宋 慧，王 濤，田禮新，張 揚(yáng)，李 龍，邢 璐，劉金榮，馮佰利

（1安陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究所/河南省谷子育種工程技術(shù)研究中心，河南安陽455000；2安陽工學(xué)院生物與食品學(xué)院，河南安陽455000；3西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌712100）

0 引言

谷子具有節(jié)水抗旱、耐貧瘠、耐儲(chǔ)藏的特點(diǎn)，是C3模式作物，對(duì)中國農(nóng)耕文化發(fā)展和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技有著重要作用[1-2]。近年來，隨著國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系持續(xù)支持，科研單位聯(lián)合攻關(guān)，在抗除草劑品種培育、精播免間苗、全程機(jī)械化管理、品質(zhì)提升、產(chǎn)業(yè)鏈延伸等領(lǐng)域取得突破性進(jìn)展，谷子的種植方式也由單戶向產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；较虬l(fā)展[3-6]。以河南省為例，2010—2018年，谷子種植面積由3.52萬hm2增長到4.89萬hm2，增幅達(dá)到34.4%，單產(chǎn)增加25.73%（數(shù)據(jù)來源于河南省種子管理站）；受谷子經(jīng)濟(jì)效益的影響，全省谷子種植面積總體上呈穩(wěn)中上升趨勢。但是，在雨熱同季的華北夏谷區(qū)，谷田雜草種類繁多，尤其谷田單子葉惡性雜草，苗期長相與谷苗相似，不易區(qū)別，不易剔除，往往造成減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重制約谷子產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[7-9]。

化學(xué)除草是谷田除草的主要方式和發(fā)展方向，目前谷子推廣的品種多為抗拿捕凈品種，需要2種除草劑配合使用才能徹底除草。咪唑啉酮類除草劑獨(dú)具兼殺單雙子葉雜草的優(yōu)勢，可防除眾多的一年生和多年生禾本科雜草以及闊葉雜草、莎草科雜草等[10-11]。藥物通過根、莖、葉處理后，經(jīng)由植株木質(zhì)部和韌皮部傳導(dǎo)，作用于植物分生組織，產(chǎn)生抑制植物的乙酰乳酸合成酶，阻止支鏈氨基酸，如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的生物合成，破壞蛋白質(zhì)的合成，干擾DNA合成及細(xì)胞的分裂與生長，引起植株死亡[12-14]?？剐云贩N的選育有效地解決了田間谷子見苗和除草問題，降低勞動(dòng)強(qiáng)度，節(jié)約勞動(dòng)成本，推進(jìn)了谷子輕簡化生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)程[15]。本研究團(tuán)隊(duì)從河北省農(nóng)林科學(xué)院谷子所引進(jìn)抗咪唑啉酮除草劑的突變材料，經(jīng)自交和回交得到一批抗咪唑啉酮類除草劑的育種材料。此材料對(duì)于抗咪唑啉酮類除草劑谷子品種的培育及谷子雜交種新型制種體系的構(gòu)建都具有十分重要的意義。然而，關(guān)于谷子對(duì)咪唑啉酮抗性的來源和遺傳尚不清楚。本研究以抗性谷子品系‘安5158’和敏感性谷子品種‘豫谷9號(hào)’為試驗(yàn)材料，通過抗性鑒定和抗性生理機(jī)制研究，分析谷子對(duì)除草劑產(chǎn)生敏感性的遺傳基礎(chǔ)，并對(duì)此敏感性基因進(jìn)行初定位，旨在為開展谷子抗除草劑分子標(biāo)記輔助選擇育種和轉(zhuǎn)基因育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源

材料來源于安陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究所資源庫。抗咪唑啉酮谷子新品系‘安5158’由安陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子所利用常規(guī)有性雜交和回交方法將青狗尾草的抗咪唑啉酮基因轉(zhuǎn)移至栽培谷子中，創(chuàng)制出了抗咪唑啉酮谷子新種質(zhì)，經(jīng)過系統(tǒng)選育而成，各項(xiàng)性狀穩(wěn)定。敏感型親本‘豫谷9號(hào)’植株經(jīng)濟(jì)性狀和抗性性狀純合一致。咪唑啉酮類除草劑為德國巴斯夫公司生產(chǎn)的甲咪唑煙酸水劑。

1.2 試驗(yàn)點(diǎn)自然概況

田間試驗(yàn)在河南省北關(guān)區(qū)柏莊鎮(zhèn)安陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地進(jìn)行，該區(qū)域位于太行山東南麓，黃河以北，114°37′E、36°18′N，屬暖溫帶氣候，海拔75 m，年平均氣溫13.6℃，年平均降水量606.1 mm，無霜期201天。供試土壤為黃壤土，土壤肥力中等，呈弱堿性(pH 7.64)，耕層土壤含有機(jī)質(zhì)1.31%、全氮0.85 g/kg、有效氮54.6 μg/g、速效磷20.4 μg/g、速效鉀212 μg/g。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 谷子萌發(fā)試驗(yàn) 試驗(yàn)于2017年5月在安陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。谷子種子發(fā)芽前用去離子水浮選去除癟粒，精選飽滿、大小一致的種子，用2%的雙氧水消毒10 min。在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿（直徑15 cm）中，分別加入不同濃度(0、150、200、250、300、350、400、450、500 mL/hm2)的甲咪唑煙酸藥液，每個(gè)培養(yǎng)皿均勻擺放100?？剐院兔舾行缘姆N子，每個(gè)處理3次重復(fù)，用雙層濾紙覆蓋，置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)（浙江拓普智能人工氣候箱RTOP-268D）培養(yǎng)，待發(fā)芽至第7天，統(tǒng)計(jì)不同處理的發(fā)芽情況，第15天調(diào)查種子存活粒數(shù)，計(jì)算存活率。

1.3.2 抗性效應(yīng)試驗(yàn) 試驗(yàn)于2017年在安陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院柏莊綜合試驗(yàn)站進(jìn)行。6月20日播種，待3葉1心期，噴施不同濃度甲咪唑煙酸進(jìn)行抗性效應(yīng)試驗(yàn)。小區(qū)行長3 m，行距0.4 m，每小區(qū)6行；設(shè)置6個(gè)處理，用藥量分別為0、150、250、350、450、500 mL/hm2，以不抗咪唑啉酮類除草劑的品種‘豫谷9號(hào)’為對(duì)照，均勻噴灑至葉面。噴藥1、4、7天分別取樣，每個(gè)小區(qū)取6株倒二葉葉片，測定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)生理指標(biāo)。

1.3.3 咪唑啉酮抗性的遺傳試驗(yàn) 2016年夏季將抗性材料‘安5158’和敏感材料‘豫谷9號(hào)’進(jìn)行有性雜交，2016年在海南試驗(yàn)基地鑒定F1和親本的抗性表現(xiàn)。2017年在夏季柏莊基地將F1與母本‘豫谷9號(hào)’進(jìn)行回交獲得BC1群體，2018年夏季在柏莊基地鑒定BC1分離世代的抗性表現(xiàn)，統(tǒng)計(jì)分離比例，進(jìn)行卡方測驗(yàn)。親本及各遺傳世代在谷子3～5葉期用德國巴斯夫公司生產(chǎn)的甲咪唑煙酸水劑，處理濃度為250 mL/hm2，5天不抗除草劑材料開始出現(xiàn)表型，15天后調(diào)查成活苗與死苗數(shù)。

1.4 生理指標(biāo)的測定

取谷子倒二葉葉片，測定葉片的生理生化指標(biāo)。采用SOD試劑盒（由南京建成生物工程研究所提供）測定SOD活性；采用POD試劑盒（由南京建成生物工程研究所提供）測定POD的活性；采用CAT試劑盒（由南京建成生物工程研究所提供）測定CAT的活性；采用BCA試劑盒（由南京建成生物工程研究所提供）測定MDA濃度。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

數(shù)據(jù)采用SPSS v19.0進(jìn)行顯著性分析，采用LSD方法進(jìn)行多重比較(P＜0.05)，采用Origin 8進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度甲咪唑煙酸對(duì)谷子種子萌發(fā)的影響

由表1可知，用不同濃度的甲咪唑煙酸噴施抗性材料‘安5158’和敏感性材料‘豫谷9號(hào)’種子，發(fā)芽率和存活率受抑制程度不同。抗性材料‘安5158’處理濃度為450 mL/hm2時(shí)，發(fā)芽率受顯著抑制，存活率為14%，處理濃度為500 mL/hm2時(shí)，發(fā)芽率7%，沒有存活的植株。在150 mL/hm2濃度下，敏感材料‘豫谷9號(hào)’發(fā)芽率和存活率大幅度降低；濃度為250 mL/hm2時(shí)，種子發(fā)芽后完全不能存活。由此可知，咪唑啉酮除草劑對(duì)谷子種子的萌發(fā)有一定的抑制作用，但抗性材料的種子發(fā)芽率和發(fā)芽后存活率受抑制作用影響較小。

2.2 不同濃度咪唑啉酮對(duì)谷子葉片生理指標(biāo)的影響

由圖1中可知，噴施甲咪唑煙酸后，隨著噴藥時(shí)間的延長及甲咪唑煙酸處理濃度的逐漸增加，抗性和敏感性材料的SOD活性均呈下降趨勢。敏感性材料‘豫谷9號(hào)’，噴藥后1天SOD活性下降幅度較小，與對(duì)照處理相比無顯著差異；噴藥后4天和7天SOD活性大幅下降，與對(duì)照差異顯著，尤其噴施第7天在250 mL/hm2濃度下SOD活性的下降幅度最大?？剐圆牧稀?158’，隨著噴藥處理時(shí)間延長，SOD活性呈逐漸降低，以450 mL/hm2濃度下SOD活性下降明顯。結(jié)果表明，抗性材料的SOD活性比較穩(wěn)定，敏感性材料的SOD活性更易受除草劑影響。

圖1 不同濃度咪唑啉酮對(duì)谷子葉片SOD活性的影響

由圖2可知，噴施甲咪唑煙酸后，隨著噴藥時(shí)間的延長及甲咪唑煙酸處理濃度的增加，抗性材料‘安5158’和敏感性材料‘豫谷9號(hào)’的POD活性均呈下降趨勢，敏感性材料的POD活性下降幅度更為明顯。噴施甲咪唑煙酸后1天，抗性和敏感性材料的POD活性與對(duì)照相比均無顯著差異。噴藥后4天，敏感性材料‘豫谷9號(hào)’在250 mL/hm2濃度下POD活性與對(duì)照處理呈顯著差異；而抗性材料‘安5158’噴藥第7天在350 mL/hm2濃度下POD活性開始下降，450 mL/hm2濃度下POD活性急劇下降，與對(duì)照相比達(dá)到顯著水平。

圖2 不同濃度咪唑啉酮對(duì)谷子葉片POD活性的影響

由圖3可知，噴施甲咪唑煙酸后，隨著噴藥時(shí)間的延長及甲咪唑煙酸處理濃度的增加，抗性和敏感性材料的CAT活性均呈下降趨勢。噴藥后1天，抗性材料‘安5158’和敏感性材料‘豫谷9號(hào)’的CAT活性與對(duì)照相比均無顯著差異。噴藥后4天，抗性材料‘安5158’在250 mL/hm2濃度下CAT活性與對(duì)照相比下降了11.4%，達(dá)差異顯著水平，在250～350 mL/hm2濃度下CAT活性下降水平分別為40%和76.3%。噴藥后7天，敏感性材料‘豫谷9號(hào)’分別在450 mL/hm2和500 mL/hm2濃度下CAT活性與對(duì)照處理呈顯著差異(P＜0.05)。

圖3 不同濃度咪唑啉酮對(duì)谷子葉片CAT活性的影響

結(jié)果表明，抗性材料‘安5158’的CAT活性降低幅度明顯小于敏感性材料‘豫谷9號(hào)’，說明抗性材料‘安5158’CAT活性更為穩(wěn)定，化解甲咪唑煙酸脅迫的能力更強(qiáng)。

從圖4可看出，隨著甲咪唑煙酸處理濃度的增加，抗性材料‘安5158’和敏感性材料‘豫谷9號(hào)’的MDA活性均呈上升趨勢。且對(duì)于抗性材料‘安5158’，噴藥第7天的450 mL/hm2的MDA活性急劇上升，與對(duì)照之間差異顯著，而敏感材料‘豫谷9號(hào)’在第4天和第7天的250 mL/hm2MDA活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于第1天，尤其是隨著處理濃度的增加，升高幅度也急劇增大。說明敏感材料‘豫谷9號(hào)’的MDA活性對(duì)除草劑處理更加敏感。

圖4 不同濃度咪唑啉酮對(duì)谷子葉片MDA活性的影響

2.3 谷子抗性遺傳基礎(chǔ)鑒定

在對(duì)抗性材料‘安5158’及敏感性材料‘豫谷9號(hào)’噴施咪唑啉酮除草劑15天后，觀察材料抗性效果反應(yīng)。結(jié)果顯示，抗性材料‘安5158’無藥害反應(yīng)，敏感材料‘豫谷9號(hào)’5天左右表現(xiàn)出谷子幼苗心葉開始發(fā)黃，然后整株變黃，最后干枯死亡，BC1群體表現(xiàn)出50%左右的死亡率（圖5），經(jīng)卡方檢驗(yàn)，符合回交群體1:1的孟德爾遺傳比例，驗(yàn)證了前人屬于單基因遺傳的結(jié)論（表2）。

表2 抗性和敏感材料噴施甲咪唑煙酸后的調(diào)查結(jié)果

圖5 抗性和敏感親本及BC1群體噴施甲咪唑煙酸后15天的生長狀態(tài)

2.4 谷子抗咪唑啉酮敏感性基因初定位

通過構(gòu)建F2:3家系抗、感池，及噴施除草劑前、噴施除草劑后的混池，進(jìn)行BSR-Seq分析，共得到79521個(gè)關(guān)聯(lián)SNP，其中位于谷子1號(hào)染色體上的SNP有929個(gè)，占比15.06%，噴施除草劑前抗、感池中共得到930個(gè)關(guān)聯(lián)SNP，其中位于谷子1號(hào)染色體上的SNP有537個(gè)，占比57.74%，噴施除草劑后抗、感池中共得到1243個(gè)關(guān)聯(lián)SNP，其中位于谷子1號(hào)染色體上的SNP有640個(gè)，占比51.49%（圖6）?？芍?，與甲醚煙酸抗性相關(guān)的SNP位點(diǎn)富集在1號(hào)染色體短臂上。結(jié)合滑動(dòng)窗口法將對(duì)甲咪唑煙酸敏感性基因初步定位在第1染色體短臂上6.8～30.8 Mb之間，區(qū)間大小為24 Mb（圖7）。通過對(duì)差異表達(dá)基因做進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)噴施除草劑前后共鑒定出132個(gè)差異表達(dá)基因，其中有9個(gè)基因位于初定位區(qū)間內(nèi)。

圖6 咪唑啉酮抗性基因相關(guān)的SNPs位點(diǎn)在染色體上的分布

圖7 利用BSR-seq分析谷子與甲醚煙酸抗性相關(guān)基因的定位

3 討論

農(nóng)作物能夠進(jìn)行正常生長發(fā)育的前提要素是保證種子可以萌發(fā)，萌發(fā)期也是對(duì)外界環(huán)境的變化最為敏感的生育時(shí)期。除草劑的不規(guī)范使用劑量可以造成除草劑在土壤中的殘留，對(duì)種子的萌發(fā)會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。王倩等[16]對(duì)241份甘藍(lán)型油菜種子進(jìn)行25 mg/kg苯磺隆處理，綜合分析得出，25 mg/kg苯磺隆處理后，油菜種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率較對(duì)照處理分別降低6.81%和5.37%，對(duì)種子萌發(fā)產(chǎn)生了抑制作用。本研究從谷子種子萌發(fā)和幼苗生長的角度對(duì)谷子抗性和敏感品種進(jìn)行抗性鑒定。結(jié)果表明，不同濃度的除草劑處理對(duì)抗性和敏感性谷子發(fā)芽率、存活率和株高的抑制程度明顯不同?？剐圆牧显诎踩珓┝?250～450 mL/hm2)范圍內(nèi)，各種鑒定指標(biāo)基本正常；隨除草劑濃度的增加，抗性材料受藥害程度明顯加重，當(dāng)除草劑濃度超過450 mL/hm2時(shí)，對(duì)抗性材料產(chǎn)生致死性的傷害。敏感性材料對(duì)除草劑的反應(yīng)更為敏感，低劑量(＞150 mL/hm2)的除草劑就可對(duì)其造成致死性的損傷，本研究與韓玉軍等[17]研究發(fā)現(xiàn)的不同濃度乙草胺對(duì)玉米種子萌發(fā)產(chǎn)生抑制作用的結(jié)論相似。

對(duì)于農(nóng)作物而言，噴施除草劑也是一種逆境脅迫，這種非生物脅迫可以達(dá)到防控雜草的目的，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致作物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)發(fā)生相應(yīng)的應(yīng)激響應(yīng)。張麗光等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在噴施除草劑芐嘧磺隆的初期，隨著芐嘧磺隆濃度的逐漸增加，谷子幼苗葉片中MDA含量呈逐漸增加趨勢，且噴施除草劑初期，谷子葉片中MDA含量的變化趨勢較后期更明顯。徐田軍等[19]對(duì)玉米噴施2種除草劑的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，隨著2,4-D-丁酯和煙嘧磺隆濃度的增加，4個(gè)玉米葉片中SOD和CAT活性呈降低趨勢，而MDA含量呈增加趨勢。本研究結(jié)果表明，葉片噴施不同濃度除草劑后，抗性材料‘安5158’和敏感性材料‘豫谷9號(hào)’谷子葉片中保護(hù)性酶（CAT、SOD和POD）活性均不同程度下降，而MDA含量則顯著升高，表明噴施除草劑的濃度過高會(huì)導(dǎo)致谷子葉片中活性氧物質(zhì)的大量積累，進(jìn)而導(dǎo)致葉片中保護(hù)酶活性下降。同時(shí)，2種不同抗性材料比較，抗性材料的各個(gè)生理指標(biāo)的變化趨勢平穩(wěn)，而敏感性谷子葉片中活性氧代謝指標(biāo)變化趨勢明顯，表明抗性材料對(duì)除草劑具有較強(qiáng)抗性。

本試驗(yàn)所使用的咪唑啉酮類除草劑（甲咪唑煙酸）有效成分濃度為240 g/L（水劑），實(shí)際田間抗性效應(yīng)鑒定劑量為250 mL/hm2，與李小童等[20]研究抗咪唑啉酮油菜對(duì)選擇性除草劑的抗性效應(yīng)的最低有效劑量一致。在對(duì)抗性材料‘安5158’及敏感性材料‘豫谷9號(hào)’噴施咪唑啉酮除草劑15天后，觀察材料抗性效果反應(yīng)。結(jié)果顯示，選育出的抗性材料‘安5158’無藥害反應(yīng)，對(duì)照親本表現(xiàn)出谷子5天左右幼苗心葉開始發(fā)黃，然后逐漸變黃，最后整株死亡。擬南芥的ALS酶中與苯磺隆和咪唑啉酮除草劑結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)研究顯示，苯磺隆和咪唑啉酮都是通過阻斷ALS底物通道方式抑制ALS活性的[21-22]。

通過抗性和敏感性谷子材料表型進(jìn)行鑒定，表明其正反交F1代對(duì)除草劑敏感性表現(xiàn)一致，認(rèn)為該敏感性基因?qū)儆诩?xì)胞核遺傳；對(duì)群體進(jìn)行敏感性鑒定，結(jié)果出現(xiàn)抗:敏感分離比例為1:1，符合孟德爾遺傳，說明該敏感性基因受單個(gè)隱性基因控制。利用常規(guī)的雜交和回交等育種手段，可以很方便地將抗咪唑啉酮除草劑基因轉(zhuǎn)移到其他油菜品系，培育抗咪唑啉酮除草劑的新品種。而且，用抗咪唑啉酮品種做父本配制雜交種，F(xiàn)1仍表現(xiàn)出咪唑啉酮抗性，雜交種施用除草劑1次即可去除假雜種和雜草，獲得整齊一致的雜種群體，有利于雜種純度鑒定和提高雜種的產(chǎn)量與品質(zhì)。

采用第二代測序平臺(tái)進(jìn)行RNA-Seq高通量測序，通過收集、比對(duì)與分析在除草劑莖葉處理?xiàng)l件對(duì)谷子葉片中的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)，高通量的分離和篩選差異表達(dá)基因，將該除草劑抗性基因定位于谷子第1染色體短臂6.8～30.8 Mb區(qū)間內(nèi)，該區(qū)間有9個(gè)基因差異表達(dá)，初步推定為抗咪唑啉酮的候選基因，為抗咪唑啉酮基因的精細(xì)定位提供參考。

4 結(jié)論

隨著甲咪唑煙酸濃度的逐漸增加，抗性和敏感型谷子材料的發(fā)芽率和存活率均呈顯著下降趨勢，且敏感型谷子種子萌發(fā)的致死濃度要低于抗性谷子材料。同時(shí)，抗性材料在安全劑量(250～450 mL/hm2)范圍內(nèi)，各種鑒定指標(biāo)基本正常；隨除草劑濃度的增加，抗性材料受藥害程度明顯加重，當(dāng)除草劑濃度超過450 mL/hm2時(shí)，對(duì)抗性材料產(chǎn)生致死性的傷害。敏感性材料對(duì)除草劑的反應(yīng)更為敏感，低劑量(＞150 mL/hm2)的除草劑就可對(duì)其造成致死性的損傷，通過群體敏感性鑒定得知，敏感性基因受隱性基因控制，且將抗性基因初步定位在谷子的第1號(hào)染色體短臂6.8～30.8 Mb區(qū)間內(nèi)，該區(qū)間有9個(gè)基因差異表達(dá)，推斷為候選基因。