，Unigene0030984、Unigene0007184屬于高或較高豐度表達(dá)基因，而Unigene0008680、Unigene0074043屬于低豐度表達(dá)基因。

3 結(jié)論與討論

利用轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)掘甘蔗目標(biāo)基因是一種常規(guī)方法，已有研究表明甘蔗轉(zhuǎn)錄組序列中存在大量未知信息的轉(zhuǎn)錄本[16-17]。通過抗病相關(guān)基因識(shí)別病原物入侵，從而誘導(dǎo)植物產(chǎn)生過敏反應(yīng)（hypersensitive reaction， HR）或者隨后引起系統(tǒng)抗性，是植物抗病性重要組成部分[18]。本試驗(yàn)基于甘蔗抗病種質(zhì)資源創(chuàng)制需要，利用轉(zhuǎn)錄組測序從抗病品種‘YT 94-128和感病品種‘GT 37中獲得了甘蔗響應(yīng)梢腐病菌侵染的差異基因表達(dá)譜，篩選出16個(gè)NBS-LRR類抗病Unigenes，極大豐富了甘蔗抗病基因信息，也說明了不同植物NBS-LRR抗病基因的總數(shù)及其各亞家族中基因數(shù)目都各不相同[19]。

基因功能注釋結(jié)果（轉(zhuǎn)錄組測序后的注釋信息）表明這16個(gè)Unigenes含有NBS、LRR、ARC等抗病保守結(jié)構(gòu)域，且Unigene0012327、Unigene0040908、Unigene0065328以及Unigene0054622與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶WNK1同源，Unigene0008680、Unigene0006333以及Unigene0007184與抗病蛋白（pathogenesis related， PR） RGA2同源，Unigene0014727和Unigene0039476與過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白同源，Unigene0030984與抗病蛋白R(shí)PS2同源。這與前人獲得的11條甘蔗抗黑穗病基因同源序列中的kinase-2（LLVL DDVW/D）最后一個(gè)氨基酸皆為色氨酸的結(jié)果形成驗(yàn)證[14]，也表明梢腐病菌侵染甘蔗使其葉片發(fā)生系統(tǒng)性HR反應(yīng)，從而引起局部細(xì)胞死亡。這部分的細(xì)胞死亡可以延緩或抑制病原菌的生長和擴(kuò)散，也使得這部分細(xì)胞與周圍的健康細(xì)胞相區(qū)別。來源于感染處的信號(hào)分子誘導(dǎo)甘蔗的其余部分產(chǎn)生局部獲得抗性或系統(tǒng)獲得抗性，以防止病原菌的擴(kuò)散和二次侵染?？赡苁歉收峥剐韵嚓P(guān)基因和梢腐病菌無毒基因識(shí)別后的信號(hào)傳遞激活了包括ROS的生成和各類防衛(wèi)反應(yīng)。雖然，這16個(gè)Unigenes均具有NBS-LRR結(jié)構(gòu)特征，但尚不能根據(jù)其序列特征來作為判定甘蔗抗梢腐病性狀的分子指標(biāo)，只能視其與抗病基因連鎖，或者為抗病基因的一部分[20]。若這些基因與甘蔗梢腐病抗性有關(guān)，則該結(jié)構(gòu)域可能在甘蔗對(duì)梢腐病的抗性中參與病原識(shí)別，或與ATP（GTP）結(jié)合，提供能量，最終激活激酶或G蛋白，參與蛋白質(zhì)磷酸化，放大抗病反應(yīng)信號(hào)，使甘蔗對(duì)病原產(chǎn)生HR反應(yīng)[21]，這有待于進(jìn)一步序列分析和功能驗(yàn)證。

綜上所述，本文在獲得差異基因表達(dá)譜的基礎(chǔ)上，根據(jù)已知植物抗病基因保守區(qū)設(shè)計(jì)簡并引物，成功驗(yàn)證了NBS-LRR表達(dá)規(guī)律，可為最終克隆獲得甘蔗抗梢腐病基因奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：田 喆）