王 玥， 丁 燕，2 ， 朱 靖 博，2

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院， 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 植物資源化學(xué)與應(yīng)用研究所， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

三七(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H. Chen)具有活血化瘀、消腫定痛的功效[1-2]，皂苷類物質(zhì)是三七中主要的有效成分[3]。迄今已從三七的底根部、根基剪口、葉子、果實(shí)等部位分離和鑒定出120余種皂苷類化合物，基本闡明了他們的化學(xué)結(jié)構(gòu)[4]。三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd為三七中含量較高的5種皂苷，質(zhì)量分?jǐn)?shù)占總皂苷的90%[5]。我國(guó)2015年版藥典規(guī)定，以該5種皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)控制三七質(zhì)量。有文獻(xiàn)報(bào)道，人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1對(duì)神經(jīng)元損傷、血管內(nèi)壁損傷都有明顯保護(hù)作用[6-7]。因此，規(guī)模化制備三七中皂苷類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)其藥理作用的進(jìn)一步研究與三七藥材的質(zhì)量控制具有重要意義。以往的研究中，多采用硅膠柱層析法[8]與大孔吸附樹脂柱層析法[9]制備三七中皂苷類物質(zhì)，存在單次上樣量較少等影響制備效率的問題。LK1300S小顆粒樹脂是一種新型的高分子吸附劑，具有吸附容量大、可重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)分離純化中藥中的有效成分具有制備效率高的優(yōu)勢(shì)。

近年來，關(guān)于三七中皂苷類物質(zhì)制備分離的研究中，樣品分離量普遍低于2 kg，且主要皂苷得率大多低于5%[10-12]。本研究首次采用LK1300S小顆粒樹脂柱層析法與結(jié)晶法對(duì)三七總皂苷提取物進(jìn)行規(guī)?；蛛x，并對(duì)其中含量較高的皂苷成分進(jìn)行制備，以期得到純度較高的人參皂苷Rb1組分。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三七總皂苷提取物，珍寶島藥業(yè)股份有限公司；三七總皂苷對(duì)照品，大連博邁科技發(fā)展有限公司；薄層色譜硅膠，煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所；LK1300S小顆粒樹脂，珍寶島藥業(yè)股份有限公司。

R502B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；DAC組合式動(dòng)態(tài)軸向壓縮工業(yè)色譜，大連博邁科技發(fā)展有限公司；高效液相色譜S6000，華譜新創(chuàng)新技術(shù)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 樣品的制備

樣品準(zhǔn)備：取三七總皂苷提取物(呈棕色膏狀)17 kg，加去離子水完全溶解。采用真空抽濾裝置對(duì)樣品水溶液進(jìn)行過濾處理。

分析溶液的配制：取三七總皂苷對(duì)照品和提取物各50 mg，加甲醇溶解，配制成5.0 mg/mL的溶液。

1.2.2 填料預(yù)處理

取LK1300S小顆粒樹脂20 kg于塑料桶內(nèi)，加入乙醇沒過樹脂2～3 cm，浸泡3～4 h。用去離子水充分淋洗樹脂至無明顯乙醇?xì)馕丁?/p>

1.2.3 裝柱及平衡

采用動(dòng)態(tài)軸向壓縮工業(yè)色譜柱(DAC，250 mm×1 200 mm)，將20 kg經(jīng)預(yù)處理后的LK1300S小顆粒樹脂緩慢填入色譜柱內(nèi)，上下篩板為5 μm。柱內(nèi)填料壓實(shí)后，色譜柱的實(shí)際分離高度為1 070 mm。用150 L去離子水以體積流量300 mL/min對(duì)色譜柱內(nèi)環(huán)境進(jìn)行沖洗平衡。

1.2.4 分析方法

1.2.4.1 薄層色譜定性分析

展開劑為體積比6.5∶3.5的氯仿-甲醇混合液，香草醛-濃硫酸噴淋、電熱爐105 ℃加熱1～2 min，顯色條件下對(duì)每組餾分進(jìn)行薄層檢測(cè)。根據(jù)Rf合并相似餾分。

1.2.4.2 液相色譜定量分析

色譜柱，C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-水(B)，體積流量1.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，溫度為室溫，進(jìn)樣量10 μL。洗脫梯度：0～20 min，20% A； 20～45 min，46% A； 45～55 min，55% A； 55～60 min，55% A； 60～70 min，90% A； 72～90 min，20% A。

三七總皂苷對(duì)照品及提取物液相色譜如圖1所示。圖中三七皂苷R1保留時(shí)間16.2 min，人參皂苷Rg1保留時(shí)間23.3 min，人參皂苷Re保留時(shí)間27.4 min，人參皂苷Rb1保留時(shí)間37.4 min，人參皂苷Rd保留時(shí)間44.3 min。

(a) 對(duì)照品

(b) 提取物

1.2.5 分析柱到制備色譜柱的線性放大

通過計(jì)算放大系數(shù)換算出上樣量和體積流量，對(duì)制備色譜柱分離實(shí)驗(yàn)過程中條件進(jìn)行優(yōu)化[13-14]。P和A分別代表制備型和分析型色譜。

(1)

qP=qAS

(2)

QP=QAS

(3)

tP=tAVP/VAS

(4)

式中：S為放大系數(shù)，r為色譜柱半徑，L為色譜柱柱長(zhǎng)；q為上樣量；Q為色譜體積流量；t為梯度延遲時(shí)間，V為柱體積。

線性放大只是一種理論依據(jù)，用于指導(dǎo)工業(yè)色譜制備條件的優(yōu)化，而在實(shí)際生產(chǎn)時(shí)，為了提高效率，必然會(huì)出現(xiàn)過載的現(xiàn)象[15-17]。如表1所示，接下來實(shí)驗(yàn)過程中是在過載的情況下對(duì)樣品進(jìn)行制備分離。

表1 分析柱到制備柱的放大設(shè)計(jì)參數(shù)Tab.1 Amplification design from analytical columnto preparative column

2 結(jié)果與討論

2.1 LK1300S小顆粒樹脂柱粗分離

將水溶樣品濾液以100 mL/min體積流量進(jìn)行上樣。首先用250 L(1～10號(hào))去離子水進(jìn)行洗脫，收集流出液；再分別用體積分?jǐn)?shù)為10%和70%的甲醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，各洗脫250 L(11～20號(hào)、21～31號(hào))；最后用甲醇洗脫100 L(31～34號(hào))。TLC跟蹤分析，合并相似餾分，得到3組目標(biāo)皂苷組分，如表2所示。從表2可以看出，經(jīng)去離子水和10%甲醇水溶液洗脫得到非目標(biāo)物質(zhì)共1.8 kg，對(duì)樣品進(jìn)行除雜；從21號(hào)開始用70%的甲醇水溶液洗脫，洗脫液中逐漸出現(xiàn)目標(biāo)皂苷物質(zhì)，合并濃縮后經(jīng)分析得到較純的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1富集組分，得率為37.05%。

表2 三七總皂苷提取物粗分離洗脫收集Tab.2 Crude separation, elution and collection of totalsaponin extracts of P. notoginseng

2.2 皂苷富集組分結(jié)晶除雜

向皂苷富集組分中加入30 L 30%的甲醇水溶液，室溫靜置一周后樣品溶液中析出白色結(jié)晶，進(jìn)行過濾處理。將所得母液組分濃縮稱重，質(zhì)量為5.63 kg；結(jié)晶組分揮干溶劑稱重，質(zhì)量為0.37 kg。對(duì)母液及結(jié)晶組分進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果如圖2所示。圖中母液組分中含原有4種目標(biāo)皂苷成分；結(jié)晶組分中含多種非目標(biāo)成分。說明通過本次結(jié)晶分離對(duì)皂苷富集組分進(jìn)行了除雜，總純度由48.8%提升至63.7%。

圖2 母液及結(jié)晶組分的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC of mother liquor and crystallinecomponents

2.3 LK1300S小顆粒樹脂柱二次制備分離

采用LK1300S小顆粒樹脂柱對(duì)結(jié)晶除雜后所得皂苷富集組分進(jìn)行二次分離。將水溶富集組分以100 mL/min上樣，首先用20%和30%的甲醇水溶液各洗脫250 L(1～20號(hào))；再用50%和80%的甲醇水溶液各洗脫350 L(21～48號(hào))；最后用甲醇洗脫150 L(49～54號(hào))。TLC跟蹤分析，合并相似餾分，共得到4組目標(biāo)皂苷組分，如表3所示。從表3中可以看出，經(jīng)20%和30%的甲醇水溶液洗脫，得到非目標(biāo)物質(zhì)共0.1 kg，去除富集組分中的前雜物質(zhì)；從第21號(hào)開始用50%的甲醇水溶液洗脫，洗脫液中逐漸出現(xiàn)目標(biāo)皂苷物質(zhì)；從第35號(hào)開始用80%甲醇水溶液洗脫，直至洗脫到第40號(hào)出現(xiàn)人參皂苷Rb1單物質(zhì)，合并濃縮后質(zhì)量為1.1 kg。如圖3所示，經(jīng)HPLC分析得到純度為83.2%的人參皂苷Rb1組分，得率為6.47%。

3 結(jié) 論

采用LK1300S小顆粒樹脂柱層析法結(jié)合結(jié)晶法對(duì)17 kg三七總皂苷提取物進(jìn)行制備分離，最終得到1.1 kg純度為83.2%的人參皂苷Rb1組分，得率提升至6.47%。該分離方法能有效地實(shí)現(xiàn)三七中人參皂苷Rb1的規(guī)?；苽浞蛛x。

表3 皂苷富集組分柱層析分離洗脫采集表

圖3 人參皂苷Rb1組分的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC of ginsenoside Rb1